In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

Özet

Biz yaşayan organelleri yoğunluğu ile ayrı bir metodu tanımlar Drosophila Embriyolar gibi. Embriyolar agar gömülü ve santrifüj. Bu teknik, ön-arka embriyo eksen boyunca büyük organellerin tekrarlanabilir ayrılığı ortaya çıkarır. Bu yöntem, biyokimyasal analiz ve nakli deneyleri için ko deney ve verim organel kesirler kolaylaştırır.

Özet

Batmaz yoğunluğu farklılıkları onları birbirinden ayırmak için farklı tipte hücre içi organelleri arındırıcı ve izole etmek için önemli bir strateji. Ancak, hücreler santrifüj, proteinler ve yerli olmayan bu ortamda organelleri önce kesintiye çoğu zaman uygunsuz birbirine yapışmaz. Burada, ayrı organelleri sağlam yaşayan Drosophila embriyolar yoğunluk bir metodu tanımlar . Cellularization önce Erken embriyoların nüfus kafeslerden hasat edilir ve dış yumurta kabukları,% 50 çamaşır suyu ile tedavi kaldırılır. Embriyolar sonra agar küçük dikey deliklere, ilk önce küçük bir agar plaka ve eklenen arka sonuna aktarılır. Gömülü embriyoları içeren plakalar 3000g az 30 dakika süreyle santrifüj. Agar embriyoların destekler ve belirli bir yönde tutmaktadır. Daha sonra, embriyolar agar künt bir iğne ile çıkardı.

Santrifüj bir tabakalaşma parlak alan mikroskobu ile kolayca görülebilir, farklı katmanlar halinde büyük organelleri ayırır. Floresan belirteçlerin bir dizi canlı embriyolarının başarılı tabakalaşma onaylamak için kullanılabilir. Proteinler belli organelleri ile ilgili ko gösteren belirli bir tabaka güçleniyor. Bireysel katmanlar, donör yumurta içine biyokimyasal analiz veya transplantasyon için telafi edilebilir. Bu teknik, farklı türlerin yumurta ve oosit dahil olmak üzere diğer büyük hücre, organel ayrımı için geçerlidir.

Protokol

1) agar plaklarına hazırlanması

Bakış: Bu protokol, iki farklı kullanımlar için agar plaklarına kullanmaktadır . İlk olarak, agar plaklarına yumurta toplama yüzey olarak hizmet agar elma suyu, yumurtlama uyarır. İkincisi, agar gömülü embriyolar plakaları santrifüj zaman sabit bir yönde yapılmaktadır; agar yeterince yüksek konsantrasyonda santrifüj sırasında dağılmakta plakaları önlemek için gerekli. Basitleştirmek için, elma suyu agar tek tip, her kullanım için istihdam edilmektedir.

Malzemeler

• Agar (25 gr)
• Sakkaroz (25 gr)
• Elma suyu (250 ml)
• Nipagin M stok solüsyon (50 ml etanol 5 g Metil-p-hidroksi-benzoat), bir koruyucu olarak görev yapar
• Petri yemekler: santrifüjle (60x15mm) ve yumurta toplama (60x15 mm veya 100x15 mm, 2. adımda kullanılan sinek kafesleri bağlı olarak)

Ekipman

• Hot plate
• İki Erlenmeyer matara

1. Bir Erlenmeyer şişesi, 25 g agar ve 750 ml dH ₂ O birleştirmek Sıvı döngüsü 50 dakika için Otoklav. Bu arada, elma suyu çözeltisi (1.2 adım) hazırlar.
2. Başka bir Erlenmeyer şişesi, 25 g sakaroz ve 250 ml elma suyu birleştirir. Sakaroz çözülür sıcak plaka Heat (55 ° C). Daha sonra 15 ml Nipagin M çözüm ekleyin. Onlar Nipagin yıkmak için neden olarak, yüksek sıcaklıklarda kaçının.
3. Agar solüsyonu şişesi el tarafından işlenebilir yeterince soğuduktan sonra, iki çözümleri birleştirmek ve iyice karıştırın. Arzetmelidir kadar sıcak plaka üzerinde karıştırın.
4. Petri kapları (~ 0.5 cm yüksekliğinde) içine dökün çözüm. 1 litre solüsyon ile ilgili küçük 100 (60 mm çap) veya 40 büyük (100 mm çap) yemekleri için yeterlidir.
5. Agar plakaları oda sıcaklığında birkaç saat veya gece boyunca kurumaya gerektiğini, aksi takdirde kullanım için çok ıslak olacak. Uzun süreli depolama için, 4 (plastik bidon ya da Petri kabı kollu) sarılı tutmak ° C

2) Hasat embriyolar

Bakış: gelişiminin ilk 3 saat boyunca (oda sıcaklığında), Drosophila embriyolar tek hücrelerin (germ-line öncüleri, posteriora yer alan kutup hücreleri hariç) . Bu aşamaların düzgün odaklı embriyolar santrifüj, yoğunluğu ile ayrı yumurta uzun ekseni boyunca en büyük organelleri. Cellularization aşamada, bu büyük tek bir hücre binlerce küçük hücrelere dönüştürülür; istihdam santrifüj kuvvetler rüptürü bu hücrelerin olmaz. Büyük organellerin başarılı ayrımı için, henüz cellularization tamamlamamış embriyolarda santrifüj nedenle kritik öneme sahiptir.

Malzemeler

• Elma suyu agar plaklarına
• Maya yapıştırın (kuru maya, fıstık ezmesi tutarlılık su ile karıştırılır)

Ekipman

• Piyasada bulunan (aşağıya bakın) veya ¹ ev yapımı: kafesleri Fly

1. Yetişkin sinekler altta elma suyu agar plaklarına yapıştırılmıştır kafeslerde tutulmaktadır. Petri kutularına kafesleri kullanmak için uygun bir boyut kullanın.
2. Bir yumurta toplama başlatmak için, taze elma suyu agar plaka hazırlamak ve maya hamuru ile bir kısmını kapsayacak. Meyve sinekleri maya yemek, özellikle maya, yumurta üretimi için beslenme sağlar. Agar, maya ve elma suyu varlığı da yumurtlama neden olur.
3. Yeni agar plağı ile eski döviz için, sinek kafesi ters ve tezgah üstüne bir kaç kez çarptım. Sinekler altına düşecek ve kısaca şaşırmış. Bu, hızlı bir şekilde agar plaka kaldırmak ve yeni bir tanesiyle değiştirmek için bir kaç saniye verir. Bu değişim, biraz pratik alır ve detayları istihdam kafesin türüne bağlıdır.
4. Erkek, sperm, yumurta döllenme izin yayınlandı iç torbalar önceki çiftleşmelerin (spermateka) mağaza sperm uçar. Iyi beslenmiş ve rahatsız döllenmeden hemen sonra, dişiler yumurtalarını ve böylece döşeme yumurta döllenme ve gelişme başında zaman zaman işaretleri. Koşullarının uygun olmadığı zaman, kadın döşeme önce değişken kez döllenmiş yumurta tutun. Yanlış sahnelenen embriyolar sayısını en aza indirmek için, iş gününün ilk koleksiyonu (30 ila 60 dakika "ön-koleksiyonu" yeterli olacaktır) atmak için tavsiye edilir. Taze maya varlığı, bu tutulan yumurtalarını bırakmak için kadın neden olur, sonraki yumurta koleksiyonları ve yumurta ile egemen olma eğilimindedir gübreleme sonra kısa bir süre yatırılır.
5. Embriyonik aşamada istenen bağlı olarak, 3 saat kadar yumurta toplayın. Cellularization oda sıcaklığında ~ 3.5 saat sonra tamamlanmış olduğundan, uzun toplama saatleri yararlı değildir. En tutarlı katmanlama rutin deneyler için (1 saat daha kısa toplama saatleri lehine genç embriyoların eldeveya daha az).
6. Bazen sinek maya veya agar plaka yüzeyine yapışmış olsun. Cımbız ile onları çıkarın.

3) embriyoların yumurta kabuğu çıkarma

Bakış: balmumu yapılmış ağırlıklı protein ve bir iç tabaka yapılmış bir dış tabaka (koryon) (vitelline membran): Drosophila embriyoları iki koruyucu tabakaları ile kaplıdır. Embriyo mekanik hakaret ve kuruma karşı korur. Koryon farklı yapılar olarak kolayca görülebilen iki uzantıları (yumurta filamentler veya dorsal uzantıları) vardır. Bu adımda,% 50 çamaşır suyu, yumurta iliklerine koryon kaldıracaktır. Koryon kaldırıldıktan sonra, embriyo, santrifüj için özel embriyonik gelişim evrelerinin seçilmesini sağlayarak, iletilen ışık şeffaf hale gelir. Koryon aynı zamanda pek çok post-santrifüj işlemleri (örneğin, 6. adımda fiksasyon) ile müdahale edebileceğiniz gibi, koryon kaldırılması hızlı işleme sonra izin verecektir.

% 50 çamaşır suyu arıtma koryon birkaç dakika içinde çözülür, henüz embriyo zarar vermez. Vitellin membran çamaşır suyu dışarıda tutar. Çamaşır suyu tedavi yumurta filamentler artık görünür olana kadar devam edecektir. Daha sonra, küçük bir elek (tel örgü yapılmış bir sepet) ile embriyo / ağartıcı şerbeti dökerek çamaşır suyu embriyoların ayrı olacaktır. Çamaşır suyu maruz adım acele kritik öneme sahiptir. Çamaşır suyu erken, daha sonraki adımlarda yıkanıp ise (örneğin, vitellin membran aşağıdaki fiksasyon çıkarılması) tehlikeye olabilir.

Malzemeler:

• % 50 çamaşır suyu ile Squirt şişe (bir hacim ticari ağartıcı bir hacim dH ₂ O)
• DH ₂ O Squirt şişe
• Kağıt havlu

Ekipman:

• Homemade tel sepetler, paslanmaz çelik hasır levhalar yapılmış. Sepet yapmak için, düz sac ~ 2 x 2 cm kareler kesilir ve ortasında girinti.
• Cımbız tel sepetler tutmak için
• Diseksiyon mikroskobu transillüminasyon

1. Diseksiyon mikroskobu altında agar plaka koyun ve transillüminasyon embriyoların gözlemlemek. Yumurta filamentler (bkz. Şekil 2A) tanımlamak için emin olun.
2. Agar plaka üzerine Squirt% 50 çamaşır suyu, embriyoların kapsayan. Çamaşır suyu etrafında girdap embriyoların bazen agar plaka çalkalayın.
3. Yumurta filamentler (genellikle 3-5 dakika sonra, ancak zamanlar değişebilir) artık görünür sonra, koryon başarıyla kaldırıldı.
4. Bir sonraki adımda, bir hasır sepet, elek gibi çamaşır suyu embriyolar ayrı kullanılabilir. Cımbız ile tel sepet alın ve agar plaka ters kapak üzerinde tutun. Kapağı tel örgü ile damlama çamaşır suyu yakalamak için rezervuar olarak hizmet verecek.
5. Tel örgü ile agar plakadan çamaşır suyu / embriyo şerbeti dökün.
6. Önemli bir sayıda embriyo tabağa agar plaka, fışkırtma dH ₂ O kalır ve tel örgü ile dH ₂ O / embriyo şerbeti dökün. Önemli bir embriyo sayısı rezervuar içine dökülürse, tel örgü ile rezervuar içeriğini dökün.
7. Herhangi bir aşırı sıvı örtecek bir kağıt havlu tel örgü altındaki dokunun. Sonra fışkırtma dH ₂ O tel örgü üzerine kalan çamaşır suyu durulayın. Yukarıda açıklandığı gibi, yanlışlıkla yıkanıp embriyolar kurtarmak için kapak plakası deposu olarak kullanılır. Tel sepet çevresince fışkırtma şişeden su akışı işaret ederek embriyolar kaybetme en aza indirebilirsiniz. Sıkça fazla sıvıyı kurulayın.
8. Tüm çamaşır suyu kaldırıldı kadar, bu yıkama adım 5-10 kez tekrarlayın. Tel sepet hala çamaşır suyu kokuyor, çamaşır devam etmelidir.

4) agar Montaj embriyolar

Genel Bakış: Drosophila yumurta, çok daha uzun (~ 500 mm) geniş (~ 180 mm) daha. Santrifüj sırasında organellerin maksimal ve tutarlı ayırma elde etmek için, şark embriyolar, dönme merkezine doğru ön biter noktası (Şekil 1, 3). Çok yoğun yapılar (sarısı bileşenler) posterior sonuna yakın birikir Bu şekilde, hafif hücre içi yapıları (lipid damlacıkları), tüm embriyolar ön sonunda birikir. Embriyolar ön uçları yukarı bakacak şekilde, elma suyu agar küçük dikey deliklere yerleştirilir. Agar santrifüj sırasında sabit bir yönde embriyo tutar.

Ekipman:

• İğne tutucu
• Tungsten iğneler, iğneler tipik yönlendirmesinden itibaren geriye doğru tutucuya monte künt sonuna sopa ve embriyoların işlemek için kullanılabilir böylece
• P200 pipet
• Diseksiyon mikroskobu transillumination
• Fly fırça (yetişkin Drosophila sıralamak için kullanılan küçük bir boya fırçası)

Malzemeler:

• Triton Tuz Çözeltisi (AKM): 4g NaCl, 0.3 ml Triton X-100, 1000 ml (10x stok solüsyonu olarak yapılabilir) GKD ₂ O ile doldurun

1. AKM ve boş bir Petri kabı içine tel sepet embriyolar yıkayın. Embriyolar dibine çöker. TAD içinde embriyoların içeren Petri kabı diseksiyon kapsamı üzerine aktarın ve (embriyolar Şekil 4'te gösterilen benzer) transillüminasyon tarafından gözlemlemek.
2. P200 pipet kullanarak, istenilen safhalarında embriyolarını seçin ve küçük bir agar plaka aktarabilirsiniz. (Daha fazla ayrıntı için ^bkz: 1 Şekil 4) Özel aşamaları kolayca görsel olarak tanınan içinde olabilir. Embriyolar yaşlanma ve TAD içinde (30 dakika daha uzun) su altında uzun süreli gelişimini etkileyebilir yılından bu yana hızlı bir şekilde çalışın.
3. Bir pipet ve bir Kimwipe ile en AKM çıkarın. Agar yüzeyinde daha kolay etrafında embriyolar itmek kılan hafif nemli olmalıdır. Ancak, plaka üzerinde her yerde kalan embriyoların delik slayt neden olacak aşırı sıvı santrifüj sırasında bu yana sıvı havuzları olmamalıdır.
4. Bir iğne kullanarak bir embriyo bulunduğu yere yakın agar içine dikey delik karıştırmak. Bu iğne mikroskop altında aynı anda izlemek için muktedir bir açıyla tutun, çünkü mükemmel bir şekilde dikey delik karıştırmak zordur. Embriyo boyunca ve deliğe kolayca slayt böylece bu delik bir tarafta hafif bir depresyon / koru oluşturur çünkü iğne küçük bir eğim aslında avantajlıdır. Agar bir embriyo kez kısmen zarar vermeden daha fazla itilebilir bir deliğe takılı olduğu kadar yumuşak olduğundan delinme agar yüzeyi için yeterli.
5. Embriyoların ön sonuna kadar genellikle, tutarlı bir yönlendirmeyle deliklerin içine itti gerektiği gibi, embriyoların ön ve arka uçları farkındayız emin olun. Vitellin membran ön sonunda özel bir yapı tarafından karakterize, spermin döllenme sırasında girdiği micropyle (Şekil 2).
6. Iğnenin küt ucunu kullanarak, agar boyunca taşımak ve yönlendirmek / delinmiş deliğe doğru posterior sonuna manevra embriyo karşı zorlayabilir. Sonra ön uç karşı deliğe doğru itin. Bu kolay delinmesiyle sırasında oluşan hafif depresyon boyunca deliğe embriyo kayma gerekir. Embriyo yukarı kalkar, deliğe derin aşağı doğru itin.
7. Tam oturduğundan, embriyo zaten genellikle oldukça dik. Değilse, yanlamasına üzerine basarak eklenen embriyo daha dikey bir hale getirilebilmektedir. Deliği çok büyük değilse, embriyonun konumu stably santrifüj boyunca agar tarafından düzenlenen olacak.
8. Uygulama ile, plaka başına 100-250 embriyolar gömmek mümkün. Kaç ihtiyaç duyulan belirli bir uygulama bağlıdır: embriyolar canlı görüntüleme için veya nakli deneyleri için bağışçılar olarak kullanılması halinde, sadece birkaç gereklidir. Embriyolar sabit ve immunohistokimyasal olarak ise, bir kısmını santrifüj sonrası işleme sırasında kaybolan ve bir daha yüksek numaraları ile başlamalı olacaktır. Embriyolar kadar dar bir geliştirme aşamasında istenirse, genel ihtiyaçları için montaj süresi kısa tutulmalıdır montaj sırasında geliştirmeye devam ettiğini aklınızda bulundurun.
9. Gömülü değildi herhangi bir embriyolar kalan varsa, nemlendirilmiş bir sinek fırça ile plaka bunları kaldırın. Sinek fırça (örneğin 1xTSS) sıvıya batırın, herhangi bir artık embriyolar dikkatle süpürüyor (diseksiyon kapsamında izlerken) plakanın üst kısmında silin ve tekrar sıvının içine fırça batırarak fırça embriyoların yıkayın.

5) Santrifüj ve embriyo kurtarma

Bakış: plakaları Sorvall RT7 Plus santrifüj sallanan kova transfer ~ 3000 g karşılık gelen 4000 rpm, 30 dakika süreyle santrifüj Santrifüj sonra, tabak, AKM ile kaplıdır. Embriyolar, bir iğne ile delik agar çıkardı ve uygun damarlarının bir pipet ile aktarılır.

Ekipman:

• Iğne ile iğne tutucu (önceki gibi)
• Sorvall Plus RTH750 rotor ve sallanan kova RT7 veya eşdeğer ²
• Diseksiyon mikroskobu transillüminasyon
• P200 pipet

Malzemeler:

• TSS

1. Aşağı santrifüj, agar yan sallanan kova plakaları aktarın. Santrifüj eşit dengeli olduğundan emin olun.
2. Santrifüj için Ayarlar: Sıcaklık = 4-10 ° C, rpm = 4000, zaman = 30 dk.
3. Tekrar santrifüj diseksiyon mikroskobu altında yer agar plaka sonra AKM bir tabaka ile plakası kapsayacak.
4. Bİğnenin Lunt ucu, embriyoların delik kazmak. TAD içinde yüzer, ancak sular altında kalacaktır.
5. Embriyolar ön sonunda kahverengi bir kap, açık bir orta bölge ve posterior sonunda bir karanlık, gri alan (Şekil 2, 5A), açıkça katmanlı görünecektir. Farklı katmanlarını göstermek için başarısız embriyolar atın.
6. P200 pipet kullanarak, yeni bir gemi için AKM iyi katmanlı embriyoların transferi, uygulamaya bağlı olarak, bir sintilasyon flakon veya mikrosantrifüj tüp gibi.

6) Daha fazla işleme

Uygulamaya bağlı olarak, embriyolar daha sonra çeşitli şekillerde tedavi edilebilir.

1. Embriyolar, parlak bir alan veya Epifloresans mikroskobu ile doğrudan gözlem için bir cam slayt tampon aktarılır ve # 1 lamelleri ayırıcılar olarak 18x18 mm, 22x22 mm # 1.5 lamel altına monte edilmiştir. Uzun vadeli gözlemler için, Halokarbon yağ 27 ile tampon değiştirmek için gerekli olabilir.
2. Embriyolar sabit olması ise, bir sintilasyon flakon adım 5.6 'da transfer edilmelidir. Daha sonra standart fiksasyon teknikleri kullanarak ¹ sabit olabilir. Bu teknikler genellikle vitellin zar kaldırmak için bir heptan-metanol emülsiyon ajitasyon istihdam. Santrifüje embriyolar için bu devitellinization adım verimliliği düşük olduğunu unutmayın. Bu nedenle, pratik olarak pek çok embriyolar ile başlamak ^veya 1 vitellin membran elle kaldırmak için tavsiye edilir .
3. Embriyolar nakli deneyleri (örneğin, santrifüj embriyolar belirli bir organel tabakayı kaldırmak için) kullanılacak olursa, onlar agar plaklarına aktarılır ve santrifujlenmemiş embriyoların ³ gibi standart prosedürler kullanarak lamelleri üzerine monte edilmiş . Santrifüj ile indüklenen katmanlama on dakika boyunca stabildir.

7) Temsilcisi sonuçları

Santrifüj beklendiği gibi çalıştı, büyük yoğunluk ² embriyonik organelleri dışarı sıralamak. Örneğin, düşük yoğunluklu lipid damlacıkları ön sonunda birikir; posterior ucu (Şekil 1, 2) yüksek yoğunluklu sarısı veziküller birikir. Lipid damlacıkları ve yumurta sarısı veziküller lipidler ve proteinler için depolama organelleri.

Yoğunluk bağımlı tabakalaşma Onay diseksiyon veya bileşik mikroskop altında transillüminasyon canlı embriyolarının görsel denetim yoluyla elde edilir. Embriyolar Şekil 5A gibi görünmelidir: lipid damlacıkları çok ön ucu ("lipid kap") sağlam bir kahverengi bir tabaka oluşturur; sarısı birikimi posterior sonunda, koyu gri bir bölgede sonucu. Bu iki karanlık katmanları diğer organelleri ve sitoplazma temsil eden geniş bir açık bir bölge ayrılmıştır. Embriyolar cellularization sonra santrifüj iseniz, katmanlama (Şekil 5C) az olacaktır.

Epifloresans mikroskop varsa, bu canlı, santrifüj embriyolar UV eksitasyon altında incelenebilir. Bu koşullar altında, yumurta sarısı, yoğun mavi otofloresans (Şekil 5B) görüntüler. Arka kutupta autofluorescent malzeme kompakt bir tabaka başarılı santrifüj gösterir ve arka sonu için bir marker olarak hizmet vermektedir.

Embriyoların sabit eğer bu katmanlar görünümünü büyük ölçüde değişeceğini unutmayın. Örneğin, standart ısı veya formaldehit fiksasyonu embriyolar sabit heptan-metanol devitellinization ^1, lipid damlacıkları saydam hale gelir ve lipit tabakası yerine koyu kahverengi (Şekil 5D) daha parlak ışık mikroskobu ile beyazımsı ve kabarık görünür . Yumurta sarısı otofloresans kısmen veya tamamen daha az yoğun ya da saptanamayan olma, fiksasyon tarafından yok edilir.

In vivo santrifüj belirli bir organel vurgulamak için istihdam ise, etiket yararlı onay için bir floresan işaretleyici ile organel. Örneğin, mitokondri hedeflenen YFP füzyon proteinleri, ⁴ ER veya Golgi tarif edilmiştir. Santrifüje embriyolar, bu işaretleri, ön arka ekseni (Şekil 1) boyunca karakteristik pozisyonları birikir. Son olarak, bazı histon füzyon proteinleri lipid damlacıkları ve çekirdekleri ² hem de lokalize ve böylece (etiketli çekirdeklerin sayısına göre) embriyo aşamasında izlemek için bu hücresel bölmeleri (Şekil 5 E, F) yanı sıra işaretlemek için kullanılan olabilir . Bu paragrafta belirtilen belirteçlerin ifade Fly suşları Bloomington Drosophila stok merkezi (http://flystocks.bio.indiana.edu/) mevcuttur. Histon H2Av için, GFP ve MRFP varyantları mevcuttur ^{5, 6}

Şekil 1 santrifüj yoluyla organelleri ^(2'den sonra değiştirilmiş) ayrılması. Farklı tabakalaşma odaklı embriyolar sonuçları santrifüj(Parlak ışık). - Binbaşı organelleri ön boyunca karakteristik pozisyonlar (yukarı) birikir, endoplazmik retikulum, golgi ve mitokondri (canlı embriyolarının açıklanan YFP işaretçiler ile tespit lipid damlacıkları (Nil Kırmızı boyama ile sabit embriyolar tespit): (aşağı) arka eksen ana metin); sarısı (otofloresans tarafından tespit). Floresan görüntü konfokal mikroskopi tarafından satın alındı.

Şekil 2 embriyolar şematik olarak gösterilmesi.

A. yumurta kabuğu ve önde gelen yumurta filamentler (dorsal uzantıları) Yumurta. Yumurta kabuğu saydam değildir, yumurta düzgün koyu görünür.

Koryon B. Yumurta kaldırıldı. (Solda), anterior sonunda micropyle görülebilir. Geliştirme aşamasında bağlı olarak, vitellin membran içerisindeki embriyonun düzgün koyu kahverengi görünür veya çeşitli yapılarını göstermek. Şekil 4 örnekler için bkz.

C. burada açıklanan protokol odaklı, embriyo Santrifüj. Micropyle sonunda kahverengi bir "başlık" olarak lipid damlacıkları birikir; sarısı ters sonunda veya yakınındaki gri bir tabaka oluşturur.

Şekil 3 prosedürü şematik açıklaması. Sol: Embriyolar koryon olmadan bir agar plaka üstüne yerleştirilir ve agar delik içine bir iğne ile itti. Bu, tüm embriyoların tutarlı bir yönde sonuçlar anterior montaj biter. Sağ: santrifüj sonra, embriyolar tabakalı. Ağar, TAD (mavi) ile üst üste, ve embriyoları, iğne ile agar kurtarıldı. TAD içinde askıya sonra, embriyolar bir pipet ile yakalandı olabilir.

Adım 4.1 'de nasıl görüneceğini benzer yaşam Drosophila embriyoların Şekil 4 Parlak ışık görüntü,. Embriyolar standart yönde gösterilmiştir: anterior ucu, aşağı sağ, dorsal yüzü yukarı ve ventral yan sol, arka sonuna kadar. Erken embriyogenez bir time-lapse video Bu protokol ile birlikte bir parçası olarak kullanılabilir.

A. Dilinim dönem embriyoların düzgün kahverengi görünür. Bu gibi aşamaları in vivo santrifüj için idealdir.

B. blastodermin embriyoların her tarafta benzer görünen bir açık jant var. Bu açıkça periferinde plazma zarı çekirdek birikimi nedeniyle parçası ve sarısı veziküller ve lipid damlacıkları ⁷ içe ulaşım nedeniyle kısmen. Bu açık bir ^çevre, 1 cellularization sonuna yakın kadar genişletir . Embriyolar hala sarısı ve çekirdekleri katmanlama bölünme aşamaları olarak tutarlı olmasa da, cellularization ⁸ sonuna kadar santrifüj tarafından başarıyla tabakalı olabilir.

Dorsal ve ventral taraf belirgin hale gelir, ve çeşitli kıvrımlar geliştiren; C. cellularization sonra, embriyolar asimetrik görünür. Gösterilen embriyonun erken germ-band uzantısı. Bu aşamalar, santrifüj büyük organelleri tabakalandırılması artık etkilidir.

Şekil 5 Santrifüj embriyolar. Bu rakam tüm embriyolar, ön ucu ile santrifüj edildi ve bu yönde gösterilmektedir.

Başarıyla santrifüj embriyo A. Parlak ışık görüntüsü. Çok ön sonunda kahverengi bir tabaka lipid damlacığı birikimi nedeniyle. Posterior sonlarına doğru geniş bir gri tabaka sarısı veziküller nedeniyle. Sarısı tabakası altında kökeni bilinmeyen, sık sık açık bir bölge vardır. Sarımsı bölge sarısı tabakası üzerinde sık sık görülür, muhtemelen mitokondri temsil eder. Çözünür proteinler, lipid damlacıkları ve yumurta ^sarısı 2 arasında açık bir tabaka boyunca bulundu.

UV eksitasyon altında Epifloresans mikroskobu ile bakıldığında, B. A Embriyo. Sarısı mavi otofloresans özelliği arka sonuna belirlemenize yardımcı olur.

C. Embriyo cellularization sonra, santrifüj sırasında germ-band uzantısı, yani. Sarısı hala arka sonunda birikebilir, ama aksi katmanlama minimum düzeydedir.

D. ısı sabitleme sonra başarıyla tabakalı embriyo. Lipit damlacık katmanı, yerine koyu kahverengi (A) Sabitlenmemiş embriyolar gibi daha, beyaz ve kabarık görünür.

Konfokal mikroskobu ⁽² sonra değiştirilmiş) His2Av-GFP ve görüntülü ifade E. ve F. Embriyolar. E: bölünme aşamasında santrifüj; His2Av-GFP sadece birkaç çekirdekleri bu zamana kadar oluşan lipit damlacık katmanı işareti görünür. Odak düzlemli bağlı olarak, çekirdek (burada gösterilmemiştir) damlacık tabakasının altında görünür olabilir. F: blastodermin aşamada santrifüj; His2Av GFP damlacık lipit tabakası (üst) ve çekirdekler (damlacık katmanının altında geniş bir bölge) hem işaretleri.

Tartışmalar

Kritik adımlar

Agar agar konsantrasyonu yeterince yüksek olduğundan emin olun. Çok düşükse, santrifüj sırasında parçalanır ve embriyoların patlaması ya da rastgele odaklı olacak . Agar konsantrasyonu sadece biraz agar (4.3 adım aşırı AKM yeterince kurutulmuş veya yetersiz kaldırma) ıslak çok düşük ya da eğer varsa, santrifüj sırasında embriyoların deliklerinden dışarı float ve yanlış odaklı hale gelecektir. Agar çok ince dökülür, aynı zamanda çökmesi veya santrifüj sırasında çatlak.

Organelleri, tek tek hücrelerin binlerce içinde tecrit olacak embriyolar cellularization aşamalarında ötesinde gelişmiş olduğunu emin olun, aksi takdirde, organellerin ayrılması (Şekil 5C) iş olmaz . Bir hücre aşamada genç embriyoların, organeller büyük mesafeler göç ücretsiz ve onların karakteristik yoğunluğuna göre birikir. Çok eski olan embriyolar analiz önlemek için, emin olun, (i) kadın, eski yumurta (adım 2.4), (ii) (adım 2.5) 3 saat veya daha az embriyolar toplamak, (iii) bırakmak için izin vermek için bir ön toplama agar içine gömmek için görsel cellularization aşamalarında önce embriyolar seçin (adım 4.2), (iv) cellularization (adım 4.6) sonuna kadar gelişimini önlemek için kısa bir süre gömme tutmak, ve (v) (adım 5.6) doğru katmanı yoktu embriyolar iptal .

Santrifüj zaman eksik etmeyin. Bazı embriyoların sadece 10 dakika santrifüj sonra bile güzel katmanlarını göstermek rağmen, ayırma embriyo embriyoya tutarsızdır. 30 dakika spin yüksek tutarlı sonuçlar verir. Ayrıca, santrifüj sona erdikten sonra uzun süre santrifüj süresi daha uzun katmanları stabildir. Bu kullanmadan önce daha fazla embriyoların süreci zaman alır, bu uygulamalar için önemlidir (örneğin, nakli deneyleri için konfokal analizi için işlenen veya monte edilmesi gerekiyorsa).

Olası değişiklikler

Yumurta toplama ve adım 2 ve 3 ^{1, 3, 9} koryon kaldırılması çok farklı protokoller var ve kullanılan embriyoların genç olanlar sürece burada açıklanan yanı sıra iş, yumurta verimi yüksek ve kesir yanlış sahnelenen embriyolar en aza indirilir.

Ön-arka hizalama protokol posterior uç agar gömüldü ve ön ucu (Şekil 3) olduğu gibi tüm embriyolar yönlendirir. Bu yönelim, tutarlılık için iyi micropyle santrifüj (Şekil 1, 5) sırasında sivri ucunu bir dönüm noktası olarak kullanmak mümkündür, böylece. Ancak, uygulama ile, parlak alan mikroskobu ile lipit damlacık ve yumurta sarısı katmanları farklı bir görünüm santrifüje embriyoların yönünü ortaya çıkarmak kolaydır. Sonra iki ucunda olan embriyolar monte etmek mümkün olur; bu esneklik montaj sürecini hızlandırır.

Yönlenimsiz santrifüj protokolün en çok zaman alıcı ve teknik açıdan zor yönü montaj agar embriyolar (adım 4). Bu iki kez (bir kez deliğe takın ve bir kez santrifüj sonra kurtarmak için) her bir embriyo dokunmadan gerektirir. Alternatif olarak, bir AKM ile dolu mikrosantrifüj tüpler içine adım 4.1 'embriyolar transfer edebilirsiniz. Bu borular, mikrosantrifüj (13.000 rpm, 10-30 dak.) Santrifüj, embriyoları aynı zamanda tipik ^tabakası 10-13 . Bu değişim, bir çok hızlı bir şekilde aynı anda yüzlerce embriyo süreci sağlar. Ancak, katman olarak tutarlı değildir; embriyoların bir kısmını yukarıda protokol uygulanan daha yüksek santrifüj kuvvetler (~ 16.000 g) rağmen farklı katmanlar ortaya çıkmaz. Daha zorlu embriyoların yönünü değişkendir ve bir büyük embriyo ekseni çeşitli açılardan ayrımı izleyebilirsiniz gerçektir. Bu değişkenlik, deneyci, belirli bir embriyo santrifüj tüpüne nasıl düzenlenmiştir santrifüj sonra dışarı sıralamak için gereklidir. Sarısı otofloresans embriyonun en yoğun bölümü için bir belirteç olarak kullanımı ile güvenilir bir şekilde bunu yapmak için çok daha pratik ve daha fazla karar gerektirir rağmen, bu, çoğu zaman mümkündür. Örnek yeterli embriyolar varsa, bir embriyolar Şekil gibi düzenlenmelidir oldu bu örnekleri sıralamak mümkün olabilir. 1.

Kendi yumurta kabuğu embriyoların Santrifüj koryon ilk ² çıkarmadan adım 4 agar embriyolar gömmek için mümkündür. Bu yaklaşımda, toplama plakası üzerinde embriyolar Halokarbon yağ yerine adım 3.2 (Halokarbon koryon saydam döner)% 50 çamaşır suyu ile kaplıdır. Embriyolar uygun aşamalarında seçilmiş ve cımbız kullanarak yeni bir agar plaka transfer; cımbız, zarar, sadece yumurta filamentler kapmaembriyonun düzgün kaçınılmalıdır. Embriyolar ön yumurta filamentler agar delikten dışarı yapıştırma ile, 4.8 ile adım 4.4 gibi gömülürler. Embriyolar santrifüj ve adım 5.4 agar çıkardı sonra yumurta kabuğu,% 50 çamaşır suyu arıtma ile kaldırıldı. Yumurta kabuğu varlığında Santrifüj fiksasyon sonra devitellinization oranı (adım 6.2) artırabilir, ama santrifüj için doğru aşamalarında seçimi (4.2 adım) daha zordur.

Uygulamalar

Embriyo santrifüj ko deneyler, yani, eğer belli bir proteinin belli bir büyük organel lokalize sınamak için yararlıdır. Örneğin, Klar protein erken embriyonik lipid damlacıkları bulunan, henüz bu lokalizasyon sağlam embriyolar göstermek zordur. Bölümünde, Klar puncta ve lipid damlacıkları hem de sabit sahte ko ekarte etmek için, embriyo çevre ¹⁰ bol çünkü bu. Ancak, farklı bir tabaka haline santrifüj lipid damlacıkları konsantreleri, ve böylece, Klar sinyal ile ko ¹⁰ belirginleşmektedir.

Benzer analiz, belirli histon gibi şaşırtıcı örnekler de dahil ^{olmak üzere lipid damlacıkları 8,} 13-15, 2 ve bir protein yayg mevcut olduğu durumlarda diğer proteinlerin lokalizasyonu net bir şekilde ^gösterdi, ancak lipid damlacıkları 8 zenginleştirilmiş. Embriyolarının gelişim aşamasında (adım 4.2) tarafından görsel olarak seçilebilir olarak, lipid ^{damlacıkları 8,} 15 proteinlerin gelişimsel düzenlenir işe tespit etmek bile mümkün . Çünkü görsel olarak ayrı bir "kap" lipid damlacıkları birikir lipid damlacıkları ile ko için test özellikle kolaydır, böylece başka marker veya leke bu katmanı tanımlamak için gereklidir. Aslında, çünkü kolaylığı ve potansiyel çarpıcı görsel sonuçları (Şekil 1, Şekil 5 D, E), bizim laboratuar aday protein, lipid damlacıkları lokalize olup olmadığını bir ilk test olarak artık rutin olarak bu tekniği kullanır. Prensip olarak, benzer ko çalışmaları Şekil diğer organellerin için çalışması gerekir. 1, muhtemelen dağıtım santrifüje embriyolar diğerleri (hücre içi parazitler de dahil olmak üzere) belgelenmelidir henüz için.

Santrifüj sıkı bantlar organelleri konsantreleri bu yana, bu organeller zenginleştirilmiş bir kısmını izolasyonu kolaylaştırır. Bu yaklaşım, zaten içine donör embriyoların ² nakli için lipid damlacıkları kurtarmak için kullanılır olmuştur. Ayrıca zenginleştirilmiş fraksiyonu (örneğin, ¹⁵ fiksasyon sonra embriyolar kapalı katmanları keserek) biyokimyasal analiz etmek mümkün olabilir.

Santrifüj ¹⁶ (kurbağa, nematod, gömlekliler, halkalı, deniz kestaneleri, yumuşakçalar ve cnidarians da dahil olmak üzere) pek çok farklı türlerin yumurta tabakalandırmak için kullanılabilir yöntemi, burada Drosophila embriyolar ötesinde uygulamalar vardır anlatılan. Kendi laboratuarında, housefly Musca domestica ² embriyolar için yukarıdaki protokol ve mantar sivrisineği fosili Sciara coprophila ¹⁷ ve salyangoz Ilyanassa obsoleta ¹⁷ embriyoların analiz yönlenimsiz santrifüj istihdam. Son olarak, bu yöntem embriyolar sınırlı değildir: Santrifüj oosit (örneğin, Drosophila ^{2, 18} ve sütlü özsuyu olan bir bitki hata Oncopeltus fasciatus ¹⁷⁾ gibi diğer büyük hücreler, sınıflandırmaktı yararlı olabilir. Farklı örnek için, tam santrifüj koşulları optimize edilmesi gerekir: Örneğin, 3000 g 10 dakika verimli Musca domestica ² embriyolar tabakalandırmak için yeterli ve eğer çok daha uzun santrifüj, embriyoların fiksasyon ve immün sırasında dağılma eğilimi gösterir.

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes		Becton Dickinson	#35-1007	From Falcon
Wire mesh		Small Parts	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles		Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder		Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages		Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27		Sigma	H8773