In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

Summary

אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות המגורים תסיסנית עוברים. עוברים המוטבעים אגר ו centrifuged. טכניקה זו התשואות ההפרדה לשחזור של האברונים העיקריים לאורך הציר הקדמי, האחורי את העובר. שיטה זו מקלה על ניסויים colocalization והתשואות שברים אברון לניתוח השתלת ניסויים ביוכימיים.

Abstract

האסטרטגיה העיקרית מטהרים לבודד סוגים שונים של אברונים תאיים היא להפריד אותם זה מזה מבוסס על הבדלים בצפיפות קליל. עם זאת, כאשר התאים הם שיבשו לפני, חלבונים צנטריפוגה ואת האברונים בסביבה לא דובר זה לעתים קרובות באופן בלתי הולם לדבוק זה בזה. כאן אנו מתארים שיטה האברונים נפרד על ידי צפיפות שלם, החיים עוברים תסיסנית. עוברי מוקדם לפני cellularization נקצרים מהכלובים האוכלוסייה, ופצצות החיצוני שלהם ביצה יוסרו על ידי טיפול עם אקונומיקה 50%. העוברים מועברים לצלחת אגר קטן ונוסף, סוף האחורי הראשונה, לתוך חורים אנכיים קטנים אגר. לוחיות המכילות עוברים המוטבע centrifuged למשך 30 דקות בכל 3000g. אגר תומכת עוברים ושומר אותם בכיוון מוגדר. לאחר מכן, עוברים הם חפרו מתוך אגר עם מחט קהה.

צנטריפוגה המפרידה האברונים העיקריים לתוך שכבות נפרדות, ריבוד גלוי בקלות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. מספר סמנים ניאון זמינים לאשר ריבוד מוצלח עוברים חיים. חלבונים הקשורים אברונים מסוימים יהיה מועשר בשכבה מסוימת, הוכחת colocalization. שכבות בודדת ניתן לשחזר לניתוח השתלת ביוכימית או ביצים לתוך התורם. טכניקה זו חלה על הפרדה אברון בתאים גדולים אחרים, כולל ביצים וביציות של מינים שונים.

Protocol

1) הכנת צלחות אגר

סקירה: פרוטוקול זה מעסיקה צלחות אגר עבור שני שימושים נפרדים. ראשית, צלחות אגר לשמש משטח איסוף ביצים, מיץ תפוחים אגר מגרה ההטלה. שנית, עוברים מוטבע אגר מתקיימים בכיוון קבוע כאשר הצלחות הן centrifuged; ריכוז גבוה מספיק של אגר הוא הכרחי על מנת למנוע את הצלחות מן מתפורר במהלך צנטריפוגה. למען הפשטות, סוג אחד של אגר מיץ תפוחים מועסק לשימושים שניהם.

חומרים

• אגר (25 גרם)
• סוכרוז (25 גרם)
• מיץ תפוחים (250 מ"ל)
• Nipagin M פתרון מניות (5 גרם מתיל-p-hydroxy-בנזואט באתנול 50 מ"ל), פועל כחומר משמר
• צלחות פטרי: עבור צנטריפוגה (60x15mm) ועל אוסף ביצה (60x15 מ"מ או מ"מ 100x15, בהתאם כלובים לטוס להשתמש בשלב 2)

ציוד

• חם בצלחת
• שתי צלוחיות Erlenmeyer

1. בכל בקבוקון Erlenmeyer, לשלב 25 אגר גרם ו 750 מ"ל DH ₂ O. החיטוי של 50 דקות על מחזור נוזלי. בינתיים, להכין פתרון מיץ תפוחים (שלב 1.2).
2. בכל בקבוקון אחר Erlenmeyer, לשלב 25 גרם סוכרוז ו - 250 מ"ל של מיץ תפוחים. מחממים על כיריים (כ 55 ° C) לפרק סוכרוז. ואז להוסיף 15 מ"ל פתרון Nipagin ז. הימנע טמפרטורות גבוהות יותר, כפי שהם יגרמו Nipagin לשבור.
3. לאחר פתרון אגר מתקרר מספיק את הבקבוק ניתן לטפל ביד, לשלב את שני הפתרונות ומערבבים היטב. מערבבים בצלחת חם עד מעורב באופן שווה.
4. יוצקים לתוך פתרון צלחות פטרי (~ 0.5 ס"מ). 1 ליטר של פתרון מספיק על 100 קטנות (בקוטר 60 מ"מ) או 40 גדולים (100 מ"מ קוטר) הכלים.
5. צלחות אגר צריך להתייבש במשך מספר שעות או למשך הלילה בטמפרטורת החדר, אחרת הם יהיו רטובים מדי לשימוש. עבור אחסון לטווח ארוך, למנוע מהם עטוף (בסלים שרוולי פלסטיק או צלחת פטרי) בשעה 4 ° C.

2) מסיק עוברים

סקירה: במהלך 3 השעות הראשונות של ההתפתחות (בטמפרטורת החדר), עוברים תסיסנית הם תאים בודדים (לא כולל הנבט קו מבשרי, התאים מוט הממוקם בדיעבד). כאשר עוברים מכוונת כראוי שלבים אלה centrifuged, האברונים העיקריים נפרד על ידי צפיפות לאורך ציר זמן של הביצה. בשלב cellularization, תא יחיד זה גדול מומר אלפי תאים קטנים; כוחות צנטריפוגה מועסק לא קרע את התאים האלה. עבור הפרדה מוצלחת של האברונים העיקריים, חשוב ולכן צנטריפוגות עוברי כי לא סיימו את cellularization.

חומרים

• מיץ תפוחים צלחות אגר
• שמרים להדביק (שמרים יבשים מעורבבים עם מים עקביות חמאת בוטנים)

ציוד

• טוס כלובים: זמינים מסחרית (ראה להלן) או תוצרת בית ¹

1. זבובים בוגרים מוחזקים בכלובים אשר אגר צלחות מיץ תפוחים הם מודבקת בתחתית. השתמש בגודל של צלחות פטרי מתאים כלובי בשימוש.
2. כדי ליזום אוסף ביצה, להכין אגר טרי מיץ תפוחים בצלחת ומכסים חלק עם הדבק שמרים. זבובי פירות לאכול שמרים, בפרט, שמרים תזונה מספקת לייצור ביצים. נוכחותם של שמרים מיץ תפוחים אגר גם גורם הנחת ביצה.
3. כדי להחליף את הישן עם צלחת אגר חדש, בכלוב לעוף היא הפוכה ודפקה על גבי הספסל כמה פעמים. הזבובים יפלו לתחתית והם מבולבלים בקצרה. זה נותן לך כמה שניות במהירות להסרת צלחת אגר ולהחליף אותו עם אחד טרי. חילופי זה לוקח חלק באימון, ופרטים תלויים בסוג הכלוב מועסק.
4. נקבה זבובים זרע חנות מ הזדווגויות קודמות שקיות פנימית (spermathecae) ​​שממנו הזרע הוא שוחרר כדי לאפשר הפריה של ביציות. כאשר מאכילים אותם היטב באין מפריע, הנקבות מטילות ביצים זמן קצר לאחר ההפריה, ולכן הזמן של ההטלה מסמן את זמן ההפריה ואת תחילתה של התפתחות. כאשר התנאים לא אופטימליים, נקבות להחזיק ביציות מופרות על פי משתנה לפני הנחת. כדי למזער את מספר כזה אי - מבוים עוברים, מומלץ לבטל את האוסף הראשון של יום העבודה ("קדם איסוף" של 30-60 דקות מספיקה). נוכחותם של שמרים טריים גורם הנקבות להטיל ביצים אלה המוחזקים, ואוספים ביצים הבאים נוטים להיות נשלט על ידי ביצים שהופקדו זמן קצר לאחר ההפריה.
5. איסוף ביצים במשך עד 3 שעות, תלוי באיזה שלב עוברי הוא הרצוי. מאז בכל cellularization בטמפרטורת החדר הושלמה לאחר ~ 3.5 שעות, פעמים אוסף כבר אינם יעילים. שכבות העקביים ביותר מושגת עוברים צעירים, כך אנו בעד ניסויים שגרתי פעמים אוסף קצר (1 שעהאו פחות).
6. לפעמים זבובים להיתקע על השמרים או על פני השטח של צלחת אגר. הסר אותם עם פינצטה.

3) הסרת מעטפת הביצית מעוברים

סקירה: עוברים תסיסנית מכוסים על ידי שתי שכבות מגן: השכבה החיצונית (סיסית) עשוי חלבון השכבה הפנימית (קרום vitelline) ברובה עשוי משעווה. הם מגינים על העובר מפני עלבונות מכני התייבשות. סיסית יש שתי סיומות (חוטים ביצה או הנספחים הגבי) הנראים בקלות כמו מבנים נפרדים. בשלב זה, נוכל להסיר את סיסית על ידי השריית הביצים אקונומיקה 50%. לאחר סיסית מוסר, העובר הופך שקוף האור המועבר, המאפשר בחירה של בשלבים עובריים ספציפיות צנטריפוגה. כפי סיסית הייתה גם להפריע שלאחר צנטריפוגה הליכים רבים (למשל, קיבעון בשלב 6), הסרת סיסית כעת יאפשר עיבוד מהיר מאוחר יותר.

הטיפול אקונומיקה 50% יהיה לפזר את סיסית בתוך דקות ספורות, אך זה אינו פוגע בעובר. קרום vitelline שומר את אקונומיקה. אנחנו נמשיך את הטיפול אקונומיקה עד חוטים ביצה אינן גלויות. לאחר מכן, נוכל להפריד את העוברים מן אקונומיקה על ידי מזיגת slurry העובר / אקונומיקה דרך מסננת קטנה (סל עשוי רשת תיל). זה קריטי לא למהר הצעד חשיפה אקונומיקה. אם אקונומיקה היא לשטוף בטרם עת, צעדים מאוחר יותר (למשל, הסרת קיבוע הממברנה vitelline הבאה) עלול להיות בסכנה.

חומרים:

• בקבוק ריסוס עם אקונומיקה 50% (אחד נפח DH ₂ O כדי להלבין כרך אחד מסחרי)
• בקבוק ריסוס עם DH ₂ O
• נייר מגבת

ציוד:

• וסלסלות רשת ביתית עשוי יריעות של רשת נירוסטה חוט. כדי לעשות סלים, לחתוך ריבועים של ~ 2 x 2 ס"מ מתוך גיליון שטוח הכניסה אותם באמצע.
• מלקטת להחזיק סלי חוט
• מיקרוסקופ הביתור להגדיר עבור שקוף

1. מניחים את צלחת אגר תחת מיקרוסקופ לנתח ולבחון את העוברים על ידי שקוף. הקפד לזהות את החוטים ביצה (ראה איור 2 א).
2. אקונומיקה Squirt 50% לצלחת אגר, מכסה את העוברים. להתסיס את צלחת אגר מדי פעם כדי לערבל את העוברים סביב אקונומיקה.
3. לאחר חוטים ביצה אינן גלויות (בדרך כלל אחרי 3-5 דקות, אבל פעמים עשוי להשתנות), סיסית הוסר בהצלחה.
4. בשלב הבא, סל רשת תיל ישמש מסננת כדי להפריד את העוברים מן אקונומיקה. תפוס את סל תיל עם פינצטה והחזיקו אותו מעל השער הפוכה של צלחת אגר. לכסות ישמש כמאגר לתפוס את אקונומיקה מטפטף מבעד לרשת.
5. יוצקים את slurry אקונומיקה / העובר מצלחת אגר מבעד לרשת.
6. אם מספר משמעותי של עוברים נשארים בצלחת אגר, להשפריץ DH ₂ O לצלחת ושופכים את ₂ DH slurry O / העובר מבעד לרשת. אם מספר משמעותי של עוברים לגלוש אל תוך המאגר, לשפוך את תכולת המאגר מבעד לרשת.
7. המגע התחתונה של רשת תיל כדי מגבת נייר כדי למחוק משם כל נוזל עודף. ואז להשפריץ DH ₂ O על רשת תיל כדי לשטוף באקונומיקה הנותרים. כפי שתואר לעיל, הצלחת לכסות יכולים לשמש כמאגר לשחזר שום עוברי שטף בטעות. ניתן למזער את אובדן עוברים ידי הצבעה זרם של מים מבקבוק להשפריץ לאורך למתחם סל תיל. לעתים קרובות למחוק את נוזל עודף.
8. חזור על שלב זה כביסה חמש עד עשר פעמים, עד שכל המלבין הוסר. אם סל חוט עדיין ריח של אקונומיקה, כביסה צריך להמשיך.

עוברים 4) הרכבה של אגר

סקירה: ביצים תסיסנית הם הרבה יותר (~ 500 מיקרומטר) מאשר רחב (~ 180 מיקרומטר). כדי לקבל הפרדה מקסימאלית ועקבית של אברונים במהלך צנטריפוגה, אנו עוברים לכוון כך מסתיים בנקודה הקדמי שלהם לכיוון מרכז הסיבוב (איור 1, 3). בדרך זו, מבנים תאיים הקל (טיפות השומנים) להצטבר בקצה הקדמי של כל העוברים, בעוד מבנים צפופים מאד (רכיבים חלמון) לצבור לקראת סוף האחורי. העוברים מוכנסים לתוך החורים אנכי קטן אגר מיץ תפוחים, עם סיום הקדמי מזדקר. אגר שומר את העובר בכיוון קבוע במהלך צנטריפוגה.

ציוד:

• בעל מחט
• טונגסטן מחטים, מחטים הם רכובים על בעל לאחור בכיוון טיפוסי, כך בסוף בוטה בולט והוא זמין כדי לתפעל את העוברים
• P200 pipettor
• מיקרוסקופ הביתור להגדיר עבור transillumination
• טוס מברשת (מברשת צבע קטן המשמש מעין מבוגר תסיסנית)

חומרים:

• טריטון מלח פתרון (TSS): 4G NaCl, 0.3 מ"ל טריטון X-100, למלא עם DDH ₂ O ל 1000 מ"ל (ניתן כפתרון מניות 10x)

1. שטפו עוברי מתוך סל התיל עם TSS לתוך צלחת פטרי ריקות. עוברים צריך לשקוע לקרקעית. מעבירים את צלחת פטרי המכילה את העוברים TSS על היקף לנתח ולבחון על ידי שקוף (עוברים ייראו דומים לאלה המתוארים איור 4).
2. שימוש pipettor P200, בחר עוברים שלבים הרצוי ולהעבירם צלחת אגר קטנות. בשלבים מסוימים יכולים בקלות להיות מוכר חזותית (איור 4: לפרטים נוספים, ראה ^1). עבודה במהירות מאז עוברים הם הזדקנות ממושכת הטבילה (יותר מ 30 דקות) ב TSS עשוי להשפיע על התפתחות.
3. הסר ביותר TSS עם טפטפת ו Kimwipe. פני השטח של אגר צריך להיות לח מעט מה שמקל לדחוף עוברים מסביב. עם זאת, לא צריכה להיות בריכות של נוזל שנותר מקום על הצלחת מאז נוזל עודף במהלך צנטריפוגה יגרום העוברים להחליק מתוך החורים.
4. באמצעות מחט, לנקב חורים אנכי לתוך אגר הקרוב מקום העובר נמצא. קשה חורים אשר אנכי לחלוטין, כי אתה צריך להחזיק את המחט בזווית כדי להיות מסוגל לצפות בו זמנית מתחת למיקרוסקופ. נטייה קלה של מחט הוא בעצם יתרון, כי זה יוצר דיכאון חורשה קטנה / על צד אחד של החור כך העובר יהיה בקלות להחליק לאורך אותו לתוך החור. זה מספיק כדי לנקב את פני השטח של אגר אגר מאז הוא רך מספיק שפעם עובר מוכנס חלקית לתוך חור זה יכול להיות עוד קצת פנימה ללא נזק.
5. ודאו שאתם מכירים את הקצוות הקדמי ואת האחורי של העוברים, כאשר עוברים צריך להיות דחף לתוך החורים בכיוון עקבי, בדרך כלל עם סיום הקדמי למעלה. קרום vitelline בקצה הקדמי מאופיין במבנה מיוחד, micropyle (איור 2), שדרכו הזרע נכנס במהלך ההפריה.
6. שימוש בקצה הקהה של מחט, אתה יכול לדחוף כנגד העובר כדי להזיז אותו לאורך אגר וכדי לכוון / תמרון סוף האחורי כלפי ניקב חור. ואז לדחוף כנגד הקצה הקדמי לכיוון החור. זו צריכה להחליק בקלות את העובר לתוך החור לאורך השקע שנוצר במהלך קלה ניקוב. כאשר העובר מעלה ומטה, לדחוף אותו עמוק יותר לתוך החור.
7. כאשר דחף מלא, העובר בדרך כלל כבר אנכי למדי. אם לא, אתה יכול ליישר את העובר מוכנס יותר אנכית על ידי לחיצה על זה לצדדים. אם החור לא גדול מדי, המיקום העובר יתקיים ביציבות על ידי אגר ברחבי צנטריפוגה.
8. בעזרת תרגול, ניתן להטביע 100-250 העוברים לכל צלחת. זה יהיה תלוי ביישום מסוים כמה נדרשים: אם עוברים משמשים הדמיה לחיות או תורמים ניסויים השתלה, רק מעטים נדרשים. אם עוברים יש קבוע immunostained, חלק יאבדו במהלך עיבוד פוסט צנטריפוגה, ואחד צריך להתחיל עם מספרים גבוהים יותר. זכור כי עוברי להמשיך ולפתח במהלך גובר ולכן אם שלב הפיתוח צר הוא הרצוי, את הזמן הכולל עבור הצרכים הרכבה להיות כל הזמן קצר.
9. אם יש שאריות עוברים שלא היו מוטבעים, להסיר אותם מן הלוח עם מברשת לטוס לחלח. טובלים את המברשת לטוס לתוך נוזל (1xTSS למשל), לנגב היטב לרוחב החלק העליון של הצלחת (תוך כדי צפייה מתחת למשטח הביתור) כדי לטאטא את כל העוברים שאריות, ולשטוף את העוברים מתוך המברשת על ידי טובלים את המברשת לנוזל שוב.

5) צנטריפוגה והתאוששות של עוברים

סקירה: צלחות מועברים דליים נדנוד של Sorvall RT7 פלוס צנטריפוגות ו centrifuged למשך 30 דקות ב 4000 סל"ד, אשר מתאים ~ 3000 ז לאחר צנטריפוגה, צלחות מכוסים TSS. עם מחט, עוברים הם חפרו מתוך החורים אגר ומועברים לתוך כלי מתאים באמצעות pipettor.

ציוד:

• בעל מחט עם מחט (כמו קודם)
• Sorvall RT7 פלוס עם הרוטור RTH750 ודליים מתנדנד, או שווה ערך ²
• מיקרוסקופ הביתור להגדיר עבור שקוף
• P200 pipettor

חומרים:

• TSS

1. העברת צלחות דליים נדנוד של הצד, אגר צנטריפוגות למטה. ודא צנטריפוגות מאוזן באופן שווה.
2. הגדרות עבור צנטריפוגה: טמפרטורה = 40-10 ° C, סל"ד = 4000, זמן = 30 דקות.
3. לאחר הצלחת, צנטריפוגה אגר מקום תחת מיקרוסקופ לנתח שוב מכסים את הצלחת בשכבה של TSS.
4. שימוש בסוף lunt של המחט, לחפור את העוברים מתוך החורים שלהם. הם מרחפים TSS, אך יישאר מתחת למים.
5. עוברים יופיעו מרובד ברור, עם כובע חום בקצה הקדמי, אזור באמצע ברור, אזור כהה, אפור בקצה האחורי (איור 2, 5 א). מחק עוברי כי אינם מצליחים להראות שכבות נפרדות.
6. שימוש pipettor P200, העברת היטב שכבתית עוברים TSS לכלי חדש, למשל בקבוקון scintillation או צינור microcentrifuge, בהתאם ליישום.

6) עיבוד נוסף

בהתאם ליישום, עוברים יהיה בהמשך יטופלו בדרכים שונות.

1. עבור תצפית ישירה על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר או epifluorescence, העוברים מועברים למאגר לשקופית זכוכית, רכוב תחת 22x22 מ"מ # 1.5 coverslip, 18x18 מ"מ עם # 1 coverslips כמו מפרידי. עבור לטווח ארוך תצפיות, ייתכן שיהיה צורך להחליף את החיץ עם שמן halocarbon 27.
2. אם הם עוברים להיות קבוע, הם יועברו בשלב 5.6 ל בקבוקון הנצנץ. אז הם יכולים להיות קבוע תוך שימוש בטכניקות קיבוע תקן ^1. טכניקות אלו בדרך כלל להעסיק תסיסה אמולסיה heptane-מתנול כדי להסיר את הקרום vitelline. שים לב כי עבור עוברי centrifuged את היעילות של הצעד הזה devitellinization נמוכה. לכן מומלץ להתחיל עם עוברים רבים ככל מעשית או להסיר את הקרום vitelline ידני ^1.
3. אם עוברים ישמש בניסויים השתלה (למשל, כדי להסיר את רובד מסוים אברון מן העוברים centrifuged), הם מועברים צלחות אגר רכוב על coverslips, באמצעות נהלים סטנדרטיים כמו עוברי uncentrifuged ^3. שכבות המושרה על ידי צנטריפוגה יציב במשך עשרות דקות.

7) נציג תוצאות

אם צנטריפוגה עבד כצפוי, האברונים העיקריים עובריים יפתרו על ידי צפיפות ^2. לדוגמה, צפיפות נמוכה טיפות השומנים יצטברו בקצה הקדמי; צפיפות גבוהה שלפוחית ​​החלמון יצטברו בסוף האחורי (איור 1, 2). טיפות ליפידים ואת שלפוחית ​​החלמון הם אברונים אחסון שומנים חלבונים.

אישור ריבוד צפיפות תלויי מושגת באמצעות בדיקה ויזואלית של עוברים חיים על ידי שקוף תחת מיקרוסקופ לנתח או תרכובת. עוברים אמור להופיע כמו 5A איור: טיפות השומנים יהוו שכבת חום מוצק בקצה הקדמי מאוד ("כובע שומנים בדם"), הצטברות חלמון תגרום אזור אפור כהה בקצה האחורי. אלה שתי שכבות כהה מופרדות אזור ברורה רחב המייצג אברונים אחרים בציטופלסמה. אם הם עוברים centrifuged לאחר cellularization, שכבות תהיה מינימלית (איור 5c).

אם מיקרוסקופ epifluorescence זמין, אלה החיים עוברים centrifuged ניתן לבדוק תחת עירור UV. בתנאים אלה, חלמון מציג autofluorescence כחול עז (איור 5 ב). שכבה קומפקטית של חומר autofluorescent בקוטב האחורי מציין צנטריפוגה מוצלח ומשמש כסמן לסוף האחורי.

ראוי לציין, כי המראה של שכבות אלה ישתנה באופן דרסטי אם עוברים הם קבועים. לדוגמה, כאשר עוברים קבועים על ידי קיבוע בחום או פורמלדהיד רגיל ואחריו devitellinization מתנול ^heptane-1, טיפות השומנים הופכים שקופים שכבת השומנים נראה לבנבן ורך על ידי מיקרוסקופ אור בהיר ולא חום כהה (איור 5D). חלמון autofluorescence נהרס חלקית או לחלוטין על ידי קיבוע, להיות הרבה פחות אינטנסיבי או אפילו בלתי מורגשת.

אם ב-vivo צנטריפוגה הוא מועסק מדגישים אחת אברון מסוים, כדאי תווית אברון עם פלורסנט סמן לאישור. לדוגמה, חלבונים YFP היתוך ממוקד מיטוכונדריה, ER או Golgi תוארו ^4. בשנת עוברים centrifuged, סמנים אלה מצטברים על עמדות אופיינית לאורך הציר הקדמי אחורי (איור 1). לבסוף, חלבונים מסוימים היתוך היסטון בתרגום הן טיפות השומנים גרעינים ^2, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לסמן את אלו תאים סלולריים (איור 5 E, F), כמו גם לפקח על הבמה של העובר (במספר גרעינים שכותרתו) . זנים טוס ביטוי סמנים שהוזכרו בפסקה זו זמינים תסיסנית Bloomington מניות במרכז (http://flystocks.bio.indiana.edu/). עבור H2Av היסטון, הן גרסאות ה-GFP ו mRFP זמינים ^{5, 6}

באיור 1. ההפרדה של אברונים ידי צנטריפוגה (שונה אחרי ^2). צנטריפוגה של תוצאות עוברי שכיוונו ריבוד נפרדות(אור בהיר). אברונים עיקריים מצטברים על עמדות אופיינית לאורך קדמית (למעלה) - ציר אחורי (למטה): טיפות השומנים (זוהה על ידי עוברי קבוע מכתים האדום הנילוס); reticulum endoplasmic, Golgi, ואת המיטוכונדריה (זוהה עוברים החיים דרך סמנים YFP המתואר הטקסט הראשי), חלמון (זוהה על ידי autofluorescence). התמונות הקרינה נרכשו על ידי מיקרוסקופיה confocal.

איור 2. תיאור סכמטי של עוברים.

א ביצה ביצה עם הקליפה ואת החוטים ביצה בולט (הנספחים הגבי). כמו פגז ביצה אינו שקוף, ביצה מופיע כהה אחיד.

ב 'ביצה עם סיסית הוסרו. בסוף הקדמית (משמאל), micropyle גלוי. בהתאם לשלב הפיתוח, העובר בתוך קרום vitelline יופיע חום כהה אחיד או להציג מבנים שונים. ראה Figure4 דוגמאות.

ג Centrifuged העובר, אוריינטציה כמו בפרוטוקול המתואר כאן. טיפות ליפידים לצבור כמו "כובע" חום בסוף micropyle; חלמון יוצר שכבת אפור ליד או בצד הנגדי.

איור 3. תיאור סכמטי של ההליך. משמאל: עוברים ללא סיסית ממוקמים על גבי צלחת אגר ודחף עם מחט לתוך חורים אגר. זה הרכבה תוצאות בכיוון עקבי של כל העוברים, עם הקדמי מסתיים. מימין: לאחר צנטריפוגה, עוברים הם מרובדת. הוא אגר ועליהן TSS (כחול), ועוברים הם התאושש אגר עם המחט. הושעה פעם TSS, עוברי יכול להיות הרים עם pipettor.

איור 4. מוארת באור תמונות של חיים עוברים תסיסנית, בדומה לאופן בו הם יופיעו צעד 4.1. עוברים מוצגים אוריינטציה רגיל: סוף הקדמי עד הסוף, שמאל אחורי ל את, נכון בצד הגב, ועל הצד הגחוני למטה. סרט זמן לשגות של העובר מוקדם זמין כחלק וידאו המלווה בפרוטוקול זה.

בשלב א 'עוברים תחרות ושסעים מופיעים חום אחיד. שלבי ככה הם אידיאליים עבור צנטריפוגה ב-vivo.

עוברים ב Blastoderm יש שפה ברורה שמופיע דומה על כל הצדדים. זה ברור בפריפריה הוא חלק בשל הצטברות של גרעינים על הממברנה פלזמה בין השאר בשל התחבורה הפנימית של שלפוחית ​​החלמון ואת טיפות השומנים ^7. זה ברור בפריפריה מתרחב עד סמוך לסוף cellularization ^1. עוברים עדיין יכול להיות מרובדת בהצלחה על ידי צנטריפוגה עד סוף cellularization ^8, למרות שכבות של חלמון גרעינים אינו עקבי כמו בשלבים מחשוף.

ג לאחר cellularization, עוברים להופיע סימטרית; הצדדים הגבי ו הגחון להיות ברורים, ואת קפלי שונים לפתח. העובר הראה הוא הרחבה נבט-band מוקדם. בשלבים אלה, צנטריפוגה היא כבר לא יעילה stratifying האברונים העיקריים.

איור 5. עוברי Centrifuged. עוברים כל בנתון זה היו centrifuged עם סיום הקדמי שלהם מעלה מוצגים בכיוון זה.

א מוארת באור תמונה של עובר centrifuged בהצלחה. שכבה חום בקצה הקדמי מאוד בשל הצטברות שומנים רביב. שכבה אפורה רחבה לקראת סוף האחורי בשל שלפוחית ​​החלמון. לעתים קרובות יש אזור ברור מתחת לשכבת חלמון, ממקור לא ידוע. אזור צהבהב הוא לעתים קרובות לכאורה מעל שכבת חלמון, זה כנראה מייצג המיטוכונדריה. חלבונים מסיסים נמצאים בכל שכבת ברורה בין טיפות שומנים חלמון ^2.

ב העובר בתוך שנצפו על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence תחת עירור UV. המאפיין autofluorescence הכחול של החלמון מסייע לזהות את הקצה האחורי.

העובר ג centrifuged במהלך הארכה נבט-band, כלומר, לאחר cellularization. חלמון עדיין עשויים להצטבר בקצה האחורי, אבל חוץ מזה שכבות היא מינימלית.

ד העובר מרובדת בהצלחה, לאחר קיבוע בחום. שכבת שומנים אגל נראה לבן ורך, ולא חום כהה כמו עוברי מבולבל (A).

ה & פ עוברים להביע His2Av-GFP ו הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal (שונה אחרי ^2). E: centrifuged בשלבים המחשוף; His2Av-GFP נראה רק לסמן את שכבת השומנים אגל מאז גרעינים כמה נוצרים בזמן הזה. בהתאם המטוס מוקד, גרעינים יכול להיות גלוי רק מתחת לשכבת רביב (לא מוצג כאן). פריץ: centrifuged בשלבים blastoderm; His2Av-GFP סימני הן את שכבת השומנים אגל (למעלה) גרעינים (באזור רחב מתחת לשכבת רביב).

Discussion

צעדים קריטיים

ודא כי ריכוז אגר גבוה מספיק. אם זה נמוך מדי, אגר יהיה להתפורר במהלך צנטריפוגה, ואת העוברים יתפוצץ או להיות מכוונת באופן אקראי. אם ריכוז אגר הוא רק מעט נמוך מדי או אם אגר הוא רטוב (הסרת יבש מספיק או לא מספיק עודף של TSS בשלב 4.3), העוברים יצוף מתוך החורים שלהם במהלך צנטריפוגה ולהיות מכוונת כראוי. אם אגר הוא שפך דק מדי, זה יהיה גם התמוטטות או סדק במהלך צנטריפוגה.

ודא כי עוברי לא מתקדמים מעבר בשלבים cellularization. אחרת, ההפרדה של אברונים לא יעבוד (איור 5c) מאז האברונים יהיה מוחרם בתוך אלפי תאים בודדים. בשנת עוברים הצעיר בשלב אחד את התא, האברונים חופשיים לנדוד מרחקים גדולים ולצבור לפי צפיפות מאפיין שלהם. כדי למנוע ניתוח עוברים כי הם זקנים מדי, הקפד (i) כולל אוסף מראש כדי לאפשר לנקבות להטיל ביצים הישן (שלב 2.4), (ii) לאסוף עוברים במשך 3 שעות או פחות (שלב 2.5), (iii) ויזואלית לבחור עוברים שלבים לפני cellularization להטבעת לתוך אגר (שלב 4.2), (ד) לשמור על הטבעה זמן קצר כדי למנוע התפתחות עד סוף cellularization (שלב 4.6), ו (v) לבטל את העוברים שלא שכבת נכונה (שלב 5.6) .

לא לקמץ על הזמן צנטריפוגה. למרות שחלק עוברים יראה שכבות נחמד גם אחרי 10 דקות בלבד של צנטריפוגה, ההפרדה אינה עולה בקנה אחד מעובר לעובר. 30 דק 'ספינים לתת תוצאות עקביות מאוד. כמו כן, עוד פעם צנטריפוגה, ככל השכבות יציבים לאחר צנטריפוגה הסתיים. זה חשוב עבור יישומים אלה שבהם זה לוקח זמן לתהליך עוברים עוד לפני השימוש (למשל, אם הם צריכים להיות מעובד לניסויים השתלה או רכוב לניתוח confocal).

שינויים אפשריים

אוסף ביצה הסרת סיסית פרוטוקולים שונים רבים קיימים שלבים 2 ו -3 ^{1, 3, 9,} ו יעבוד כמו גם אלה שתוארו כאן, כל עוד נעשה שימוש בעוברים צעירים, ביצה תשואה גבוהה, את החלק היחסי של אי - עוברים מבוים ממוזער.

Anterior-האחורי יישור הפרוטוקול מכוונת כל כך עוברים את הקצה האחורי קבור אגר ואת הקצה הקדמי הוא מעלה (איור 3). האוריינטציה זה טוב עקביות, כך אפשר להשתמש micropyle כציון דרך אשר בסופו הצביעה במהלך צנטריפוגה (איור 1, 5). עם זאת, בפועל, קל לבחור את הכיוון של עוברי centrifuged על ידי הופעתו שונים של טיפות השומנים שכבות חלמון על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר מכן ניתן יהיה הר עוברים עם צד למעלה; גמישות זה מזרז את תהליך ההרכבה.

צנטריפוגה Unoriented ההיבט ביותר זמן רב מאתגר מבחינה טכנית של הפרוטוקול הוא מקבע את העוברים אגר (שלב 4). זה דורש נוגעים זה עובר פעמיים (פעם אחת כדי להכניס אותו לתוך החור פעם לשחזר אותה לאחר צנטריפוגה). כחלופה, ניתן להעביר עוברים בשלב 4.1 לתוך צינורות microcentrifuge מלא TSS. כאשר אלה הם צינורות centrifuged ב microcentrifuge (13,000 סל"ד, 10-30 דקות), עוברים גם בדרך כלל גם שכבת ^10-13. וריאציה זו מאפשרת לתהליך מאות העוברים באותו זמן מהר מאוד. ואולם, layering אינו עקבי כמו; שבריר של עוברי לא לפתח שכבות נפרדות למרות כוחות צנטריפוגה הרבה יותר גבוה (~ 16000 ז) מאשר ליישם בפרוטוקול לעיל. מאתגר יותר היא העובדה כי הכיוון של עוברים הוא משתנה, ניתן לראות הפרדה בזוויות שונות על ציר מרכזי העובר. השתנות זו דורשת הנסיין לברר לאחר צנטריפוגה איך עובר מסוים הוסדר בצינור צנטריפוגות. עם השימוש autofluorescence החלמון כסמן החלק הכי צפופה של העובר, זה בדרך כלל אפשרי, למרות שזה דורש תרגול הרבה יותר שיקול דעת לעשות את זה אמין. אם יש עוברים מספיק במדגם, אחד עשוי להיות מסוגל למיין את אותם מקרים שבהם עוברים במקרה מסודרים כמו באיור. 1.

צנטריפוגה של עוברים במעטפת ביצה שלהם אפשר להטביע עוברים אגר עבור לשלב 4 מבלי להסיר את סיסית הראשון ^2. בגישה זו, עוברים על הצלחת אוסף מכוסים שמן halocarbon במקום אקונומיקה 50% בשלב 3.2 (halocarbon הופך את שקוף סיסית). עוברים שלבים המתאימים נבחרים ומועברים צלחת אגר חדש באמצעות פינצטה; על ידי תופס רק את החוטים ביצה עם פינצטה, נזקראוי העובר הוא התחמק. עוברים המוטבעים כמו בשלב 4.4 דרך 4.8, עם חוטים ביצה קדמית מזדקרת מתוך החור אגר. הפגז ביצה יוסר על ידי טיפול אקונומיקה 50% לאחר עוברים כבר centrifuged וחפרו מתוך אגר כמו בשלב 5.4. צנטריפוגה בנוכחות הקליפה ביצה עשויה לשפר את שיעור devitellinization לאחר קיבוע (שלב 6.2), אבל הבחירה של השלבים הנכונים עבור צנטריפוגה (שלב 4.2) הוא יותר מאתגר.

יישומים

צנטריפוגה העובר הוא שימושי במיוחד עבור ניסויים colocalization, כלומר, לבדוק אם חלבון מסוים localizes ל אברון מרכזי מסוים. לדוגמה, החלבון קלר קיים מוקדם על טיפות השומנים עובריים, אך לוקליזציה זה מאתגר להפגין עוברים ללא פגע. בחלקו, זה בגלל שתי puncta קלר ואת טיפות השומנים נמצאים בשפע בפריפריה העובר ^10, מה שהופך colocalization מזויף קשה לשלול. עם זאת, צנטריפוגה מתרכז טיפות לתוך שכבת השומנים ברורה, ולכן, colocalization עם האות קלר הופך ברור ^10.

ניתוח דומה הוכיחה באופן חד משמעי לוקליזציה של חלבונים אחרים טיפות השומנים ^{8, 13-15,} כולל דוגמאות מפתיע כמו ההיסטונים מסוימים ² ו במקרים בהם החלבון נמצא בכל מקום בגוף, אך מועשר על טיפות השומנים ^8. כאשר עוברים ניתן לבחור חזותית על ידי השלב ההתפתחותי (שלב 4.2), אפשר גם לזהות גיוס מוסדר מבחינה התפתחותית של חלבונים טיפות השומנים ^{8, 15.} בדיקת colocalization עם טיפות השומנים קל במיוחד מאז טיפות השומנים מצטברים "כובע" מובחנת מבחינה ויזואלית, ולכן אין סמן נוסף או כתם נדרש לזהות את השכבה. למעשה, בגלל הקלות שלה והתוצאות חזותי מרשים בפוטנציה (איור 1, איור. 5 D, E), המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו באופן שגרתי עכשיו מבחן ראשון האם חלבון הוא מועמד מקומי על טיפות השומנים. באופן עקרוני, מחקרים colocalization דומה צריך לעבוד על אברונים אחרים באיור. 1, וסביר עבור אחרים (כולל טפילים תאיים) אשר הפצה עוברים centrifuged טרם תועדו.

מאז צנטריפוגה מתרכז האברונים לתוך להקות חזק, זה מאפשר בידוד של חלק המועשר אברונים אלה. גישה זו כבר בשימוש להתאושש טיפות השומנים להשתלה לעוברי תורם ^2. זה יכול להיות גם אפשרי ביוכימית לנתח את השבר מועשר (למשל, על ידי חיתוך שכבות את העוברים לאחר קיבוע ^15).

השיטה המתוארת כאן יש יישומים מעבר עוברים תסיסנית, כמו צנטריפוגה ניתן להשתמש כדי לרבד את הביצים של מינים שונים (כולל צפרדעים, נמטודות, tunicates, annelids, קיפודי ים, רכיכות, צורבים ו) ^16. במעבדה שלנו, השתמשנו בפרוטוקול לעיל עוברים של Musca זבוב domestica ² יש המועסקים צנטריפוגה unoriented בניתוח של עוברים מן יתוש פטרייה Sciara coprophila ¹⁷ ועל חילזון Ilyanassa obsoleta ^17. לבסוף, שיטה זו אינה מוגבלת עוברי: צנטריפוגה יכולה להיות שימושית גם כדי לרבד תאים גדולים אחרים, כגון ביציות (למשל, תסיסנית ^{2, 18} ו - באג פרח חלבלוב Oncopeltus fasciatus ^17). עבור הדגימה שונה, התנאים צנטריפוגה המדויק צריך להיות מותאם: לדוגמה, 10 דקות ב 3000 גרם די ביעילות לרבד בעוברים של Musca domestica ^2, ואם centrifuged עוד הרבה זמן, העוברים נוטים להתפרק במהלך קיבוע ו immunostaining.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes		Becton Dickinson	#35-1007	From Falcon
Wire mesh		Small Parts	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles		Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder		Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages		Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27		Sigma	H8773