En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

Resumen

Se describe un método para separar los orgánulos de la densidad en la vida Drosophila Embriones. Los embriones están inmersos en agar y se centrifuga. Esta técnica produce la separación reproducible de los organelos importantes a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Este método facilita la colocalización experimentos y las fracciones de los rendimientos de orgánulos para el análisis bioquímico y experimentos de trasplante.

Resumen

Una estrategia importante para la purificación y aislamiento de los diferentes tipos de organelos intracelulares es separarlos unos de otros sobre la base de diferencias en la densidad de flotación. Sin embargo, cuando las células se rompen antes de la centrifugación, las proteínas y orgánulos en este entorno no-nativos a menudo inadecuadamente pegan unas a otras. Aquí se describe un método para separar organelos por la densidad de intacto, viviendo embriones de Drosophila. Principios de los embriones antes de cellularization se cosechan a partir de las jaulas de la población, y sus cáscaras de huevo exterior se eliminan mediante el tratamiento con 50% de lejía. Los embriones se transfieren a una placa de agar pequeña y se inserta, extremo posterior en primer lugar, en pequeños agujeros verticales en el agar. Las placas que contienen embriones incrustado se centrifugan durante 30 min a 3000g. El agar soporta los embriones y los mantiene en una orientación definida. Posteriormente, los embriones son extraídos del agar con una aguja de punta roma.

Centrifugación separa orgánulos importantes en distintas capas, una estratificación fácilmente visible por el microscopio de campo brillante. Una serie de marcadores fluorescentes están disponibles para confirmar la estratificación éxito en embriones vivos. Proteínas asociadas con ciertos orgánulos se verá enriquecido en una capa de concreto, lo que demuestra colocalización. Las capas individuales pueden ser recuperados para su análisis bioquímicos o trasplante en la donación de óvulos. Esta técnica es aplicable para la separación de orgánulos en otras células grandes, incluyendo los huevos y los ovocitos de diversas especies.

Protocolo

1) Preparación de las placas de agar

Descripción: Este protocolo emplea placas de agar para dos usos distintos. En primer lugar, las placas de agar sirven como superficie de recolección de huevos, jugo de manzana en el agar estimula la puesta de huevos. En segundo lugar, los embriones incrustado en el agar se llevan a cabo en una orientación fija cuando las placas se centrifugan, una concentración suficiente de agar es necesaria para evitar las placas de la desintegración durante la centrifugación. Por razones de simplicidad, un solo tipo de agar jugo de manzana se utiliza para ambos usos.

Materiales

• Agar (25 g)
• Sacarosa (25 g)
• Jugo de manzana (250 ml)
• Nipagin M solución madre (5 g metil-p-hidroxi-benzoato en 50 ml de etanol), actúa como un conservante
• Petri: por centrifugación (60x15mm) y para la recolección de huevos (60x15 mm o 100x15, en función de las jaulas de vuelo utilizado en el paso 2)

Equipo

• Plato caliente
• Dos matraces

1. En un erlenmeyer, se combinan 25 g de agar y 750 ml de dH ₂ O. Autoclave durante 50 minutos en el ciclo de líquidos. Mientras tanto, prepare la solución de jugo de manzana (paso 1.2).
2. En otro erlenmeyer, se combinan 25 g de sacarosa y 250 ml de jugo de manzana. Calor en la placa caliente (a unos 55 ° C) para disolver la sacarosa. A continuación, agregar 15 ml de solución Nipagin M. Evite las temperaturas más altas, ya que podrían causar Nipagin a descomponerse.
3. Una vez que la solución de agar se ha enfriado lo suficiente que el frasco puede ser manejado por la mano, se combinan las dos soluciones y mezclar bien. Mezcle en un plato caliente hasta que esté bien mezclado.
4. Vierta la solución en placas de Petri (~ 0,5 cm de alto). 1 litro de solución es suficiente para unos pequeños 100 (60 mm de diámetro) o 40 grandes (100 mm de diámetro) platos.
5. Placas de agar debe secar durante varias horas o toda la noche a temperatura ambiente, de lo contrario será demasiado húmeda para su uso. Para almacenamiento a largo plazo, mantenerlos envueltos (en contenedores de plástico o fundas placa de Petri) a 4 ° C.

2) La recolección de embriones

Resumen: Durante las primeras 3 horas de desarrollo (a temperatura ambiente), los embriones de Drosophila son células individuales (sin contar a los precursores de la línea germinal, las células polo posterior situado). Cuando los embriones orientación correcta de estas etapas se centrifugan, los orgánulos principales separadas por la densidad a lo largo del eje longitudinal del huevo. En la etapa de cellularization, esta célula grande se convierte en miles de pequeñas células, las fuerzas de centrifugación empleados no se rompa estas células. Para la segregación de éxito de los orgánulos más importantes, por lo que es fundamental para centrífuga de embriones que aún no han completado cellularization.

Materiales

• Manzana placas de agar jugo
• Pasta de levadura (levadura seca mezclada con agua a la consistencia de mantequilla de maní)

Equipo

• Volar jaulas: el mercado (ver abajo) o de fabricación casera ¹

1. Las moscas adultas se mantienen en jaulas a las que las placas de agar jugo de manzana se fijan en la parte inferior. Use un tamaño de platos Petri adecuado para las jaulas en uso.
2. Para iniciar una recolección de huevos, preparar un jugo de manzana fresca placa de agar y cubrir una porción de pasta de levadura. Moscas de la fruta comer levadura, en particular, la levadura proporciona la nutrición para la producción de huevos. La presencia de la levadura y jugo de manzana en el agar también induce la puesta de huevos.
3. Para el intercambio de lo viejo con lo nuevo placa de agar, la jaula de vuelo se invierte y se golpeó la mesa de trabajo un par de veces. Las moscas se caen al fondo y están desorientados brevemente. Eso te da unos segundos para eliminar de forma rápida una placa de agar y reemplazarlo con uno nuevo. Este cambio requiere cierta práctica, y los detalles dependen del tipo de caja empleada.
4. Mujer moscas almacenan el semen de cruces anteriores en las bolsas internas (espermatecas) de los cuales el esperma es liberado para permitir la fecundación de los huevos. Cuando esté bien alimentado y sin molestias, las hembras ponen los huevos, poco después de la fecundación, y por lo tanto el momento de la puesta de huevos marca el momento de la fecundación y el inicio del desarrollo. Cuando las condiciones no son óptimas, las hembras tienen huevos para tiempos variables antes de la colocación. Para reducir al mínimo el número de esas misiones etapas embriones, es aconsejable descartar la primera colección de la jornada laboral (un "pre-colección" de 30 a 60 minutos es suficiente). La presencia de la levadura fresca induce a las hembras para poner los huevos cabo, y las colecciones posteriores de huevos tienden a estar dominados por los huevos depositados en breve después de la fecundación.
5. Recoger los huevos de hasta 3 horas, dependiendo de lo que se desea etapa embrionaria. Ya que en cellularization temperatura ambiente se completa después de aproximadamente 3,5 horas, ya veces de recolección no son útiles. Capas más consistente se logra en los embriones jóvenes, por lo que para los experimentos de rutina estamos a favor de tiempos más cortos de la colección (1 hro menos).
6. A veces, las moscas se atascan a la levadura oa la superficie de la placa de agar. Eliminar con pinzas.

3) Eliminación de la cáscara del huevo de los embriones

Resumen: embriones de Drosophila están cubiertos por dos capas de protección: una capa externa (corion) hace de la proteína y una capa interna (membrana vitelina) predominantemente hechas de cera. Que proteger al embrión contra los insultos y la desecación mecánica. El corion tiene dos extensiones (los filamentos de huevo o apéndices dorsales) que son fácilmente visibles como estructuras distintas. En este paso, vamos a eliminar el corion de los huevos en remojo en el 50% de lejía. Una vez que el corion se retira, el embrión se vuelve transparente a la luz de transmisión, que permite la selección de las fases embrionarias específicas para la centrifugación. A medida que el corion también podría interferir con muchos centrifugación posterior a los procedimientos (por ejemplo, la fijación en el paso 6), la eliminación del corion ahora permitirá un rápido procesamiento posterior.

El tratamiento con lejía al 50% se disolverá el corion en pocos minutos, sin embargo, no hace daño al embrión. La membrana vitelina mantiene a lejía. Vamos a continuar con el tratamiento con lejía hasta que los filamentos de huevos ya no son visibles. Después, separarán a los embriones de la cloro mediante el vertido de la mezcla de embriones / cloro a través de un tamiz pequeño (una cesta de malla de alambre). Es muy importante no apresurar el paso de la exposición de cloro. Si el cloro se lava antes de tiempo, los pasos posteriores (por ejemplo, la eliminación de la fijación de la membrana vitelina siguiente) podría verse comprometida.

Materiales:

• Botella con atomizador con 50% de lejía (un volumen dH ₂ O para blanquear un volumen comercial)
• Botella con atomizador con dH ₂ O
• Toallas de papel

Equipos:

• Canastas de alambre hechas en casa hechas de láminas de malla de alambre de acero inoxidable. Para hacer cestas, cortar cuadrados de aproximadamente 2 x 2 cm de la hoja plana y guión en el medio.
• Pinzas para las cestas de alambre
• Microscopio de disección establecido para la transiluminación

1. Coloque la placa de agar en un microscopio y observar a los embriones por transiluminación. Asegúrese de identificar los filamentos de huevo (véase la Figura 2A).
2. Squirt cloro al 50% en la placa de agar, que cubre los embriones. Agite la placa de agar de vez en cuando a girar en torno a los embriones en el blanqueador.
3. Una vez que los filamentos de huevos ya no son visibles (por lo general después de 3-5 minutos, pero los tiempos pueden variar), el corion se ha eliminado con éxito.
4. En el siguiente paso, una cesta de malla de alambre se utiliza como tamiz para separar los embriones de la lejía. Coge la cesta de alambre con pinzas y mantenlo sobre la cubierta invertida de la placa de agar. La cubierta servirá para contener el goteo de la lejía a través de la malla de alambre.
5. Vierta la mezcla de cloro / embrión a partir de la placa de agar a través de la malla de alambre.
6. Si un número significativo de embriones permanecen en la placa de agar, chorro dH ₂ O en el plato y verter la mezcla dH ₂ O / embrión a través de la malla de alambre. Si un número significativo de los embriones se vierta en la reserva, verter el contenido depósito a través de la malla de alambre.
7. Toque el fondo de la malla de alambre a una toalla de papel para borrar lejos el exceso de líquido. Luego chorro dH ₂ O en la malla de alambre para enjuagar cloro restante. Como se describió anteriormente, la placa de la cubierta se puede utilizar como reservorio para recuperar los embriones accidentalmente lavada. Usted puede reducir al mínimo pérdida de embriones, señalando el flujo de agua de la botella con atomizador a lo largo del perímetro de la cesta de alambre. Con frecuencia blot el exceso de líquido.
8. Repita este paso de lavado cinco a diez veces, hasta que todos los lejía se ha eliminado. Si la cesta de alambre aún huele a cloro, el lavado debe continuar.

Embriones 4) de montaje en agar

Descripción: Los huevos de Drosophila son mucho más largos (~ 500 m) de ancho (~ 180 m). Para obtener la separación máxima y constante de los orgánulos durante la centrifugación, que los embriones orientar de tal manera que su punto extremo anterior hacia el centro de rotación (Figura 1, 3). De esta manera, el más ligero de estructuras intracelulares (las gotas de lípidos) se acumulan en el extremo anterior en todos los embriones, mientras que las estructuras muy densas (componentes de la yema) se acumulan cerca del extremo posterior. Los embriones se insertan en pequeños agujeros verticales en agar jugo de manzana, con los extremos anterior hacia arriba. El agar mantiene el embrión en una orientación fija durante la centrifugación.

Equipos:

• Porta-agujas
• Agujas de tungsteno, las agujas se montan en el soporte hacia atrás desde la orientación típica, de modo que el extremo romo sobresale y está disponible para manipular a los embriones
• P200 pipeta
• Microscopio de disección establecido para transillumination
• Volar cepillo (pincel pequeño utilizado para clasificar los adultos Drosophila)

Materiales:

• Triton Solución salina (TSS): 4 g de NaCl, 0,3 ml de Triton X-100, se llenan de _ddH2O a 1000 ml (se puede hacer como una solución madre 10 veces)

1. Lavado de embriones de la canasta de alambre con servicios de apoyo técnico y en una placa de Petri vacía. Los embriones se hunden hasta el fondo. La transferencia de la placa de Petri que contiene los embriones en el TSS en un microscopio de disección y observa por transiluminación (embriones serán similares a los descritos en la Figura 4).
2. Utilizando una pipeta P200, seleccione los embriones de etapas deseado y transferirlos a una pequeña placa de agar. Etapas específicas pueden ser fácilmente reconocidas visualmente (Figura 4, para más detalles, ver ^1). Trabaje con rapidez ya que los embriones son el envejecimiento y la inmersión prolongada (más de 30 minutos) en TSS puede afectar el desarrollo.
3. Eliminar la mayoría de los servicios de apoyo técnico con una pipeta y un Kimwipe. La superficie del agar debe estar ligeramente húmedo que hace que sea más fácil de empujar alrededor de embriones. Sin embargo, no debe haber charcos de líquido que queda en cualquier lugar de la placa ya que el exceso de líquido durante la centrifugación hará que los embriones se deslice fuera de los agujeros.
4. Usando una aguja, hacer agujeros verticales en el agar cerca de donde se encuentra un embrión. Es difícil hacer agujeros que son perfectamente verticales, porque tienes que mantener la aguja en un ángulo para poder ver al mismo tiempo bajo el microscopio. Un menor inclinación de la aguja es realmente ventajoso, porque esto crea una ligera depresión / arboleda en un lado del agujero para que el embrión se desliza fácilmente a lo largo de ella y en el agujero. Es suficiente para perforar la superficie del agar agar ya que el es lo suficientemente suave que una vez que un embrión es parcialmente insertado en un agujero que puede ser empujado en más sin sufrir daños.
5. Asegúrese de que reconozca los extremos anterior y posterior de los embriones, ya que los embriones deben ser empujados hacia los agujeros de una orientación coherente, por lo general con el extremo anterior hasta. La membrana vitelina en el extremo anterior se caracteriza por una estructura especializada, el micrópilo (Figura 2), a través del cual el esperma se introduce durante la fertilización.
6. Con el extremo romo de la aguja, se puede empujar el embrión se mueve a lo largo del agar y orientar / maniobrar su extremo posterior hacia un agujero perforado. Luego empuje contra la parte anterior hacia el agujero. Esta facilidad debe deslizarse el embrión en el agujero a lo largo de la ligera depresión generados durante la perforación. A medida que el embrión se inclina hacia arriba, empujar más abajo en el agujero.
7. Cuando esté totalmente pulsado, el embrión es por lo general ya está bastante vertical. Si no, puede alinear el embrión inserta más vertical pulsando sobre ella de lado. Si el agujero no es demasiado grande, la posición del embrión se forma estable en poder del agar a lo largo de la centrifugación.
8. Con la práctica, es posible integrar 100-250 embriones por placa. Esto dependerá de la aplicación particular cuántos son necesarios: Si los embriones se usan para obtener imágenes en vivo o como donantes para los experimentos de trasplante, sólo se requieren unos pocos. Si los embriones deben ser fijos y immunostained, una fracción se pierde durante el proceso posterior a la centrifugación, y uno tiene que empezar con los números más altos. Tenga en cuenta que los embriones continúan desarrollándose durante el montaje de modo que si una etapa de desarrollo que se desea reducir el tiempo total para las necesidades de montaje a ser corta.
9. Si no hay ninguna cantidad de embriones que no fueron incorporados, sacarlos de la placa con un pincel humedecido volar. Sumerja el cepillo volar en un líquido (por ejemplo, 1xTSS), limpie cuidadosamente en la parte superior de la placa (mientras se ve bajo el microscopio de disección) para barrer los embriones sobrantes, y lavar los embriones de la brocha por inmersión de la brocha en el líquido otra vez.

5) la centrifugación y la recuperación de embriones

Resumen: Las placas se transfieren a baldes balanceo de un Sorvall RT7 Además centrífuga y se centrifuga durante 30 minutos a 4000 rpm, lo que corresponde a ~ 3.000 g. Después de la centrifugación, las placas están cubiertas con servicios de apoyo técnico. Con una aguja, los embriones se extraen de los agujeros en el agar y se transfieren a los recipientes adecuados a través de una pipeta.

Equipos:

• Porta-agujas con una aguja (como antes)
• Sorvall RT7 Plus con RTH750 rotor y cubos de balanceo, o su equivalente ²
• Microscopio de disección establecido para la transiluminación
• P200 pipeta

Materiales:

• TSS

1. Transferencia de las placas de los cubos de balanceo de un lado centrífuga agar, hacia abajo. Asegúrese de centrífuga está equilibrada.
2. Configuración de centrifugación: temperatura = 10.4 ° C, rpm = 4000, tiempo = 30 min.
3. Después de la centrifugación, la placa de agar a cabo bajo la lupa una vez más y cubrir la placa con una capa de servicios de apoyo técnico.
4. Uso de la bLunt final de la aguja, cavar los embriones de sus agujeros. Ellos flotan en el TSS, pero se mantendrá sumergido.
5. Los embriones se parecen, obviamente, en capas, con una gorra de color marrón en el extremo anterior, una región central clara, y una zona oscura, gris en el extremo posterior (Figura 2, 5A). Desechar los embriones que no se presentan capas distintas.
6. Utilizando una pipeta P200, la transferencia de los embriones y capas de servicios de apoyo técnico a un nuevo buque, por ejemplo, un vial de centelleo o un tubo de microcentrífuga, dependiendo de la aplicación.

6) el tratamiento posterior

Dependiendo de la aplicación, los embriones serán tratados posteriormente de diversas maneras.

1. Para la observación directa al microscopio de campo claro o de epifluorescencia, los embriones se transfieren en un tampón a un portaobjetos de vidrio, y montado en un 22x22 mm # 1.5 cubreobjetos, con 18x18 mm # 1 cubreobjetos como separadores. De observaciones a largo plazo, puede ser necesario cambiar el tampón con el aceite de halocarbonos 27.
2. Si los embriones se van a determinar, deberán ser transferidos en el paso de 5,6 a un vial de centelleo. A continuación, se puede fijar usando técnicas estándar de fijación ^1. Estas técnicas suelen emplear la agitación en una emulsión de metanol-heptano para quitar la membrana vitelina. Tenga en cuenta que los embriones se centrifuga la eficiencia de este paso devitellinization es baja. Por tanto, es aconsejable comenzar con los embriones como muchos como sea posible, o eliminar la membrana vitelina manualmente ^1.
3. Si los embriones serán utilizados en los experimentos de trasplante (por ejemplo, para quitar una capa de concreto orgánulo de los embriones centrifugada), que se transfieren a placas de agar y se montaron en cubreobjetos, utilizando los métodos convencionales como para los embriones sin centrifugar ^3. La estratificación inducida por centrifugación es estable durante unos diez minutos.

7) Los resultados representativos

Si la centrifugación funcionó como se esperaba, los orgánulos embrionarias importantes que resolver por la densidad ^2. Por ejemplo, las gotitas de lípidos de baja densidad se acumula en el extremo anterior, las vesículas de alta densidad de la yema se acumulan en el extremo posterior (Figura 1, 2). Las gotas de lípidos y de las vesículas yema son orgánulos de almacenamiento de lípidos y de proteínas.

La confirmación de la densidad dependiente de estratificación se realiza mediante inspección visual de los embriones vivos por transiluminación bajo un microscopio de disección o compuesto. Los embriones deben aparecer como en la Figura 5: Las gotas de lípidos se forma una capa de sólido de color marrón en la punta anterior (un "tope de lípidos"), la acumulación de yema se traducirá en una zona gris oscuro en el extremo posterior. Estas dos capas oscuras son separados por una amplia zona clara que representa a otros orgánulos y el citoplasma. Si los embriones se centrifugan después cellularization, la estratificación será mínimo (Figura 5).

Si un microscopio de epifluorescencia está disponible, los vivos, embriones de centrifugado se puede examinar bajo excitación UV. En estas condiciones, la yema muestra autofluorescencia azul intenso (Figura 5). Una capa compacta de material autofluorescentes en el polo posterior centrifugación indica éxito y sirve como un marcador para el extremo posterior.

Tenga en cuenta que la aparición de estas capas va a cambiar drásticamente si los embriones son fijos. Por ejemplo, cuando los embriones son fijados por la fijación de estándares de calor o formaldehído seguido de devitellinization heptano-metanol ^1, las gotas de lípidos se vuelven translúcidas y la capa lipídica aparece blanquecina y esponjosa por microscopía de luz brillante, en lugar de color marrón oscuro (Figura 5D). Yema de autofluorescencia es parcial o totalmente destruidas por la fijación, llegando a ser mucho menos intensa o incluso indetectables.

Si en vivo centrifugación se emplea para resaltar una en particular orgánulo, es útil a la etiqueta que orgánulo con un marcador fluorescente para su confirmación. Por ejemplo, las proteínas de fusión YFP dirigidos a la mitocondria, la sala de emergencias o el aparato de Golgi se han descrito ^4. En los embriones de centrifugado, estos marcadores se acumulan en posiciones características a lo largo del eje antero-posterior (Figura 1). Por último, ciertas proteínas de fusión de histonas localizar tanto a los núcleos de las gotas de lípidos y ^2, y por lo tanto puede ser utilizado para marcar los compartimentos celulares (Figura 5 E, F), así como para supervisar la etapa del embrión (por el número de núcleos marcados) . Cepas volar expresar los marcadores mencionados en este párrafo están disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/). Para H2Av histonas, las dos variantes de GFP y mRFP están disponibles ^{5, 6}

Figura 1. Separación de los orgánulos por centrifugación (modificado después de ^2). Centrifugación de los resultados de embriones orientadas en la estratificación de distintas(La luz). Orgánulos importantes se acumulan en posiciones características a lo largo de la anterior (hasta) - posterior (hacia abajo) del eje: las gotas de lípidos (detectado en embriones fijados por el Nilo tinción con rojo); retículo endoplásmico, Golgi, mitocondrias y (detectado en embriones vivos a través de los marcadores de YFP se describe en el el texto principal), yema de huevo (detectado por autofluorescencia). Las imágenes de fluorescencia fueron adquiridas por microscopía confocal.

Figura 2. Representación esquemática de los embriones.

A. huevo con la cáscara del huevo y los filamentos de huevo prominentes (apéndices dorsales). Como la cáscara del huevo no es transparente, el huevo aparece oscuro uniforme.

B. huevo con corion eliminado. En el extremo anterior (izquierda), el micrópilo es visible. Dependiendo de la etapa de desarrollo, el embrión dentro de la membrana vitelina aparecerá de manera uniforme de color marrón oscuro o mostrar varias estructuras. Ver Figura 4 para los ejemplos.

C. Centrifugado embrión, orientado al igual que en el protocolo descrito aquí. Las gotas de lípidos se acumulan como un marrón "tope" al final micrópilo; yema forma una capa gris en o cerca del extremo opuesto.

Figura 3. Descripción esquemática del procedimiento. Izquierda: Los embriones sin corion se colocan en la parte superior de una placa de agar y la empujó con una aguja en los orificios en el agar. Este montaje da lugar a una orientación coherente de todos los embriones, con el anterior termina. Derecha: Después de la centrifugación, los embriones se estratifican. Agar se superpone con la TSS (azul), y los embriones se recuperan del agar con la aguja. Una vez suspendida en el SAT, los embriones pueden ser recogidos con una pipeta.

Figura 4. Brillante luz de las imágenes de la vida embriones de Drosophila, de forma similar a cómo van a aparecer en el paso 4.1. Los embriones se muestran en la orientación estándar: extremo anterior al extremo izquierdo, posterior al acceso a la derecha, la parte dorsal y parte ventral hacia abajo. Una película de lapso de tiempo de la embriogénesis temprana está disponible como parte del vídeo que acompaña a este protocolo.

A. embriones estadio de división aparecen de color marrón uniforme. Etapas de este tipo son ideales para in-vivo centrifugación.

B. Blastodermo embriones tienen un borde claro que es similar en todos los lados. Esta periferia claro es, en parte debido a la acumulación de los núcleos en la membrana plasmática y en parte debido al transporte hacia el interior de las vesículas yema de huevo y gotas de lípidos ^7. Esta claro periferia se expande hasta cerca del final de cellularization ^1. Embriones todavía puede ser con éxito estratificado por centrifugación hasta el final de cellularization ^8, aunque la estratificación de la yema y los núcleos no es tan consistente como en las etapas división.

C. Después de cellularization, los embriones parecen asimétricos, las partes dorsal y ventral a ser diferentes, y desarrollar varios dobleces. El embrión que se muestra es a principios de gérmenes banda de extensión. En estas etapas, la centrifugación ya no es eficaz en la estratificación de los orgánulos más importantes.

Figura 5. Embriones centrifugado. Todos los embriones en esta figura se centrifuga con su extremo anterior y se muestran en esa orientación.

A. luz brillante imagen de un embrión con éxito se centrifuga. Una capa de color marrón en el extremo anterior se debe a la acumulación de lípidos-gota. Una amplia capa gris cerca del extremo posterior se debe a las vesículas yema de huevo. Con frecuencia hay una zona clara debajo de la capa de yema de huevo, de origen desconocido. Una zona de color amarillento a menudo se manifiesta sobre la capa de yema, que probablemente representa a las mitocondrias. Las proteínas solubles se encuentran a lo largo de la capa transparente entre las gotas de lípidos y la yema de ^2.

B. El embrión en una vista por microscopía de epifluorescencia bajo excitación UV. El azul característico autofluorescencia de yema de huevo ayuda a identificar el extremo posterior.

Embrión C. centrifugada durante la extensión de gérmenes banda, es decir, después de cellularization. Yema todavía se pueden acumular en el extremo posterior, pero por lo demás capas es mínimo.

D. estratificado con éxito embriones, después de la fijación de calor. La capa de lípidos gota aparece en color blanco y esponjoso, en lugar de color marrón oscuro, como en los embriones no fijadas (A).

E. y F. embriones expresar His2Av-GFP y la imagen por microscopía confocal (modificado de ^2). E: centrifugado en las etapas de su desdoblamiento; His2Av-GFP parece marcar sólo la capa de lípidos gota ya pocos núcleos están formados por este momento. Dependiendo del plano focal, los núcleos pueden ser visibles justo debajo de la capa de gota (no mostrado aquí). F: centrifuga a etapas blastodermo; His2Av-GFP marca tanto la capa de lípidos gota (arriba) y el núcleo (en una amplia zona debajo de la capa de gota).

Discusión

Los pasos críticos

Asegúrese de que la concentración de agar es lo suficientemente alto. Si es demasiado baja, el agar se desintegra durante la centrifugación, y los embriones va a estallar o ser orientadas al azar. Si la concentración de agar es sólo un poco demasiado bajo o si el agar es húmeda (extracción suficientemente seca o insuficiente de los servicios de apoyo técnico en exceso en el paso 4.3), los embriones se saldrán de sus agujeros durante la centrifugación y se convierten en mal orientada. Si el agar se vierte demasiado fino, también se derrumbará o crack durante el centrifugado.

Asegúrese de que los embriones no han avanzado más allá de las etapas cellularization. De lo contrario, la separación de los orgánulos no va a funcionar (Fig. 5C), ya que se convertirá en orgánulos secuestrado dentro de miles de células individuales. En los embriones más jóvenes en la etapa de célula, los orgánulos son libres para migrar grandes distancias y se acumulan de acuerdo a su densidad característica. Para evitar el análisis de embriones que son demasiado viejos, asegúrese de que (i) incluye una colección pre-para permitir que las hembras para depositar sus huevos viejos (paso 2.4), (ii) recoger los embriones durante 3 horas o menos (paso 2.5), (iii) seleccionar visualmente los embriones antes de las etapas cellularization para integrarse en agar (paso 4.2), (iv) mantener incorporación de corto tiempo para prevenir el desarrollo hasta el final de cellularization (paso 4.6), y (v) desechar los embriones que no la capa de forma correcta (paso 5.6) .

No escatime en el tiempo de centrifugación. Aunque algunos de los embriones muestran capas bien incluso después de sólo 10 minutos de centrifugación, la separación no es coherente desde el embrión al embrión. 30 vueltas min dar resultados muy consistentes. Además, cuanto mayor sea el tiempo de centrifugación, el más largo de las capas se mantienen estables después de la centrifugación ha terminado. Esto es importante para aquellas aplicaciones en las que se necesita tiempo para procesar los embriones más antes de su uso (por ejemplo, si es que necesitan ser procesados ​​para los experimentos de trasplante o montados para el análisis confocal).

Posibles modificaciones

Recolección de huevos y eliminación de los diferentes protocolos de corion existen muchos de los pasos 2 y 3 ^{1, 3, 9,} y el trabajo, así como los aquí descritos, siempre y cuando los embriones utilizados son los jóvenes, la producción de huevo es alta, y la fracción del mis- embriones escena se reduce al mínimo.

Antero-posterior alineamiento El protocolo orienta todos los embriones de tal manera que el extremo posterior está enterrado en el agar y el extremo anterior es hacia arriba (Fig. 3). Esta orientación es buena para mantener la coherencia, de modo que es posible utilizar el micrópilo como un hito que terminan apuntando hacia arriba durante la centrifugación (Fig. 1, 5). Sin embargo, con la práctica, es fácil detectar la orientación de los embriones de centrifugado por la aparición de los distintos lípidos gota y las capas de yema de huevo por el microscopio de campo brillante. Entonces se convierte en la posibilidad de montar los embriones, ya sea con terminar, esta flexibilidad se acelera el proceso de montaje.

Centrifugación desorientada El aspecto más tiempo y es técnicamente desafiante del protocolo es el montaje de los embriones en agar (paso 4). Se requiere tocar cada embrión en dos ocasiones (una vez que lo inserte en el agujero y una vez que se recuperan después de centrifugación). Como alternativa, se puede transferir los embriones en el paso 4.1 en tubos de microcentrífuga lleno de TSS. Cuando estos tubos se centrifugan en una microcentrífuga (13.000 rpm, 10-30 min), los embriones también suelen capa y ^10-13. Esta variación permite procesar cientos de embriones a la vez muy rápidamente. Sin embargo, la estratificación no es tan consistente, una fracción de los embriones no se desarrolla de distintas capas a pesar de las fuerzas de centrifugación mucho mayor (~ 16 000 g) que aplica en el protocolo anterior. Más problemático es el hecho de que la orientación de los embriones es variable, y se puede observar la separación en distintos ángulos con respecto al eje principal del embrión. Esta variabilidad requiere el investigador para clasificar después de la centrifugación como un embrión en particular, se organizó en el tubo de centrífuga. Con el uso de la autofluorescencia yema como un marcador para la parte más densa del embrión, esto es a menudo posible, aunque requiere mucha práctica y más juicio para hacerlo de forma fiable. Si hay embriones suficiente en la muestra, uno puede ser capaz de resolver los casos en que los embriones que pasó a ser dispuestos como en la figura. 1.

Centrifugación de los embriones en su cáscara de huevo es posible incluir los embriones en agar para el paso 4 sin necesidad de retirar el corion ² primeros. En este enfoque, los embriones en la placa de la colección están cubiertos con aceite de halocarbonos en lugar de 50% de lejía en el paso 3.2 (halocarbonos se vuelve transparente el corion). Embriones de las etapas apropiadas se seleccionan y se transfieren a una placa de agar con unas pinzas nuevas, sólo por el acaparamiento de los filamentos de huevo con las pinzas, el daño ael embrión adecuado se evita. Los embriones están inmersos en el paso 4.4 hasta 4.8, con los filamentos de huevo anterior que sobresale de el agujero en el agar. La cáscara del huevo se elimina por tratamiento con lejía al 50% después de que los embriones han sido centrifugado y excavado en el agar como en el paso 5.4. Centrifugación en presencia de la cáscara de huevo puede mejorar la tasa de devitellinization después de la fijación (paso 6.2), pero la selección de las etapas de centrifugación correcta (paso 4.2) es más difícil.

Aplicaciones

Centrifugación embrión es particularmente útil para los experimentos de colocalización, es decir, para probar si una proteína se localiza en un determinado orgánulos más importantes. Por ejemplo, la proteína está presente en Klar principios de gotas de lípidos embrionarias, sin embargo, esta localización es difícil de demostrar en los embriones intactos. En parte, esto se debe a que tanto Klar puntos lagrimales y las gotas de lípidos son abundantes en la periferia del embrión ^10, por lo que colocalización duro para descartar falsos. Sin embargo, la centrifugación concentra las gotas de lípidos en una capa distinta, y por lo tanto, colocalización con la señal de Klar se hace evidente ^10.

Un análisis similar se ha demostrado de manera inequívoca la localización de las otras proteínas a ⁸ gotas de ^{lípidos, 13-15,} con ejemplos sorprendentes como las histonas ciertos ² y en los casos en que una proteína está presente por doquier, pero enriquecido por las gotas de lípidos ^8. Los embriones se pueden seleccionar visualmente la etapa de desarrollo (paso 4.2), es posible la determinación de la contratación desarrollo regulado de proteínas a ⁸ gotas de ^{lípidos, 15.} Las pruebas de colocalización con las gotas de lípidos es muy fácil, ya que las gotas de lípidos se acumulan en una diferencia visual de "tope", por lo que ningún marcador más o mancha se requiere para identificar a esta capa. De hecho, debido a su facilidad y resultados visuales potencialmente sorprendentes (Fig. 1, fig. 5 D, E), el laboratorio emplea esta técnica de manera rutinaria como la primera prueba si un candidato proteína se localiza en las gotas de lípidos. En principio, los estudios similares colocalización debe trabajar para los orgánulos que se muestran en la figura. 1, y es probable que para otros (incluyendo parásitos intracelulares), cuya distribución en los embriones de centrifugado aún no se ha documentado.

Desde la centrifugación se concentra en los organelos bandas apretadas, que facilita el aislamiento de una fracción enriquecida en estos orgánulos. Este enfoque ya ha sido utilizado para recuperar las gotas de lípidos para el trasplante en ^dos embriones de donantes. También puede ser posible analizar bioquímicamente la fracción enriquecida (por ejemplo, mediante la reducción de las capas de embriones después de la fijación ^15).

El método descrito aquí tiene aplicaciones más allá de embriones de Drosophila, como la centrifugación puede ser usado para estratificar a los huevos de diferentes especies (incluyendo ranas, nematodos, tunicados, anélidos, erizos de mar, moluscos, cnidarios y) ^16. En nuestro propio laboratorio, se ha utilizado el protocolo anterior para los embriones de la mosca doméstica Musca domestica ² y han utilizado la centrifugación no orientado en el análisis de los embriones de los hongos mosquito Sciara coprophila ¹⁷ y el caracol Ilyanassa obsoleta ^17. Finalmente, este método no se limita a los embriones: La centrifugación también puede ser útil para estratificar a otras células grandes, como los ovocitos (por ejemplo, en Drosophila ^{2, 18} y el algodoncillo error Oncopeltus fasciatus ^17). Para el modelo diferentes, las condiciones de centrifugación exacta necesita ser optimizado: Por ejemplo, 10 minutos a 3000 g es suficiente para estratificar de manera eficiente los embriones de Musca domestica ^2, y si se centrifuga mucho más tiempo, los embriones tienden a separarse durante la fijación y tinción.

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes		Becton Dickinson	#35-1007	From Falcon
Wire mesh		Small Parts	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles		Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder		Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages		Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27		Sigma	H8773