В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

Резюме

Мы опишем метод отдельных органелл по плотности в живых Drosophila Эмбрионов. Эмбрионы, внедренных в агар и центрифугировали. Эта техника дает воспроизводимые разделение основных органелл вдоль передне-задней оси эмбриона. Этот метод облегчает колокализации экспериментов и дает органелл фракций для биохимического анализа и трансплантации экспериментов.

Аннотация

Основная стратегия для очистки и изоляции различных типов внутриклеточных органелл, чтобы отделить их друг от друга на основе различий в плавучей плотности. Однако, когда клетки разрушаются перед центрифугированием, белки и органеллы в этой неместных среде, зачастую неправильно прилипать друг к другу. Здесь мы опишем метод для разделения по плотности органелл в интактных, живя эмбрионов дрозофилы. Ранние эмбрионы до cellularization собирают от населения клеток, и их внешние оболочки яйца удаляются путем обработки 50% гипохлоритом натрия. Эмбрионы затем перевели в небольшую тарелку агар и вставлены, заднему концу первых, на мелкие вертикальные отверстия в агар. Чашки, содержащие встроенные эмбрионы центрифугировали в течение 30 минут при температуре 3000г. Агар поддерживает эмбрионов и держит их в определенной ориентации. После этого эмбрионы выкопали из агар с тупой иглой.

Центрифугирование отделяет основных органелл на отдельные слои, стратификация хорошо видны яркие микроскопии. Число флуоресцентные маркеры доступны для подтверждения успешной стратификации в живых эмбрионов. Белки, связанные с определенными органеллами будет обогащаться в определенном слое, демонстрируя колокализации. Отдельные слои могут быть восстановлены для биохимического анализа или трансплантации донорских яйцеклеток. Эта техника применима для органелл разделения в других крупных клеток, включая яйца и ооцитов различных видов.

протокол

1) Подготовка агара

Обзор: Этот протокол используется агар пластин для двух различных целей. Во-первых, агаром служить поверхности яйца коллекции; яблочный сок в агар стимулирует откладки яиц. Во-вторых, эмбрионы встроенные в агар проводятся в фиксированной ориентацией, когда пластины центрифугируют; достаточно высокая концентрация агара необходимо для предотвращения пластин от распада во время центрифугирования. Для простоты, одного типа агар яблочный сок применяется как для использования.

Материалы

• Агар (25 г)
• Сахароза (25 г)
• Яблочный сок (250 мл)
• Нипагин М маточного раствора (5 г метил-р-гидрокси-бензоата в 50 мл этанола), действует в качестве консерванта
• Чашки Петри: для центрифугирования (60x15mm) и для сбора яиц (60x15 мм и 100x15 мм, в зависимости от летают клетки использовали в шаге 2)

Оборудование

• Электрическая плита
• Два колб Эрленмейера

1. В колбу, объединить 25 г агара и 750 мл дН ₂ O. Автоклав в течение 50 минут на жидком цикла. В то же время, готовят яблочный сок решение (шаг 1.2).
2. В другой колбе Эрленмейера, объединить 25 г сахарозы и 250 мл яблочного сока. Тепло на плитке (примерно до 55 ° C), чтобы растворить сахарозу. Затем добавить 15 мл нипагин М раствора. Избегайте высоких температур, так как они вызовут Нипагин разрушаться.
3. Как только агар решение остыла настолько, что колбы могут быть обработаны вручную, объединить два решения и тщательно перемешать. Движение на плитке до равномерно смешанной.
4. Налейте раствор в чашки Петри (~ 0,5 см). 1 л раствора хватает примерно 100 мелких (60 мм) или 40 больших (диаметром 100 мм) блюд.
5. Агар плиты должны высохнуть в течение нескольких часов или на ночь при комнатной температуре, иначе они будут слишком влажной для использования. Для длительного хранения, держите их упакованные (в пластмассовых бункеров или Петри рукава блюдо) при 4 ° C.

2) Сбор эмбрионов

Обзор: В течение первых 3 часов после развития (при комнатной температуре), дрозофила эмбрионы отдельных клеток (не считая зародышевой линии прекурсоров, сзади расположены клетки полюс). При правильно ориентированные эмбрионы из этих этапов центрифугируют, основные органеллы отдельный от плотности вдоль длинной оси яйца. На cellularization этапе этого большого одной клетки превращается в тысячи мелких клеток; центрифугирования силы занято не будет разрыва этих клеток. Для успешного разделения основных органелл, поэтому решающее значение для центрифуг эмбрионы, которые еще не завершены cellularization.

Материалы

• Яблоко пластин сок агар
• Дрожжи пасты (сухие дрожжи смешать с водой с арахисовым маслом консистенции)

Оборудование

• Fly клеток: в продаже (см. ниже) или самодельные ¹

1. Взрослые мухи содержатся в клетках которой яблочный сок агар пластин крепятся на дне. Используйте размер чашки Петри подходит для клеток в использовании.
2. Чтобы начать сбор яиц, готовить свежий сок яблок агар пластины и покрывать часть с дрожжами пасты. Плодовые мушки есть дрожжи, в частности, дрожжей обеспечивает питание для производства яиц. Наличие дрожжей и яблочного сока в агар также вызывает откладки яиц.
3. Для обмена старого с новой пластинкой агар, летать клетке инвертируется и ударил на скамью верхней несколько раз. Мухи падают на дно и кратко дезориентирован. Это дает вам несколько секунд, чтобы быстро удалить одну пластину агара и заменить его новым. Такой обмен требует некоторой практики, а также детали зависят от типа клетки заняты.
4. Женский мухи хранить сперму от предыдущей вязки во внутренние мешочки (сперматеки), из которой сперма выбрасывается позволяют оплодотворения яйца. Когда сыт и спокойно, самки откладывают яйца вскоре после оплодотворения, и таким образом время откладки яиц отмечает время оплодотворения и начала развития. Когда условия не являются оптимальными, женщины держать яйца для переменной раз перед укладкой. Чтобы свести к минимуму число таких неправильной постановке эмбрионов, рекомендуется отказаться от первого сборника рабочего дня («пре-коллекции" от 30 до 60 минут бывает достаточно). Наличие свежих дрожжей побуждает женщин заложить эти состоялась яйца, и последующих коллекций яйца, как правило, доминируют яиц, отложенных вскоре после оплодотворения.
5. Сбор яиц на срок до 3 часов, в зависимости от эмбриональной стадии желательно. Так как при комнатной температуре cellularization завершается после ~ 3,5 часа, больше времени коллекция не являются полезными. Наиболее последовательным слоев достигается у молодых эмбрионов, так и для рутинных экспериментов мы выступаем за более короткое время сбор (1 часили меньше).
6. Иногда мухи застревают на дрожжи или на поверхность агара пластины. Удалите их с помощью пинцета.

3) удаление яичной скорлупы из эмбрионов

Обзор: Drosophila эмбрионы покрывается двумя защитными слоями: наружный слой (хориона) из белка и внутреннего слоя (желточной мембраны) преимущественно сделанные из воска. Они защищают зародыш от механических оскорбления и высыхания. Хориона имеет два расширения (яйцо нитей или спинной придатков), которые хорошо видны в отличие структур. На этом этапе, мы удалим хориона путем замачивания яиц в 50% гипохлоритом натрия. После хориона удаляется, эмбрион становится прозрачным в проходящем свете, позволяя выбор конкретных эмбриональных стадий для центрифугирования. Как хориона также будет мешать многим после центрифугирования процедур (например, фиксация в шаге 6), удаление хориона теперь позволит быстрой обработки позже.

50% отбеливателя лечение будет растворяться хориона в течение нескольких минут, пока она не нанесет вреда эмбриону. Желточной оболочки сохраняет отбеливателя из. Мы будем продолжать лечение до отбеливания нитей яйцо больше не видно. После этого мы будем отдельных эмбрионов из отбеливателя при заливке эмбриона / отбеливатель суспензии через крошечные сито (корзина из проволочной сетки). Очень важно не спешить отбеливателя шаг экспозиции. Если отбеливателя смывается преждевременно, более поздние стадии (например, удаление желточной оболочки после записи) может быть нарушена.

Материалы по теме:

• Squirt бутылку с 50% отбеливателя (один том дН ₂ O в одном томе коммерческий отбеливатель)
• Squirt бутылку с дН ₂ O
• Бумажных полотенец

Оборудование:

• Домашнее корзины проволоки, изготовленные из листов проволочная сетка из нержавеющей стали. Для того, чтобы корзины, нарезать квадратами ~ 2 х 2 см из плоского листа и отступов их в середину.
• Пинцет провести проволочные корзины
• Пройдя через микроскоп создан для просвечивания

1. Место агар пластины при вскрытии микроскопа и наблюдать эмбрионов путем просвечивания. Убедитесь в том, чтобы определить яйца нитей (рис. 2А).
2. Squirt 50% отбеливателя на агар пластины, охватывающие эмбрионов. Перемешивают агар пластины иногда вертеться вокруг эмбрионов в отбеливатель.
3. Как только яйцо нити не видны (как правило, через 3-5 мин, но времена могут различаться), хориона был успешно удален.
4. На следующем этапе, корзины сетки будет использоваться как сито, чтобы отделить эмбрионы от отбеливателя. Захватите выдвижные корзины с помощью пинцета и удерживайте ее в течение перевернутую крышку агар пластины. Покрытие будет служить резервуаром поймать отбеливателя капает через проволочную сетку.
5. Налейте отбеливатель / эмбриона шлама из агар пластины через проволочную сетку.
6. Если значительное число эмбрионов остаются на агар пластина, шприц дН ₂ O на тарелку и полить дН ₂ O / эмбриона суспензии через проволочную сетку. Если значительное число эмбрионов перекинуться на резервуар, вылейте содержимое резервуара через проволочную сетку.
7. Сенсорный нижней части сетки на бумажное полотенце, чтобы пятно от любой лишней жидкости. Затем шприц дН ₂ O на проволочную сетку, чтобы смыть оставшийся отбеливателя. Как описано выше, крышку можно использовать в качестве резервуара для восстановления любых эмбрионов случайно смывается. Вы можете минимизировать потери эмбрионов, указывая струю воды из шприца бутылку по периметру выдвижные корзины. Часто пятно лишнюю жидкость.
8. Повторите этот шаг стиральной пять-десять раз, пока все отбеливателем был удален. Если выдвижные корзины еще пахнет отбеливателя, стиральная должна быть продолжена.

4) Монтаж эмбрионы в агар

Обзор: Drosophila яйца намного длиннее (~ 500 мкм), чем в ширину (~ 180 мкм). Чтобы получить максимальный и последовательное разделение органелл во время центрифугирования, мы ориентируем эмбрионов, что их передние концы точки к центру вращения (рис. 1, 3). Таким образом, самый легкий внутриклеточных структур (липидные капли) накапливаются на переднем конце во всех эмбрионов, в то время очень плотной структуры (желток компонентов) накапливаются у заднего конца. Эмбрионы вставляются в небольшие вертикальные отверстия в агар яблочный сок, с передними концами торчали. Агар сохраняет эмбриона в фиксированной ориентации во время центрифугирования.

Оборудование:

• Иглодержатель
• Вольфрам иглы; иглы установлены в держателе в обратном порядке от типичных ориентации, таким образом, чтобы тупой конец торчит и доступна для манипулирования эмбрионов
• P200 пипетка
• Пройдя через микроскоп создан для transilluminatioн
• Fly кистью (малые кисти используется для сортировки взрослых дрозофилы)

Материалы по теме:

• Тритон солевой раствор (TSS): 4 г хлористого натрия, 0,3 мл Тритон Х-100, залить DDH ₂ O до 1000 мл (может быть выполнен в виде 10-кратным маточного раствора)

1. Промыть эмбрионы из проволоки корзины с TSS и в пустую чашку Петри. Эмбрионы должны опускаться на дно. Передача чашке Петри содержащих эмбрионы в TSS на вскрытии масштаб и наблюдаем на просвечивание (эмбрионы будет похож на те, изображенный на рис 4).
2. Использование P200 пипетки, выберите эмбрионы желаемого этапы и перенести их на небольшую тарелку агара. Конкретные этапы легко распознать визуально (рис. 4, подробнее см. ^1). Работают быстро так как эмбрионы старения и длительного погружения (более 30 мин) в TSS может повлиять на развитие.
3. Удалить наиболее TSS с пипеткой и Kimwipe. Поверхность агара должна быть слегка влажной, что делает его легче толкать эмбрионов вокруг. Тем не менее, не должно быть бассейны жидкой оставшиеся где-нибудь на тарелке так как избыток жидкости при центрифугировании вызовет эмбрионов слайд из отверстия.
4. Использование иглы, тыкать вертикальные отверстия в агар рядом, где бы эмбрион находится. Трудно, чтобы ткнуть отверстия, которые строго вертикально, потому что вы должны держать иглу под углом, чтобы иметь возможность одновременно смотреть под микроскопом. Незначительным наклоном иглы на самом деле выгодно, потому что это создает небольшой депрессии / роще на одной стороне отверстие так, что эмбрион будет легко скользить по ней и в отверстие. Достаточно, чтобы проколоть поверхность агара с агар достаточно мягкое, что как только эмбрион частично вставленной в отверстие он может быть выдвинут в дальнейшем без повреждений.
5. Убедитесь, что вы признаете, передний и задний концы эмбрионов, так как эмбрионы должны быть толкнул в отверстия в последовательной ориентации, как правило, с передним концом вверх. Желточной оболочки на переднем конце характеризуется специализированные структуры, микропиле (рис. 2), через которые сперма поступает в процессе оплодотворения.
6. Использование тупым концом иглы, можно выдвинуть против эмбриона перемещать ее по агар и ориентировать / маневра задним концом к проколотые отверстия. Затем нажмите на передний конец к отверстию. Это должно легко скользить эмбриона в отверстие вдоль небольшой депрессии, образующихся при прокола. Как эмбрион Наклонный, нажмите на нее глубже в яму.
7. Когда полностью вставлен, эмбрион, как правило, уже довольно вертикальной. Если нет, то можно выровнять вставлены эмбриона более вертикально, нажимая на него боком. Если отверстие не слишком большой, эмбрион позиция будет стабильно проводимых агар всей центрифугирования.
8. С практикой, можно вставлять 100-250 эмбрионов на чашку. Это будет зависеть от конкретного применения, сколько для того чтобы: Если эмбрионы используются для живого изображения или в качестве доноров для трансплантации эксперименты, лишь немногие из них требуется. Если эмбрионы должны быть фиксированными и immunostained, фракция будет потеряна в период после центрифугирования обработки, и нужно начинать с более высокими номерами. Имейте в виду, что эмбрионы продолжают развиваться во время монтажа, так что если узкий стадии развития желательно, общее время для монтажа должна быть короткими.
9. Если Есть любые оставшиеся эмбрионы, которые не были заложены, удалить их из пластины с смоченной летать кисти. Dip летать кисть в жидкости (например 1xTSS), тщательно протрите через верхнюю часть пластины (при просмотре под рассекает область) подмести все оставшиеся эмбрионы, и мыть эмбрионов из кисти, опуская кисточку в жидкость снова.

5) центрифугирования и восстановления эмбрионов

Обзор: пластины передается размахивая ведрами Sorvall RT7 Плюс центрифуги и центрифугируют в течение 30 мин при 4000 оборотах в минуту, что соответствует ~ 3000 г. После центрифугирования плиты покрыты TSS. С иглой, эмбрионы выкапывают из отверстий в агар и переданы в соответствующие судов через пипетки.

Оборудование:

• Иглодержатель с иглой (как раньше)
• Sorvall RT7 Плюс с RTH750 ротора и размахивая ведрами, или эквивалент ²
• Пройдя через микроскоп создан для просвечивания
• P200 пипетка

Материалы по теме:

• TSS

1. Передача пластин размахивая ведрами центрифуги, агар стороной вниз. Убедитесь, что центрифуги сбалансированы.
2. Настройки для центрифугирования: при температуре 4-10 ° С, мин = 4000, время = 30 мин.
3. После центрифугирования, место агар пластины при вскрытии микроскопом снова и покрытие пластины со слоем TSS.
4. Использование бЛант конце иглы, копать эмбрионов из своих нор. Они будут плавать в TSS, но будет оставаться под водой.
5. Эмбрионы появится, очевидно, слоистые, с коричневой крышкой на переднем конце, ясно регионе средняя и темная, серая область на заднем конце (рис. 2, 5А). Отменить эмбрионов, которые не показывают различные слои.
6. Использование P200 пипетка, передача хорошо слоистых эмбрионов в TSS в новое судно, например, флакон сцинтилляционный или микроцентрифужных трубки, в зависимости от приложения.

6) Дальнейшая обработка

В зависимости от приложения, эмбрионы будут в дальнейшем рассматриваться по-разному.

1. Для прямого наблюдения ярко-поле или epifluorescence микроскопии, эмбрионы переносятся в буфер стекло, и установлен под 22x22 мм # 1,5 покровное, с 18x18 мм # 1 покровные как распорки. Для длительного наблюдения, может быть необходимо для замены буфера с галоидоуглеводородов нефти 27.
2. Если эмбрионы должны быть фиксированными, они должны быть переданы в шаге 5,6 до сцинтилляционный флакон. Они могут быть исправлены с помощью стандартных методов фиксации ^1. Эти методы обычно используют агитации в гептан-метанол эмульсия для удаления желточной мембраны. Заметим, что для центрифугировали эмбрионов эффективность этого шага devitellinization низкая. Поэтому целесообразно начать с так много эмбрионов в качестве практического или удалить желточной оболочки вручную ^1.
3. Если эмбрионы будут использоваться в экспериментах трансплантация (например, для удаления определенного слоя из органелл центрифугировали эмбрионов), они переводятся на чашках с агаром и установлен на покровные стекла, с использованием стандартных процедур и для uncentrifuged эмбрионов ^3. Слоев индуцированного центрифугированием стабилен в течение десятков минут.

7) Представитель результаты

Если центрифугирования работает как и ожидалось, основные эмбриональных органелл разберется по плотности ^2. Например, низкой плотности капель липидных будет накапливаться на переднем конце, с высокой плотностью желток пузырьки будут накапливаться на заднем конце (рис. 1, 2). Липидные капли и желток пузырьки хранения органеллы для липидов и белков.

Подтверждение плотность зависит от стратификации достигается с помощью визуального осмотра живых эмбрионов путем просвечивания под микроскопом вскрытии или соединения. Эмбрионы должны появиться как показано на рисунке 5А: липидные капли образуют твердый коричневый слой на самом переднем конце ("липидный шапка"); накопления желтка приведет к темно-серой зоне на заднем конце. Эти две темные слои разделены широким ясно зоны, которая представляет другие органеллы и цитоплазмы. Если эмбрионы центрифугировали после cellularization, отводками будет минимальным (рис. 5С).

Если epifluorescence микроскопа доступно, эти живые, центрифугируют эмбрионы могут быть рассмотрены под УФ-возбуждения. В этих условиях, желток показывает интенсивный синий цвет флуоресценции (рис. 5B). Компактный слой autofluorescent материала на задний полюс указывает на успешное центрифугирования и служит в качестве маркера для заднего конца.

Обратите внимание, что появление этих слоев радикально изменится, если эмбрионы являются фиксированными. Например, когда эмбрионы исправлено стандартными фиксации тепло-или формальдегид следуют гептан-метанол devitellinization ^1, липидные капли становятся полупрозрачными и липидный слой появляется беловатый и пушистые ярко-световой микроскопии, а не темно-коричневого цвета (рис. 5D). Желток аутофлюоресценция частично или полностью разрушены фиксации, становится гораздо менее интенсивным, или даже невозможно обнаружить.

Если в естественных условиях центрифугирования используют для выделения одного конкретного органелл, было бы полезно, чтобы лейбл, который органелл с флуоресцентным маркером для подтверждения. Например, YFP белков слияния, ориентированные на митохондрии, ER или Гольджи были описаны ^4. В центрифугировали эмбрионов, эти маркеры накапливаются в характерных позиций вдоль передней задней оси (рис. 1). Наконец, некоторые гистонов белков слияния локализовать как липидные капли и ядер ^2, и, следовательно, может использоваться для обозначения этих клеточных отсеков (рис. 5 E, F), а также для мониторинга стадии эмбриона (по количеству меченых ядер) . Fly штаммов выражения маркерами, упомянутые в этом пункте можно получить в Блумингтон дрозофилы фондовый центр (http://flystocks.bio.indiana.edu/). Для гистонов H2Av, как GFP и mRFP варианта доступны ^{5, 6}

Рисунок 1. Разделение органелл путем центрифугирования (изменены после ^2). Центрифугирование результатов, ориентированных эмбрионов в различных стратификации(Яркий свет). Основные органеллы накапливаются в характерных позиций вдоль передней (вверх) - задний (вниз) оси: липидные капли (обнаружен в основной эмбрионов путем окрашивания Нила Red); эндоплазматической сети, аппарата Гольджи и митохондрии (обнаружен в живых эмбрионов через YFP маркеров описано в основной текст); желтка (обнаружены аутофлюоресценция). Флуоресцентные изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии.

Рисунок 2. Схематическое представление эмбрионов.

А. Яйцо с яичной скорлупы и видные нити яйцо (спинные придатки). Как яичной скорлупы не прозрачный, яйца появляется равномерно темным.

Б. Яйцо с хориона удалены. На переднем конце (слева), микропиле видна. В зависимости от стадии развития, эмбрион внутри желточной оболочки появится равномерно темно-коричневого или показывать различные структуры. Смотрите Figure4 для примеров.

С. центрифугировали эмбриона, ориентированных, как в протоколе описаны здесь. Липидные капли накапливается в виде коричневого "шапка" в конце микропиле; желток формы серый слой на или вблизи противоположного конца.

Рисунок 3. Схематическое описание процедуры. Слева: Эмбрионы без хориона располагаются в верхней части агар пластины и толкнул с иглу в отверстия в агар. Это установка приводит к последовательной ориентации всех эмбрионов, с передними концами вверх. Справа: После центрифугирования эмбрионы расслаиваются. Агар перекрывается TSS (синий), и эмбрионы выделяют из агар с иглой. После взвешенных в TSS, эмбрионы могут быть подобраны с пипетки.

Рисунок 4. Яркий свет изображения живых эмбрионов дрозофилы, подобно тому, как они будут появляться в пункте 4.1. Эмбрионы приведены в стандартную ориентацию: передний конец на левый, задний конец вправо, спинной стороной вверх, и брюшной стороной вниз. Покадровой фильм раннего эмбриогенеза доступен как часть видео сопровождающих этот протокол.

А. эмбрионов стадии дробления появляются равномерно коричневый. Такие этапы, как этого идеально подходят для в естественных условиях центрифугирования.

Эмбрионов Б. бластодерма иметь четкое обода, что может выглядеть со всех сторон. Это четкое периферии, в частности из-за накопления ядер на плазматическую мембрану, а частично из-за внутреннего транспорта везикул желток и липидные капли ^7. Это четкое периферии расширяется почти до конца cellularization ^1. Эмбрионы могут все еще ​​быть успешно стратифицированной центрифугированием до конца cellularization ^8, хотя расслоение желток и ядер не настолько последовательно, как и в расщеплении этапов.

С. После cellularization, эмбрионов появляются асимметричные; спинной и брюшной сторон стали различны, и различные складки развиваться. Эмбрионов показан в начале зародышевой группа расширение. В этих этапах, центрифугирования уже не эффективны при стратификации основных органелл.

Рисунок 5. Центрифугировали эмбрионов. Все эмбрионы на этом рисунке центрифугировали со своим передним концом вверх и показаны в этой ориентации.

А. Яркий свет образ успешно центрифугировали эмбриона. Коричневый слой на самом переднем конце происходит из-за липидов капли накопления. Широкий серый слой вблизи заднего конца связано с желтком пузырьков. Существует часто ясно зоне ниже слоя желток, неизвестного происхождения. Желтовато зоны часто очевидно выше слоя желтка, она, вероятно, представляет митохондрий. Растворимые белки можно обнаружить в прозрачный слой между липидные капли желтка и ^2.

Б. эмбриона в рассматриваться epifluorescence микроскопии под УФ-возбуждения. Синий аутофлюоресценция характеристика желтка помогает определить задним концом.

С. эмбрионов центрифугировали в течение зародышевой группа расширение, т. е. после cellularization. Желток еще может накапливать на заднем конце, но в остальном слоев минимально.

Д. Успешно стратифицированной эмбриона, после термической фиксации. Липидов капли слой появляется белая и пушистая, а не темно-коричневый, как в незаписанных эмбрионов ().

E. & F. Эмбрионы выражения His2Av-GFP и отображение с помощью конфокальной микроскопии (изменены после ^2). E: центрифугировали при расщеплении этапах; His2Av-GFP появляется только марка липидов капли слой с несколькими ядрами образуется к этому времени. В зависимости от фокальной плоскости, ядра могут быть видны только под слоем капли (не показана здесь). F: центрифугировали при бластодерма этапах; His2Av-GFP знаки и липидов капли слой (вверху) и ядер (в широкой зоне ниже капли слой).

Обсуждение

Критические шаги

Убедитесь, что агар концентрация достаточно высока. Если она слишком низка, агар распадется во время центрифугирования, и эмбрионы лопнет или быть ориентированы случайным образом. Если агар концентрация чуть-чуть слишком низкая или, если агар мокрой (недостаточно сушеные или недостаточное удаление лишней TSS в шаге 4.3), эмбрионы будут плавать из своих нор во время центрифугирования и стать неправильно ориентирована. Если агара заливают слишком тонко, она также будет свернуть или трещину во время центрифугирования.

Убедитесь, что эмбрионы не продвинулись дальше cellularization этапов. В противном случае, разделение органелл не будет работать (рис. 5С), так как органеллы станет поглощенных в течение тысяч отдельных клеток. У молодых эмбрионов на одну ячейку этапе органеллы могут свободно мигрировать большие расстояния и накапливаться в соответствии с их характерной плотности. Чтобы избежать анализа эмбрионов, которые слишком стары, убедитесь, что (я) включают предварительно коллекции, чтобы женщины заложить старые яйца (шаг 2.4), (II) собирают эмбрионов в течение 3 часов или меньше (шаг 2.5), (III) визуально выбрать эмбрионов до cellularization этапов для встраивания в агар (шаг 4.2), (IV) сохранить вложение время короткой, чтобы предотвратить развитие до конца cellularization (шаг 4.6) и (у) отказаться от эмбрионов, которые не правильно слой (шаг 5.6) .

Не экономьте на центрифугирования времени. Хотя некоторые из эмбрионов покажет хороший слоев, даже после всего лишь 10 минут центрифугирования разделение несовместимых с эмбрионом на эмбрион. 30 спинов мин дают весьма устойчивые результаты. Кроме того, больше времени центрифугирования, тем больше слоев стабильным после центрифугирования закончилась. Это важно для тех приложений, в которых требуется время, чтобы процесс дальнейшей эмбрионов перед использованием (например, если они должны быть обработаны для трансплантации или экспериментов установлены для конфокальной анализ).

Возможные изменения

Яйцо сбора и удаления хориона Многие различные протоколы существуют для шагов 2 и 3 ^{1, 3, 9,} и будет работать так же, как те, описанные здесь, сколько эмбрионов используются молодые, яйценоскости высок, и доля неправильно поставил эмбрионов сведена к минимуму.

Передне-задней выравнивание протокол ориентирует всех эмбрионов, что задний конец похоронен в агар и передним концом вверх (рис. 3). Это направление хорошо для последовательности, так что можно использовать микропиле в качестве ориентира, какой конец отметил во время центрифугирования (рис. 1, 5). Однако, с практикой, легко выделить ориентацию центрифугировали эмбрионов на различных появление капель липидов и желток слои светлого поля микроскопию. Тогда это становится возможным монтировать эмбрионов либо в конечном итоге, это гибкость, ускоряет процесс монтажа.

Неориентированных центрифугирования наиболее трудоемкий и технически сложный аспект протокол монтажа эмбрионы в агар (шаг 4). Она требует, касаясь друг эмбриона дважды (один раз, чтобы вставить ее в отверстие и один раз, чтобы восстановить его после центрифугирования). В качестве альтернативы, можно перенести эмбрионы в шаге 4,1 в микроцентрифужных трубки, наполненные TSS. Когда эти трубы центрифугируют в микроцентрифужных (13000 оборотов в минуту, 10-30 мин), эмбрионы также обычно слой и ^10-13. Это изменение позволяет обрабатывать сотни эмбрионов в то же время очень быстро. Тем не менее, отводками, не настолько последовательно, доля эмбрионов не развивается, несмотря на различные слои намного выше центрифугирования сил (~ 16 000 г), чем применяемые в протоколе выше. Более сложным является тот факт, что ориентация эмбрионов является переменной величиной, и можно наблюдать разделение под разными углами к главной оси эмбриона. Эта изменчивость требует экспериментатором, чтобы разобраться после центрифугирования насколько тот или иной эмбрион был устроен в центрифуге трубки. При использовании аутофлюоресценция желтка в качестве маркера для наиболее плотную часть эмбриона, часто это возможно, хотя это требует много практики и многое другое решение сделать это надежно. Если Есть достаточное эмбрионов в образце, можно быть в состоянии разобраться в тех случаях, когда эмбрионы оказались расположены как на рис. 1.

Центрифугирование эмбрионов в их яичной скорлупы можно вставлять эмбрионы в агар на шаге 4, не снимая хориона первые ^2. При таком подходе, эмбрионы по сбору пластины покрыты галоидоуглеводородов нефти вместо 50% отбеливателя в п. 3.2 (галоидоуглеводородов превращается хорион полупрозрачные). Эмбрионы соответствующих стадиях отобраны и переданы новой пластинкой агар с помощью пинцета, захватывая только нити яйцо с помощью пинцета, повреждениеэмбриона собственно избежать. Эмбрионы вкладывается как в шаге 4,4 через 4,8 с передней нити яйцо торчащий из дыры в агар. Яичную скорлупу удаляется на 50% отбеливателя лечение после эмбрионы были центрифугировали и выкопали из агара, как в пункте 5.4. Центрифугирование в присутствии яичной скорлупы может улучшить скорость devitellinization после фиксации (шаг 6.2), но выбор правильного этапов центрифугирования (шаг 4.2) является более сложной задачей.

Применения

Эмбрион центрифугирования особенно полезно для колокализации опытов, т. е. для проверки того или иного белка локализуется на некоторых основных органелл. Например, Клар белок присутствует на раннее эмбриональное капли липидов, однако эта локализация является сложной задачей для демонстрации в интактных эмбрионов. Отчасти это происходит потому, что оба Клар puncta и липидные капли в изобилии встречаются эмбриона периферии ^10, делая ложные колокализации трудно исключить. Тем не менее, центрифугирования концентратов липидные капли в различных слоя, и, таким образом, колокализации с Клар сигнал становится очевидным ^10.

Подобный анализ однозначно показал локализации других белков в липидные капли ^{8, 13-15,} в том числе удивительные примеры как и некоторые гистоны ² и в тех случаях, когда белок присутствует повсеместно, но обогащенный на липидные капли ^8. Как эмбрионы могут быть выбраны визуально стадии развития (шаг 4,2), можно даже обнаружить зрения развития регулируется набором белков в липидные капли ^{8, 15.} Тестирование на колокализации с липидные капли особенно легко, так как липидные капли накапливаться в визуально различимых "шапка", так что никаких дальнейших маркер или пятно, необходимых для идентификации этого слоя. На самом деле, из-за своей легкости и потенциально поразительный визуальный результаты (рис. 1, рис. 5 D, E), наша лаборатория использует эту технику теперь обычно как первое испытание ли кандидат белок локализуется в липидных каплях. В принципе, подобные исследования колокализации должен работать на другие органеллы показано на рис. 1, и, вероятно, для других (в том числе внутриклеточных паразитов), распределение которых в центрифугировали эмбрионов до сих пор не документированы.

После центрифугирования концентратов органелл в узкие полосы, это облегчает изоляцию фракции, обогащенной в этих органелл. Этот подход уже был использован для восстановления липидные капли для трансплантации в эмбрионы доноров ^2. Он также может быть возможным биохимическом анализе фракции, обогащенной (например, за счет сокращения слои от эмбрионов после фиксации ^15).

Метод, описанный здесь, имеет приложения вне эмбрионы дрозофилы, как центрифугирование могут быть использованы для стратификации яйца много разных видов (включая лягушек, нематод, оболочников, кольчатых червей, морских ежей, моллюсков и книдарий) ^16. В нашей лаборатории мы использовали протокол выше для эмбрионов мухи Musca Domestica ² и использовали неориентированных центрифугирования в анализ эмбрионов из гриба комара Sciara coprophila ¹⁷ и улитки Ilyanassa obsoleta ^17. Наконец, этот метод не ограничивается эмбрионов: Центрифугирование также может быть полезна для стратификации других крупных клетках, таких как ооциты (например, в ^{2-дрозофилы, 18} и молочая ошибка Oncopeltus fasciatus ^17). Для разных образцов, точные условия центрифугирования должны быть оптимизированы: Например, 10 минут в 3000 г достаточно эффективно стратифицировать эмбрионов Musca Domestica ^2, а если центрифугировали намного дольше, эмбрионы, как правило, разбиваются на части во время фиксации и иммунной окраски.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes		Becton Dickinson	#35-1007	From Falcon
Wire mesh		Small Parts	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles		Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder		Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages		Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27		Sigma	H8773