داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

Summary

نحن تصف طريقة لكثافة العضيات منفصلة في العيش ذبابة الفاكهة الأجنة. هي جزء لا يتجزأ الأجنة في آغار وطرد. هذه التقنية غلة استنساخه فصل العضيات الرئيسية على طول المحور الأمامي الخلفي الجنين. هذه الطريقة تسهل التجارب colocalization والغلة الكسور عضية البيوكيميائية للتحليل والتجارب الزرع.

Abstract

استراتيجية كبرى لتنقية وعزل أنواع مختلفة من الخلايا والعضيات لفصلها عن بعضها البعض على أساس الاختلافات في كثافة مرتفعة. ومع ذلك ، عندما تتعطل الخلايا السابقة للبروتينات ، والعضيات الطرد المركزي في هذه البيئة غير الأصلية في كثير من الأحيان بشكل غير لائق عصا لبعضها البعض. نحن هنا وصف الأسلوب لالعضيات منفصلة في كثافة سليمة ، وأجنة ذبابة الفاكهة المعيشة. ويتم حصاد الأجنة في وقت مبكر قبل cellularization من الأقفاص السكان ، وتتم إزالة قواقعها البيض الخارجي عن طريق العلاج مع التبييض 50 ٪. ثم يتم نقل الأجنة إلى لوحة آغار الصغيرة وإدراجها في نهاية الخلفي الأولى ، إلى ثقوب صغيرة في رأسي آغار. وطرد لوحات تحتوي على أجنة مضمن لمدة 30 دقيقة في 3000g. وأغار يدعم الأجنة ويبقيهم في اتجاه محدد. بعد ذلك ، يتم حفرها الأجنة من آغار بإبرة حادة.

الطرد المركزي يفصل العضيات الرئيسية في طبقات متميزة ، وهي الطبقات مرئية بسهولة عن طريق الحقل المجهري مشرق. وهناك عدد من علامات الفلورسنت متاحة لتأكيد نجاح الطبقية في الأجنة الحية. وسيتم إثراء البروتينات المرتبطة عضيات معينة في طبقة معينة ، مما يدل colocalization. يمكن استرداد طبقات الفردية للتحليل أو البيوكيميائية في زرع البيض المانحة. هذه التقنية قابلة للتطبيق لفصل عضية في الخلايا الكبيرة الأخرى ، بما في ذلك البيض والبويضات من الأنواع المختلفة.

Protocol

1) إعداد لوحات أجار

نظرة عامة : يعمل هذا البروتوكول لمدة سنتين لوحات أجار يستخدم متميزة. أولا ، لوحات أجار بمثابة سطح جمع البيض ، عصير التفاح في آغار يحفز وضع البيض. الثانية ، تقام الأجنة المضمنة في أجار في اتجاه ثابت عندما طرد لوحات ؛ تركيز عال بما فيه الكفاية من آغار ضروري للحيلولة دون لوحات من التفكك خلال الطرد المركزي. للتبسيط ، ويعمل نوع واحد من عصير التفاح أغار لكل من الاستخدامات.

المواد

• آغار (25 ز)
• السكروز (25 ز)
• عصير التفاح (250 مل)
• Nipagin محلول المخزون M (5 ز الميثيل ف هيدروكسي بنزوات في الإيثانول مل 50) ، بمثابة حافظة
• أطباق بتري : الطرد المركزي (60x15mm) ، وجمع البيض (60x15 100x15 ملم أو ملم ، اعتمادا على أقفاص الطيران المستخدمة في الخطوة 2)

معدات

• صفيحة ساخنة
• اثنين من قوارير مخروطي

1. في دورق مخروطي ، والجمع بين 25 و 750 غرام آغار مل درهم O. ₂ الأوتوكلاف لمدة 50 دقيقة في دورة السائل. في الوقت نفسه ، وإعداد عصير التفاح الحل (الخطوة 1.2).
2. في آخر دورق مخروطي ، والجمع بين 25 و 250 غرام السكروز مل من عصير التفاح. الحرارة على طبق ساخن (لحوالي 55 درجة مئوية) ليحل السكروز. ثم يضاف 15 مل حل M Nipagin. تجنب ارتفاع درجات الحرارة ، لأنها سوف تسبب Nipagin لكسر.
3. مرة واحدة في حل آغار قد بردت يكفي أنه يمكن التعامل مع القارورة باليد ، والجمع بين الحلين وتخلط جيدا. ضجة على لوحة الساخن حتى تمتزج بشكل متساو.
4. من أجل الحل في أطباق بتري (~ 0،5 سنتيمترا). 1 لتر من محلول ما يكفي لحوالي 100 صغير (60 مم) أو 40 كبير (100 مم) الأطباق.
5. لوحات أجار ينبغي الجاف لعدة ساعات خلال الليل أو في درجة حرارة الغرفة ، وإلا فإنها ستكون رطبة جدا للاستخدام. للتخزين الطويل الأجل ، والاحتفاظ بها ملفوفة (في صناديق بلاستيكية أو الأكمام طبق بيتري) في 4 درجات مئوية.

حصاد الأجنة 2)

نظرة عامة : خلال 3 ساعات الأولى من التنمية (في درجة حرارة الغرفة) والأجنة هي خلايا ذبابة الفاكهة واحد (لا عد السلائف الجرثومية سطر ، وخلايا القطب يقع خلفي). عندما يتم طرد الأجنة موجهة بشكل صحيح من هذه المراحل ، والعضيات رئيسية منفصلة الكثافة على طول المحور الطويل للبويضة. في المرحلة cellularization ، يتم تحويل هذه الخلية واحدة كبيرة في آلاف من الخلايا الصغيرة ؛ قوات الطرد المركزي المستخدمة ولن تمزق هذه الخلايا. لفصل العضيات نجاح كبير ، ولذلك فمن الأهمية بمكان أن أجهزة الطرد المركزي الأجنة التي لم تكتمل بعد cellularization.

المواد

• عصير التفاح لوحات أجار
• لصق الخميرة (خميرة جافة مختلطة مع الماء لزبدة الفول السوداني الاتساق)

معدات

• يطير أقفاص : متوفرة تجاريا (أنظر أدناه) ، أو محلية الصنع ¹

1. يتم الاحتفاظ الذباب الكبار في الأقفاص التي وحات عصير التفاح أغار تلصق في القاع. استخدام أطباق بتري حجم المناسبة لأقفاص في الاستخدام.
2. الشروع في جمع البيض ، وإعداد عصير التفاح الطازج طبق آغار وتغطية جزء مع لصق الخميرة. ذباب الفاكهة تأكل الخميرة وعلى وجه الخصوص ، والخميرة ويوفر التغذية لإنتاج البيض. وجود الخميرة وعصير التفاح في آغار يدفع أيضا وضع البيض.
3. لتبادل القديمة مع لوحة جديدة آغار ، هو مقلوب القفص الطيران وخبطت في أعلى المقعد عدة مرات. سوف يطير سقوط إلى أسفل ومشوشا لفترة وجيزة. التي تمنحك بضع ثوان لإزالة بسرعة واحدة لوحة آغار واستبدالها بأخرى جديدة. هذا التبادل يأخذ بعض الممارسة ، وتفاصيل تعتمد على نوع من القفص العاملين.
4. الإناث تخزين الحيوانات المنوية الذباب من التزاوج الداخلي السابق في الحقائب (spermathecae) ​​من الحيوانات المنوية التي يتم تحريرها للسماح للإخصاب البيض. عندما تضع الإناث تغذية جيدة ودون عائق والبيض بعد فترة قصيرة من الإخصاب ، وبالتالي فإن الوقت من علامات وضع البيض في وقت الإخصاب وبداية التنمية. عندما لا تكون الظروف المثلى ، عقد الإناث البيض المخصب لمرات قبل وضع متغير. لتقليل عدد هذه الأجنة سوء نظموا ، فإنه من المستحسن أن يتخلص من المجموعة الأولى من يوم العمل (أ "قبل مجموعة" من 30 الى 60 دقيقة كافية). وجود الخميرة الطازجة الحث على الإناث لوضع هذه البويضات التي عقدت ، ومجموعات البيض تميل الى أن تكون لاحقة يهيمن عليها البيض تودع بعد وقت قصير من الإخصاب.
5. جمع البيض لمدة تصل إلى 3 ساعات ، اعتمادا على أي هو المطلوب المرحلة الجنينية. منذ cellularization في درجة حرارة الغرفة بعد الانتهاء من ساعات 3.5 ~ ، أوقات أطول جمع ليست مفيدة. ويتحقق الطبقات الأكثر اتساقا في الأجنة الشباب ، وذلك لتجارب روتينية نحبذ أقصر الأوقات جمع (1 ساعةأو أقل).
6. أحيانا تتعثر الذباب على الخميرة أو على سطح لوحة آغار. إزالتها مع ملاقط.

3) إزالة قشرة البيضة من الأجنة

نظرة عامة : يتم تغطية أجنة ذبابة الفاكهة من قبل اثنين من طبقات واقية : طبقة خارجية (المشيماء) مصنوعة من البروتين ، وطبقة داخلية (الغشاء المحي) مصنوعة من الشمع في الغالب. أنها تحمي الجنين ضد الشتائم الميكانيكية والجفاف. وفقد اثنين من ملحقات المشيماء (وشعيرات بيض أو الزوائد الظهرية) أن تكون مرئية بسهولة وهياكل مختلفة. في هذه الخطوة ، فإننا سوف إزالة المشيماء عن طريق نقع البيض في المبيض بنسبة 50 ٪. بمجرد إزالة المشيماء ، الجنين يصبح شفافا في ضوء المنقولة ، مما يتيح اختيار المراحل الجنينية محددة للالطرد المركزي. كما المشيماء سيتعارض أيضا مع إجراءات ما بعد الطرد المركزي كثيرة (على سبيل المثال ، التثبيت في الخطوة 6) ، وإزالة المشيماء سيسمح الآن معالجة سريعة في وقت لاحق.

فإن العلاج التبييض 50 ٪ حل المشيماء في غضون دقائق قليلة ، إلا أنه لا يؤذي الجنين. الغشاء المحي يحتفظ بها التبييض. وسوف نستمر في علاج التبييض حتى شعيرات بيض لم تعد مرئية. بعد ذلك ، وسوف نفصل في أجنة من مبيض بواسطة صب الطين جنين / التبييض من خلال غربال صغيرة (سلة مصنوعة من اسلاك). فمن الأهمية بمكان عدم التسرع في خطوة التعرض التبييض. إذا تم غسلها التبييض قبل الأوان ، ربما في وقت لاحق الخطوات (على سبيل المثال ، وإزالة التثبيت الغشاء المحي التالية) يجوز المساس بها.

المواد :

• بخ زجاجة مع التبييض 50 ٪ (مجلد واحد درهم ₂ O لتبييض حجم تجاري واحد)
• بخ زجاجة مع DH ₂ O
• ورقة منشفة

المعدات :

• أدلى سلال سلكية محلية الصنع من صفائح من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة سلكية. لصنع السلال ، وقطع مربعات ~ 2 × 2 سم من ورقة مسطحة ، والمسافة البادئة منهم في وسطها.
• ملاقط لعقد سلال الأسلاك
• مجهر تشريح التي أنشئت من أجل تضوء

1. مكان لوحة آغار تشريح تحت المجهر ومراقبة الأجنة تضوء. تأكد من تحديد الخيوط البيض (انظر الشكل 2A).
2. بخ التبييض 50 ٪ على طبق آغار ، الذي يغطي الأجنة. تستنهض الهمم لوحة أغار أحيانا إلى دوامة الأجنة حولها في التبييض.
3. مرة واحدة في شعيرات بيض لم تعد مرئية (عادة بعد 3-5 دقائق ، ولكن الأوقات قد تختلف) ، تمت إزالة المشيماء بنجاح.
4. في الخطوة التالية ، سيتم استخدام سلة سلكية وغربال لفصل أجنة من مبيض. الاستيلاء على سلة الأسلاك مع ملاقط وأنه عقد أكثر من غطاء لوحة المقلوب آغار. وسوف تكون بمثابة غطاء خزان للقبض على التبييض يقطر من خلال شبكة سلكية.
5. صب المزيج التبييض / الجنين من خلال لوحة آغار سلكية.
6. إذا كان عدد كبير من الأجنة لا تزال على لوحة آغار ، بخ درهم ₂ O على طبق وتسكب الطين درهم O ₂ / الجنين من خلال شبكة سلكية. إذا كان عدد كبير من الأجنة يمتد الى الخزان ، صب محتويات الخزان من خلال شبكة سلكية.
7. لمس الجزء السفلي من اسلاك لمنشفة ورقية لطخة من أي السائل الزائد. ثم بخ درهم ₂ O على شبكة الأسلاك لشطف التبييض المتبقية. كما هو موضح أعلاه ، يمكن استخدام لوحة غطاء الخزان كما لاسترداد أي أجنة غسلها انفجرت بطريق الخطأ. يمكنك تقليل فقدان الأجنة عن طريق الإشارة إلى تيار من الماء من زجاجة بخ على طول محيط سلة الأسلاك. وصمة عار في كثير من الأحيان خارج السائل الزائد.
8. كرر هذه الخطوة غسل 5-10 مرات ، حتى تمت إزالة جميع مواد التبييض. إذا سلك سلة الروائح لا تزال التبييض ، يجب غسل متابعة.

4) التركيب الأجنة في أجار

نظرة عامة : ذبابة الفاكهة البيض أطول بكثير (~ 500 ميكرون) مما اسعة (~ 180 ميكرون). للحصول على أقصى قدر من الانفصال وثابت من العضيات أثناء الطرد المركزي ، ونحن أجنة توجيه مثل هذه وجهة نظرهم أن ينتهي الأمامي نحو مركز الدوران (الشكل 1 ، 3). بهذه الطريقة ، وهياكل أخف جواني (قطيرات الدهن) تتراكم في نهاية الأمامية في جميع الأجنة ، في حين أن الهياكل كثيفة جدا (المكونات صفار) تتراكم قرب نهاية الخلفي. تندس الأجنة في ثقوب صغيرة في رأسي آغار عصير التفاح ، مع نهايات الأمامي الشائكة يصل. وأغار يحتفظ الجنين في اتجاه ثابت خلال الطرد المركزي.

المعدات :

• حامل إبرة
• الإبر التنغستن ، هي التي شنت هذه الإبر في حامل من التوجه الى الوراء نموذجي ، بحيث نهاية حادة وعصي من تتوفر لمعالجة الأجنة
• P200 pipettor
• مجهر تشريح التي أنشئت من أجل transilluminatioن
• يطير فرشاة (فرشاة الدهان الصغيرة المستخدمة لفرز الكبار ذبابة الفاكهة)

المواد :

• تريتون محلول ملحي (TSS) : 4G كلوريد الصوديوم ، 0.3 لتر تريتون X - 100 ، مع ملء DDH ₂ O إلى مل 1000 (ويمكن إجراء كحل الأسهم 10X)

1. غسل الأجنة من سلة الأسلاك مع خدمات الدعم التقني والى طبق بيتري فارغة. ينبغي للأجنة تنزل الى القاع. نقل طبق بتري الذي يحتوي على الأجنة في خدمات الدعم التقني على نطاق وتشريح ومراقبة من قبل تضوء (أجنة سوف تبدو مشابهة لتلك التي صورت في الشكل 4).
2. باستخدام pipettor P200 ، حدد الأجنة في المراحل المطلوبة ونقلها إلى لوحة آغار الصغيرة. ويمكن بسهولة مراحل محددة يمكن التعرف بصريا (الشكل 4 ؛ لمزيد من التفاصيل ، انظر : ^1). العمل بسرعة منذ الأجنة الشيخوخة وغمر طويلة (أطول من 30 دقيقة) في خدمات الدعم التقني قد تؤثر على التنمية.
3. إزالة معظم خدمات الدعم التقني مع ماصة وKimwipe ملف. وينبغي على سطح آغار تكون رطبة قليلا مما يجعل من الاسهل لدفع الأجنة حولها. ومع ذلك ، ينبغي أن لا تكون هناك برك من السائل المتبقي في أي مكان على صفيحة منذ السائل الزائد خلال الطرد المركزي يؤدي إلى أجنة الشريحة من الثقوب.
4. باستخدام إبرة ، كزة فتحات رأسية في آغار أينما يقع بالقرب من جنين. فمن الصعب أن كزة الثقوب التي عمودي تماما لأنه لديك لعقد إبرة في زاوية ليكون قادرا على مشاهدة في وقت واحد تحت المجهر. ألف ميل بسيط من الإبرة هو فعلا مفيد لأن هذا يخلق الاكتئاب الطفيف / البستان على جانب واحد من الحفرة بحيث الجنين سوف تنزلق بسهولة على طول وذلك في حفرة. يكفي ثقب السطح منذ أغار أغار لينة بما فيه الكفاية والتي تم إدخالها جزئيا مرة الجنين في حفرة ويمكن دفعها في مزيد من دون أضرار.
5. تأكد من التعرف على تاريخ الأمامي والخلفي من أجنة ، كما يجب دفع الأجنة في الثقوب في اتجاه ثابت ، وعادة مع نهاية الأمامي حتى. يتميز الغشاء المحي في نهاية الأمامي من هيكل المتخصصة ، وmicropyle (الشكل 2) ، والتي من خلالها يدخل الحيوان المنوي أثناء عملية الإخصاب.
6. به نهاية حادة من الإبرة ، يمكنك دفع الجنين ضد لتحريكه على طول آغار وتوجيه / مناورة نهايته الخلفي نحو حفرة ثقبت. ثم دفع ضد نهاية الأمامي نحو الحفرة. هذا ينبغي أن تنزلق بسهولة الجنين في حفرة على طول اكتئاب طفيف ولدت خلال ثقب. كما الجنين حتى يميل ، ادفعه أعمق الأعماق في حفرة.
7. عندما دفعت نحو كامل ، في الجنين عادة ما يكون بالفعل العمودي إلى حد ما. إذا لم يكن كذلك ، يمكنك محاذاة الجنين إدراج أكثر عموديا عن طريق دفع على ذلك خرج عن. إذا كان الثقب ليس كبيرا جدا ، وسوف يكون موقف ثابت الجنين الذي عقد قبل أغار طوال الطرد المركزي.
8. مع الممارسة ، فمن الممكن لتضمين 100-250 الأجنة في لوحة. الامر يتوقف على كيفية تطبيق معين العديد اللازمة لما يلي : إذا تم استخدام الأجنة للتصوير الحية أو الجهات المانحة للتجارب لزراعة الأعضاء ، هناك حاجة قليلة فقط. إذا الأجنة أن تكون ثابتة وimmunostained ، سيتم فقدان جزء بسيط أثناء معالجة ما بعد الطرد المركزي ، وعلى المرء أن يبدأ مع ارتفاع الأرقام. نضع في اعتبارنا أن الأجنة خلال الاستمرار في تطوير تصاعد حتى إذا هو المطلوب مرحلة التنمية الضيقة ، لتظل الوقت الكلي للاحتياجات المتزايدة قصيرة.
9. إذا كان هناك أي بقايا الأجنة التي لم تكن جزءا لا يتجزأ ، بإزالتها من لوحة بفرشاة مبللة يطير. تراجع الفرشاة تطير في السائل (1xTSS على سبيل المثال) ، امسح بعناية عبر الجزء العلوي من لوحة (في حين يراقب ضمن نطاق تشريح) لدخول أي بقايا الأجنة ، ويغسل أجنة من أصل الفرشاة التي غمس الفرشاة في السائل مرة أخرى.

5) الطرد المركزي والتعافي من الأجنة

نظرة عامة : أن يتم نقل لوحات لمجموعات يتأرجح من Sorvall RT7 بلاس وطرد الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 4000 دورة في الدقيقة ، وهو ما يعادل 3000 غرام ~ بعد الطرد المركزي ، وتغطي لوحات مع خدمات الدعم التقني. بإبرة ، يتم حفرها أجنة من ثقوب في آغار ونقلها إلى السفن المناسبة عبر pipettor.

المعدات :

• إبرة مع حامل الإبرة (كما في السابق)
• Sorvall RT7 Plus مع RTH750 الدوار والدلاء يتأرجح ، أو ما يعادل ²
• مجهر تشريح التي أنشئت من أجل تضوء
• P200 pipettor

المواد :

• TSS

1. نقل لوحات لمجموعات يتأرجح من جانب آغار الطرد المركزي ، لأسفل. تأكد متوازنة الطرد المركزي.
2. ضبط الطرد المركزي : درجة الحرارة = 40-10 درجة مئوية ، ودورة في الدقيقة = 4000 ، الساعة = 30 دقيقة.
3. بعد الطرد المركزي ، ومكان لوحة آغار تشريح تحت المجهر مرة أخرى ، وتغطية لوحة بطبقة من خدمات الدعم التقني.
4. باستخدام بلونت من نهاية الإبرة ، وحفر الأجنة من جحورهم. سوف تطفو في خدمات الدعم التقني ، ولكن ستبقى المغمورة.
5. سوف تظهر الطبقات أجنة من الواضح ، مع غطاء البني في نهاية الأمامية ، وهي منطقة وسط واضحة ، والظلام ، والمنطقة الرمادية في نهاية الخلفي (الشكل 2 ، 5A). تجاهل الأجنة التي تفشل في إظهار طبقات متميزة.
6. باستخدام pipettor P200 ، ونقل الأجنة كذلك الطبقات في خدمات الدعم التقني لسفينة جديدة ، مثل قنينة التلألؤ أو أنبوب microcentrifuge ، اعتمادا على التطبيق.

6) مزيد من المعالجة

اعتمادا على الطلب ، في وقت لاحق الأجنة في معاملته بطرق مختلفة.

1. للمراقبة المباشرة من جانب مشرق المجهري الميدان أو epifluorescence ، يتم نقل الأجنة في عازلة لشريحة زجاجية ، والتي شنت تحت 22x22 ملم # 1.5 ساترة ، مع 18x18 ملم # 1 coverslips والفواصل. على المدى الطويل الملاحظات ، قد يكون من الضروري لاستبدال النفط العازلة مع الهالوكربون 27.
2. إذا الأجنة أن تكون ثابتة ، ينبغي نقلهم إلى 5.6 في الخطوة قارورة التلألؤ. ثم يمكن أن تكون ثابتة باستخدام تقنيات التثبيت القياسية ^1. عادة ما توظف هذه التقنيات في التحريض مستحلب هيبتان الميثانول إلى إزالة الغشاء المحي. علما بأن لأجنة طرد كفاءة هذه الخطوة devitellinization منخفضة. ولذلك فمن المستحسن أن تبدأ مع أجنة ما يصل الى عملية أو لإزالة الغشاء المحي يدويا ^1.
3. إذا كان سيتم استخدام الأجنة في التجارب زرع (على سبيل المثال ، لإزالة طبقة معينة من العضية طرد الأجنة) ، يتم تحويلها إلى لوحات أجار والتي شنت على coverslips ، وذلك باستخدام إجراءات موحدة بالنسبة للأجنة uncentrifuged ^3. في طبقات الناجم عن الطرد المركزي هي مستقرة لعشرات من الدقائق.

7) الممثل النتائج

إذا كان الطرد المركزي تعمل كما هو متوقع ، فإن العضيات الرئيسية الجنينية فرز بها الكثافة ^2. على سبيل المثال ، فإن قطرات الدهون منخفضة الكثافة تتراكم في نهاية الأمامي ، وعالي الكثافة حويصلات صفار سوف تتراكم في نهاية الخلفي (الشكل 1 ، 2). قطرات الدهون والحويصلات صفار هي العضيات لتخزين الدهون والبروتينات ل.

ويتحقق تأكيد الكثافة التي تعتمد على التكوين الطبقي من خلال الفحص البصري من الأجنة الحية التي تضوء تحت المجهر تشريح أو المجمع. ينبغي أن تبدو وكأنها أجنة في الشكل 5A : قطرات الدهون وسوف تشكل طبقة صلبة بني على الحافة الأمامية للغاية (أ "سقف الدهون") ؛ صفار تراكم سيؤدي في منطقة رمادية داكنة في نهاية الخلفي. يتم فصل هاتين الطبقتين منطقة مظلمة من قبل واضحة واسع على أن يمثل العضيات الأخرى والسيتوبلازم. إذا تم طرد الأجنة بعد cellularization ، وسوف يكون الحد الأدنى من طبقات (الشكل 5C).

إذا كان متوفرا epifluorescence المجهر ، ويمكن دراسة هذه المعيشة ، وطرد الأجنة الإثارة تحت الأشعة فوق البنفسجية. في ظل هذه الظروف ، وصفار يعرض تألق ذاتي الزرقاء المكثفة (الشكل 5B). وهناك طبقة من المواد المدمجة autofluorescent في القطب الخلفي يشير الطرد المركزي الناجح ويخدم كمؤشر لنهاية الخلفي.

علما أن ظهور هذه الطبقات ستتغير بشكل جذري إذا تم إصلاحها الأجنة. على سبيل المثال ، عندما يتم إصلاحها من الأجنة التثبيت للحرارة أو الفورمالديهايد القياسية تليها هيبتان الميثانول devitellinization - ¹ ، قطرات الدهون تصبح شفافة وطبقة الدهون تظهر بيضاء ورقيق بواسطة الضوء الساطع المجهري ، بدلا من البني الداكن (الشكل 5D). ودمرت جزئيا أو كليا صفار تألق ذاتي من قبل التثبيت ، ليصبح أقل كثافة بكثير أو حتى غير قابلة للكشف.

إذا كان يعمل داخل الجسم الحي الطرد المركزي لأسلط الضوء على أحد عضية وجه الخصوص ، فمن المفيد أن التسمية التي عضية مع علامة نيون للتأكيد. على سبيل المثال ، والبروتينات الانصهار YFP تستهدف الميتوكوندريا ، وقد وصفت لائحة أو غولجي ^4. بالطرد المركزي في الأجنة ، وهذه علامات مميزة تتراكم في مواقع على طول المحور الأمامي الخلفي (الشكل 1). أخيرا ، وبعض البروتينات الانصهار هيستون توطين كل من قطرات الدهون ونوى ² ، وبالتالي يمكن استخدامها للاحتفال هذه المقصورات الخلوية (الشكل 5 E ، F) ، وكذلك لرصد مرحلة من مراحل الجنين (من قبل عدد من النوى المسمى) . سلالات ذبابة معربا عن علامات المذكورة في هذه الفقرة المتوفرة من مركز بلومينغتون الأسهم ذبابة الفاكهة (http://flystocks.bio.indiana.edu/). لH2Av هيستون ، سواء GFP وmRFP المتغيرات متوفرة ^{5 و 6}

الشكل 1. فصل العضيات بواسطة الطرد المركزي (بعد تعديلها ^2). الطرد المركزي لنتائج الأجنة في المنحى الطبقي متميزة(الضوء الساطع). العضيات تتراكم في مواقع رئيسية مميزة على طول الأمامي (متابعة) -- الخلفي (أسفل) المحور : قطرات الدهون (في الكشف عن الأجنة التي تحددها تلطيخ الاحمر النيل) ؛ شبكية هيولي باطني ، جولجي ، والميتوكوندريا (المكتشفة في الأجنة الحية عن طريق وصفها في علامات YFP النص الرئيسي) ؛ صفار (الكشف عنها بواسطة تألق ذاتي). تم الحصول على الصور التي مضان المجهري متحد البؤر.

الشكل 2. تصوير تخطيطي للأجنة.

ألف بيضة مع قشرة البيضة وشعيرات بيض بارزة (الزوائد الظهرية). كما قشرة البيضة ليست شفافة ، والبيض يظهر الظلام موحد.

باء البيض مع المشيماء إزالتها. في نهاية الأمامي (من اليسار) ، وmicropyle مرئيا. اعتمادا على مرحلة التطوير ، فإن الجنين داخل الغشاء المحي البني الداكن تظهر بشكل موحد أو إظهار هياكل مختلفة. انظر Figure4 للحصول على أمثلة.

جيم طرد الجنين ، كما هو الحال في المنحى البروتوكول الموصوفة هنا. قطرات الدهون تتراكم بأنه "غطاء" البني في نهاية micropyle ؛ صفار يشكل طبقة رمادية عند أو بالقرب من الطرف المقابل.

الشكل 3. وصف تخطيطي لهذا الإجراء. اليسار : توضع الأجنة دون المشيماء في أعلى لوحة آغار ودفعت مع إبرة في ثقوب في أجار. هذه النتائج المتصاعدة في اتجاه ثابت لجميع الأجنة ، مع الأمامي ينتهي. الحق : بعد الطرد المركزي ، والأجنة الطبقية. غير مضافين مع آغار TSS (الأزرق) ، ويتم استردادها من اجنة آغار مع الإبرة. علقت مرة واحدة في خدمات الدعم التقني ، يمكن أن تكون التقطت الأجنة حتى مع pipettor.

الشكل 4. برايت ضوء صور لأجنة ذبابة الفاكهة المعيشة ، على غرار الطريقة التي سوف تظهر في الخطوة 4.1. وترد الأجنة في اتجاه القياسية : نهاية الأمامي لهذه الغاية ، غادر الخلفي إلى اليمين ، حتى الجانب الظهري ، والجانب البطني أسفل. فيلم الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر لليتوفر كجزء من شريط الفيديو المصاحبة لهذا البروتوكول.

A. مرحلة الأجنة الشق البني تظهر بشكل موحد. مثل هذه المراحل هي مثالية لداخل الجسم الحي الطرد المركزي.

أجنة الأريمة باء لها حافة واضحة التي تظهر مماثلة على جميع الاطراف. هذا الهامش هو واضح ويرجع ذلك جزئيا إلى تراكم النوى في غشاء البلازما ويرجع ذلك جزئيا إلى النقل الداخلي لحويصلات قطرات الدهون وصفار ^7. هذا يوسع هامش اضحة حتى قرب نهاية cellularization ^1. يمكن أن الأجنة لا تزال مطبقة بنجاح بواسطة الطرد المركزي حتى نهاية cellularization ⁸ ، على الرغم من طبقات من صفار البيض ونوى غير متناسقة كما هو الحال في مراحل الانقسام.

جيم بعد cellularization والأجنة يبدو غير المتناظر ؛ الجانبين ظهري وبطني أصبحت متميزة ، وتطوير طيات مختلفة. الجنين هو موضح في الملحق الجرثومية الفرقة في وقت مبكر. في هذه المراحل ، الطرد المركزي لم يعد فعالا في تقسيمها على العضيات الرئيسية.

الشكل 5. طرد الأجنة. وطرد جميع الأجنة في هذا الرقم مع نهاية الأمامي يصل بهم وتظهر في هذا الاتجاه.

ألف الضوء الساطع صورة الجنين طرد بنجاح. طبقة اللون البني في نهاية الأمامي جدا بسبب تراكم الدهون ، الحبرية. وهناك طبقة واسعة الرمادي قرب نهاية الخلفي ومن المقرر أن صفار الحويصلات. كثيرا ما يكون هناك منطقة واضحة تحت طبقة الصفار ، وهو من أصل غير معروف. وغالبا ما تكون منطقة الصفرة واضحة فوق طبقة الصفار ، بل ربما يمثل الميتوكوندريا. وتوجد البروتينات القابلة للذوبان في جميع أنحاء طبقة واضحة بين قطرات الدهون وصفار البيض ^2.

باء الجنين في وعرضها من قبل تحت المجهر epifluorescence الإثارة الأشعة فوق البنفسجية. السمة الأزرق تألق ذاتي من صفار البيض يساعد على تحديد نهاية الخلفي.

جيم طرد الجنين خلال الجرثومية الفرقة التمديد ، أي بعد cellularization. قد لا تزال تتراكم في صفار نهاية الخلفي ، ولكن على خلاف ذلك هو الحد الأدنى طبقات.

دال الجنين طبقية بنجاح ، وبعد تثبيت الحرارة. طبقة الدهون ، يظهر القطيرات بيضاء ورقيق ، بدلا من البني الداكن كما في الأجنة غير المثبتة (A).

E. & F. الأجنة ، معربا عن His2Av GFP وتصوير بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (تعديل بعد ^2). E : طرد في مراحل الانقسام ؛ His2Av - GFP يظهر للاحتفال فقط طبقة الدهون - الحبرية منذ تتشكل نواة قليلة من قبل هذا الوقت. اعتمادا على المستوى البؤري ، قد تكون مرئية فقط نوى تحت طبقة الحبرية (لا يظهر هنا). F : طرد في المراحل الأريمة ؛ His2Av GFP - علامات على كل من طبقة الدهون - الحبرية (أعلى) والنوى (في منطقة واسعة تحت طبقة قطيرة).

Discussion

خطوات حاسمة

تأكد من أن تركيز آغار مرتفع بما يكفي ، وإذا كان منخفضا جدا ، سوف تتفكك آغار خلال الطرد المركزي ، وسوف تنفجر الأجنة أو تكون موجهة بشكل عشوائي. إذا كان تركيز أغار قليلا فقط منخفضة جدا أو إذا كان آغار الرطب (إزالة المجفف غير كاف أو غير كاف لخدمات الدعم التقني في خطوة تتجاوز 4.3) ، سوف تطفو على الأجنة من جحورهم خلال الطرد المركزي وتصبح موجهة بشكل غير صحيح. إذا تم سكب آغار رقيقة جدا ، فإنه سيتم أيضا انهيار أو الكراك خلال الطرد المركزي.

تأكد من أن الأجنة لم يتجاوز مراحل متقدمة cellularization ، وإلا سيتم فصل العضيات لا تعمل (الشكل 5C) منذ العضيات سيصبح معزولا داخل الآلاف من الخلايا الفردية. الأصغر في الأجنة في مرحلة خلية واحدة ، والعضيات أحرار لترحيل مسافات كبيرة وتتراكم وفقا لكثافتها مميزة. لتجنب تحليل الأجنة التي أصبحت قديمة جدا ، للتأكد من (ط) وتشمل مجموعة مسبقا للسماح للإناث لوضع البيض القديم (الخطوة 2.4) ، (ب) جمع الأجنة لمدة 3 ساعات أو أقل (الخطوة 2.5) ، (الثالث) حدد بصريا الأجنة قبل مراحل cellularization لتضمين في آغار (الخطوة 4.2) ، (د) الحفاظ على تضمين وقت قصير لمنع تطوير حتى نهاية cellularization (الخطوة 4.6) ، و (ت) تجاهل الأجنة التي لم طبقة بشكل صحيح (الخطوة 5.6) .

لا تبخل على الوقت الطرد المركزي. الرغم من أن بعض الأجنة سوف تظهر طبقات لطيفة حتى بعد 10 دقائق فقط من الطرد المركزي ، والفصل غير متناسقة من الجنين الى الجنين. يدور 30 ​​دقيقة تعطي نتائج متسقة للغاية. أيضا ، كلما طال الوقت الطرد المركزي ، ويعد طبقات مستقرة بعد الطرد المركزي قد انتهت. وهذا أمر مهم لتلك التطبيقات التي يستغرق وقتا لمعالجة أجنة أخرى قبل استخدامها (على سبيل المثال ، إذا كانت بحاجة إلى معالجتها للتجارب زرع أو منصة لتحليل مبائر).

التعديلات الممكنة

البيض جمع وإزالة المشيماء بروتوكولات مختلفة وتوجد العديد من الخطوات ل2 و 3 ^{1 ، 3 ، 9} ، وسيعمل كذلك على تلك الموصوفة هنا طالما ان الاجنة المستخدمة هي الشباب ، والغلة البيض عالية ، وجزء من سوء تم تصغير الأجنة مراحل.

المحاذاة الأمامي الخلفي البروتوكول يوجه جميع الأجنة بحيث يتم دفن في نهاية الخلفي آغار ونهاية الأمامي متروك (الشكل 3). هذا التوجه هو جيد لالاتساق ، بحيث يصبح من الممكن استخدام micropyle كمعلم هذه الغاية وأشار في أثناء الطرد المركزي (الشكل 1 ، 5). ولكن مع الممارسة ، فمن السهل على اقتطاف التوجه للأجنة طرد من مظهر متميز للالحبرية ، وطبقات الدهون صفار بواسطة مشرق الميدان المجهري. ثم يصبح من الممكن تحميل الأجنة مع إما في نهاية المطاف ، وهذا يسرع من المرونة في عملية التركيب.

Unoriented الطرد المركزي والجانب الأكثر استهلاكا للوقت وتحديا من الناحية التقنية من البروتوكول هو تركيب الأجنة في آغار (الخطوة 4). فهو يتطلب لمس كل جنين مرتين (مرة واحدة لإدراجه في حفرة واحدة لاستعادتها بعد الطرد المركزي). كبديل ، يمكن للمرء أن نقل الأجنة في الخطوة 4.1 في أنابيب مملوءة microcentrifuge خدمات الدعم التقني. عندما يتم طرد هذه الأنابيب في microcentrifuge (13،000 دورة في الدقيقة ، 10-30 دقيقة) ، والأجنة أيضا طبقة جيدا عادة ^10-13. هذا الاختلاف يسمح احد لعملية مئات من الأجنة في الوقت نفسه بسرعة كبيرة. ومع ذلك ، طبقات ليست كما متسقة ؛ جزء من الأجنة لا تتطور طبقات متميزة على الرغم من قوى الطرد المركزي أعلى من ذلك بكثير (~ 16000 ز) من البروتوكول المعمول بها في أعلاه. أكثر تحديا يتمثل في حقيقة أن التوجه للأجنة غير متغير ، ويمكن للمرء ملاحظة الفصل في زوايا مختلفة لمحور الجنين كبيرا. هذا التغير يتطلب المجرب لفرز بعد الطرد المركزي كيف تم ترتيب خاص الجنين في أنبوب الطرد المركزي. مع استخدام صفار تألق ذاتي كعلامة للجزء الأكثر كثافة من الجنين ، وهذا غالبا ما يكون ممكنا ، على الرغم من أنه يتطلب قدرا كبيرا من التدريب ومزيد من الحكم على القيام بذلك بشكل صحيح. إذا كان هناك ما يكفي من الأجنة في العينة ، يمكن للمرء أن يكون قادرا على فرز تلك الحالات التي حدث لأجنة يتم ترتيبها كما في الشكل. 1.

الطرد المركزي للأجنة في قشرة البيضة التي من الممكن تضمين الأجنة في الخطوة 4 للأجار دون إزالة المشيماء أول ^2. في هذا النهج ، وتغطي الأجنة على لوحة جمع بزيت الهالوكربون بدلا من التبييض 50 ٪ في خطوة 3.2 (الهالوكربون يحول شفافة المشيماء). ويتم اختيار الأجنة في المراحل المناسبة ونقلها إلى لوحة آغار جديدة باستخدام الملقط ، عن طريق الاستيلاء فقط شعيرات بيض مع ملاقط ، الأضرار التي لحقتيتم تجنب المناسبة الجنين. هي جزء لا يتجزأ الأجنة كما في الخطوة 4.4 من خلال 4.8 ، مع شعيرات بيض الأمامية الشائكة للخروج من المأزق في أجار. إزالة قشرة البيضة قبل العلاج التبييض 50 ٪ بعد أن تم طرد الأجنة وحفرت من آغار كما في الخطوة 5.4. قد الطرد المركزي في وجود قشرة البيضة تحسين معدل devitellinization بعد التثبيت (الخطوة 6.2) ، ولكن اختيار الصحيح لمراحل الطرد المركزي (الخطوة 4.2) هو أكثر تحديا.

تطبيقات

الطرد المركزي جنين مفيد بشكل خاص للتجارب colocalization ، أي لاختبار ما إذا كان بروتين معين يموضع لعضية رئيسية معينة. على سبيل المثال ، كلار بروتين موجود فى وقت مبكر من قطرات الدهون الجنينية ، ولكن هذا التعريب هو تحدي لإثبات في أجنة سليمة. في جزء منه ، وذلك لأن كلا نقاط وكلار وقطرات الدهون وفيرة في محيط جنين ¹⁰ ، مما يجعل من الصعب colocalization زائفة يستبعد. ومع ذلك ، يركز الطرد المركزي قطرات الدهون في طبقة متميزة ، وبالتالي ، مع إشارة colocalization كلار يصبح من الواضح ^10.

وقد أثبت تحليل مماثل لا لبس فيه توطين بروتينات أخرى إلى قطرات الدهون ^{8 ، 13-15} ، بما في ذلك أمثلة من المستغرب مثل ² و histones معينة في الحالات التي يكون فيها البروتين موجود بتواجد مطلق ولكن التخصيب على قطرات الدهون ^8. كما يمكن اختيار الأجنة بصريا حسب المرحلة التنموية (الخطوة 4.2) ، فمن الممكن حتى للكشف عن تجنيد تنظيم تنمويا من البروتينات الشحمية إلى قطرات ^{8 و 15.} مطلوب اختبار colocalization مع قطرات الدهون سهلة خصوصا منذ قطرات الدهون تتجمع في "سقف" متميزة بصريا ، لذلك لا مزيد من علامة أو وصمة لتحديد هذه الطبقة. في الواقع ، نظرا لسهولة ونتائجها المحتملة ضرب البصرية (الشكل 1 ، الشكل 5 D ، E) ، مختبرنا توظف هذه التقنية بشكل روتيني كما هو الحال الآن أول اختبار ما إذا كان بروتين المترجمة مرشح لقطرات الدهون. من حيث المبدأ ، يجب أن دراسات مماثلة colocalization عمل العضيات الأخرى المبينة في الشكل. 1 ، وعلى الأرجح للآخرين (بما في ذلك الطفيليات داخل الخلايا) الذي طرد في الأجنة التوزيع لم يتم توثيقها.

منذ الطرد المركزي يركز العضيات في نطاقات ضيقة ، فإنه يسهل عزل جزء المخصب في هذه العضيات. وقد تم بالفعل استخدام هذا الأسلوب لاسترداد قطرات الدهون لزرعها في أجنة المانحة ^2. قد يكون من الممكن أيضا أن تحليل كيميائيا الكسر المخصب (على سبيل المثال ، عن طريق خفض طبقات قبالة الأجنة بعد تثبيت ^15).

وصف الأسلوب هنا التطبيقات خارج أجنة ذبابة الفاكهة ، كما يمكن استخدام الطرد المركزي لتطبق على بيض الكثير من مختلف الأنواع (بما في ذلك الضفادع والديدان الخيطية ، الزقيات ، الحلقيات ، قنافذ البحر والرخويات ، والكائنات المجوفة) ^16. في المختبرات الخاصة بنا ، ولقد استخدمنا بروتوكول أعلاه للحصول على أجنة للdomestica الذبابة الذبابة ⁽²⁾ واستخدمت الطرد المركزي unoriented في تحليل الأجنة من الفطريات coprophila Sciara قرسة ⁽¹⁷⁾ والقواقع Ilyanassa obsoleta ^17. أخيرا ، لا يقتصر هذا الأسلوب على الأجنة : الطرد المركزي يمكن أن يكون من المفيد أيضا أن تطبق الخلايا الكبيرة الأخرى ، مثل البويضات (مثل ذبابة الفاكهة في ^{2 و 18} والصقلاب الشوائب Oncopeltus الحزمية ^17). لعينات مختلفة ، وظروف الطرد المركزي الدقيق ضرورة أن يكون الأمثل : على سبيل المثال ، 10 دقيقة في 3000 ز كافية لتطبق بكفاءة أجنة domestica الذبابة ² ، وإذا كان طرد لفترة أطول ، وتميل إلى الأجنة يتفكك خلال التثبيت وimmunostaining.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes		Becton Dickinson	#35-1007	From Falcon
Wire mesh		Small Parts	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles		Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder		Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages		Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27		Sigma	H8773