يعاير نشاط الحركي لدراسة ايقاعات كل يوم والمعلمات في النوم ذبابة الفاكهة</em

Summary

نحن تصف الإجراءات اللازمة لتسجيل النشاط الحركي اليومي للإيقاعات ذبابة الفاكهة وبعد تحليل البيانات. النشاط الحركي الإيقاعات هي ناتج موثوق السلوكية من الساعات الإيقاعية الحيوانية وتستخدم مثل قراءات مستوى وظيفة على مدار الساعة عند دراسة المسوخ الإيقاعية أو دراسة كيفية البيئة ينظم نظام الساعة البيولوجية.

Abstract

أكثر أشكال الحياة اليومية في المعرض إيقاعات الظواهر الخلوية الفسيولوجية والسلوكية التي يقودها الإيقاعية المحلية (≡ 24 ساعة) أو أجهزة تنظيم ضربات القلب الساعات. ترتبط الأعطال في النظام الإيقاعية الإنسان مع العديد من الأمراض أو الاضطرابات. وقد برز الكثير من التقدم صوب فهمنا للآليات الكامنة ايقاعات كل يوم من على شاشات الوراثية حيث يتم استخدام إيقاع قياسه بسهولة السلوكية باعتبارها من قراءة وظيفة على مدار الساعة. جعلت دراسات ذبابة الفاكهة باستخدام المساهمات المنوية في فهمنا للأسس الخلوية والكيمياء الحيوية الكامنة ايقاعات كل يوم. ومعيار السلوك اليومي للقراءة من أصل يقاس في ذبابة الفاكهة هو النشاط الحركي. بشكل عام ، ونظام رصد يشمل الأجهزة المصممة خصيصا التي يمكن قياس حركة الحركي من ذبابة الفاكهة. ويقع مقر هذه الأجهزة في حاضنات للرقابة بيئيا الموجود في غرفة مظلمة ، وتستند على استخدام انقطاع شعاع من ضوء الأشعة تحت الحمراء لتسجيل النشاط الحركي من الذباب الفردية الموجودة داخل أنابيب صغيرة. عندما يقاس على مدى أيام عديدة ، ذبابة الفاكهة دورات المعرض يوميا من النشاط والخمول ، وايقاع السلوكية التي يحكمها النظام الحيوان الإيقاعية المحلية. لقد تم تبسيط الإجراءات بشكل عام مع ظهور الأجهزة المتوفرة تجاريا رصد النشاط الحركي وتطوير برامج الحاسب الآلي لتحليل البيانات. نستخدم نظام من شركة Trikinetics ، وهو الإجراء الموصوف هنا وحاليا النظام الأكثر شيوعا واستخداما في العالم. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام أجهزة الرصد نفسها لدراسة سلوك النوم في ذبابة الفاكهة. لأنه لا يمكن قياس اليومية دورات النوم اليقظة العديد من الذباب واحد وفقط 1-2 أسابيع متواصلة بقيمة بيانات النشاط الحركي هو عادة ما تكون كافية ، وهذا النظام يعتبر مثاليا للشاشات واسعة النطاق لتحديد ذبابة الفاكهة يظهر تغيير الخصائص الإيقاعية أو النوم.

Protocol

ويتضح من التصميم العام للبروتوكول في الشكل 1. الإعداد لرصد النشاط الحركي باستخدام أجهزة التحكم الموجودة في الحاضنات بيئيا الموجود في غرفة مظلمة يجب تجميعها أولا. بمجرد أن يكتمل ، ويمكن استخدام هذا النظام في جميع القياسات اللاحقة الإيقاع الحركي النشاط. لكل تجربة ، على المرء أن (ط) إعداد حيوانات التجارب ، والتي قد تشمل توليد حيوانات معدلة وراثيا أو وضع الصلبان اللازمة ، (ب) إعداد النشاط أنابيب زجاجية تحتوي على مصدر الغذاء ، (الثالث) تحميل الذباب في أنابيب توصيل النشاط وتراقب النشاط إلى نظام لجمع البيانات ، وتسجيل (رابعا) وتحليل البيانات باستخدام برامج مختلفة اعتمادا على ما المعلمات الإيقاعية النوم أو أحد يرغب في دراستها. هنا ، نحدد "بداية" للتجربة والوقت عند اول من كشف عن الذباب في أجهزة رصد لضوء المطلوب / ظروف مظلمة في حاضنات البيئية.

1. إنشاء نظام مراقبة النشاط الحركي

1. نظام الرصد يشمل العديد من بنود المعدات مثل أجهزة الرصد المتخصصة ، وحاضنات البيئية التي لديها القدرة للسيطرة على ضوء نهاري ، وأجهزة جمع البيانات ، وأجهزة الكمبيوتر والمواد الطرفية مثل الأسلاك لربط أجهزة رصد لأجهزة جمع البيانات (الشكل 2). يتم توفير إرشادات لتثبيت مراقبة نشاط ذبابة الفاكهة (السد) نظام لجمع البيانات من قبل الشركة المصنعة (شركة Trikinetics).
2. إلى منزل رصد النشاط الحركي النظام ، اختيار غرفة جيدة التهوية ، ومجهزة يفضل مع نظام التحكم في درجة الحرارة ، ليكون غرفة مظلمة مخصصة. مع جميع الأنظمة الكهربائية المعنية (مثل الكمبيوتر والحاضنات) يعمل لفترة طويلة من الوقت داخل غرفة صغيرة ومحصورة ، يمكن توليد الحرارة المفرطة التي تؤدي إلى زيادات سريعة في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي ، سوف تكون مثقلة بعبء العمل مع حاضنات اضافية للحفاظ على درجة حرارة وأكثر عرضة للفشل في التحكم في درجة الحرارة. نجد أنه حتى في غرف جيدة التهوية ، والانتقال من أجهزة تكييف الهواء في الصيف إلى الحرارة في فصل الشتاء سقوط / يمكن أن تجعل من الصعب الحفاظ على درجة حرارة الغرفة. في مثل هذه الحالات قد تهوية إضافية يجب أن تكون مثبتة في غرفة مظلمة للحد من خطر ارتفاع درجة الحرارة. أيضا ، فمن الأفضل لإيقاف الحاضنات التي ليست في استخدامها لتقليل إنتاج الحرارة لا لزوم لها.
3. ختم الغرفة من مصادر الضوء الخارجية. يمكن أن تكون مختومة مع قبالة مدخل الباب الدوار أو ستارة سوداء. نحن نفضل وضع يشبه الباب الدوار لأن هذا يقلل من فرص دخول غير المرغوب فيه الضوء على غرفة مظلمة. داخل غرفة مظلمة ، فإنه ليس من الضروري العمل في الظلام تماما مثل ذبابة الفاكهة نظام الساعة البيولوجية ليست حساسة للضوء الأشعة تحت الحمراء (وإلى حد أقل حساسية للضوء الأحمر مقابل ضوء أخضر / أزرق). في الحالات التي نحن بحاجة الى ان نرى في غرفة مظلمة ولكن لا تزال ترغب في الحفاظ على الظلام الكلي (على سبيل المثال ، وإزالة بسرعة أو إضافة جهاز الرصد في حاضنة التي هي في مرحلتها الظلام) ، ونحن ببساطة استخدام المصباح القياسية التي غطى مع أحمر تصفية. بدلا من أو بالإضافة إلى ذلك ، إذا غرفة مظلمة الخاص ومصابيح الفلورسنت ، وغطاء لهم ورقة حمراء أو تصفية لديها ضوء مكتب مستقل المتوهجة مغطاة رقة الترشيح من هذا القبيل. فمن المستبعد جدا أن تعريض الذباب في الظلام للتعرض قصيرة جدا (بضع ثوان) من الضوء الأحمر سوف تؤثر ساعاتها الإيقاعية. أيضا ، على الرغم من أن نظام الساعة البيولوجية للذبابة الفاكهة هي حساسة جدا للضوء المرئي ، ونحن لا نعتقد صرير صغيرة من الضوء في غرفة مظلمة وسوف يترتب على ذلك ، وفي أي حال ، هو ممارسة جيدة للحفاظ على ابواب هذا البيت حاضنة للمراقبين فقط عندما فتح الضرورة. أيضا ، سوف يفتح فقط حاضنة واحدة في وقت واحد لأن هذا تقليل من إمكانية حدوث الحاضنة في مرحلته الظلام التعرض للضوء من الحاضنة في مرحلتها الخفيفة.
4. شراء انقطاع التيار الكهربائي (UPS) في حالات الطوارئ وحدة احتياطية لديها ما يكفي من القوة الكهربائية قدرة السلطة على مكونات نظام رصد النشاط في حالة تصاعد ، السنبلة ، أو انقطاع التيار الكهربائي في المبنى. توصيل وحدة UPS احتياطي للطوارئ لحالة الطوارئ في حلبة احتياطية من المبنى إذا كانت متوفرة. أن تدرك أنه حتى لو تم توصيل الجهاز بمأخذ الطارئة أثناء انقطاع التيار الكهربائي يمكن أن تكون هناك فترة انتقالية قصيرة قدر تبديل النظام إلى السلطة في حالات الطوارئ. خلال تلك المرحلة الانتقالية ، ويمكن فقدان السلطة لمدة ثوان قليلة حتى تؤدي الى اغلاق أجهزة الكمبيوتر والأضواء في الحاضنة يتم إيقاف. وبالتالي ، فمن المهم التأكد من أن أجهزة الكمبيوتر المستخدمة لجمع البيانات والنشاط ليست هي النظام المسيطر الاضواء في الحاضنة مدمن مخدرات الى السلطة فقط ولكن أيضا في حالات الطوارئ UPS ملف. إذا لم يتم السيطرة على نظام الإضاءة في حاضنة ينظم مباشرة من قبل الحاضنة (في معظم الحالات ، هو) ، ثم فإنه يكفي لسد الحاضنة في الظهورقوة الإرادة NCY دون UPS ، وانقطاع التيار الكهربائي لبضع ثوان لا تؤثر على درجة حرارة الغرفة. علما أنه في عام جهاز UPS سوف تبقي فقط لتشغيل المعدات الخاصة بك 50-30 دقيقة في غياب السلطة ، هدفها الرئيسي هو حماية ضد فقدان مؤقت للسلطة خلال الفترة الانتقالية من العادية إلى السلطة في حالات الطوارئ.
5. إعداد كمبيوتر ، جهاز كمبيوتر شخصي أو ماكنتوش ، مكرسة بالكامل لجمع البيانات و / أو للسيطرة على ضوء الحاضنات. لأن النظام سيقوم بتشغيل السد في كل وقت وغير المراقب ، فمن المستحسن أن هذا الكمبيوتر لديك برنامج تثبيت الحد الأدنى ، ويفضل أن لا اتصال الشبكة للتقليل من خطر الانهيار. بالإضافة إلى ذلك ، يحتاج النظام تخزين البيانات المحمولة ، مثل محرك أقراص Zip ، كاتبة CD / DVD ، أو USB ، للسماح لتحميل البيانات التي تم جمعها للتحليل لاحقة.
6. ترتيب الشبكة يدويا بدقة خط هاتفي حول رفوف للحاضنات للرقابة بيئيا للسماح سهولة توصيل / بنزع مراقبين النشاط. ويمكن شراء خطوط الهاتف القياسية ، والمحولات ، والخطان في المتاجر الإلكترونية التجارية واستخدامها. اقامة خطوط هاتفية متعددة في هذه الطريقة التي سوف تلتقي في واحدة وتمديد الخط الرئيسي للخروج من الحاضنة للاتصال الكمبيوتر.
7. ربط أجهزة الرصد داخل الحاضنات إلى الكمبيوتر من خلال واجهة وحدة امدادات الطاقة (المربع الأزرق من شركة الملقب Trikinetics) ، الذي يعمل على مراقبة نشاط السلطة (Trikinetics شركة) عبر خط الهاتف. هذا العرض واجهة السلطة وحدة الأعمال أيضا واجهة لنقل البيانات التبديل من خط هاتفي لكابل USB. اختياري تحكم الخفيفة في الوحدة نفسها التي يمكن من خلالها توصيل سلك خط كهرباء للنظام حاضنة للضوء ، وهو متاح للسماح للسيطرة الإيقاعية جدول الإضاءة الحاضنة عبر الكمبيوتر.
8. تقاس مصادر قناع ضوء LED ممكن من جهاز الكتروني أو غير صحيح الباب حاضنة ختم الشريط مع البط أو قطعة قماش سوداء لضمان تشغيل خال من الإيقاعات في غياب ضوء غير مرغوب فيه.

2. إعداد حيوانات التجارب

1. الظواهر السلوكية في ذبابة الفاكهة مثل الإيقاعية النظمية والنوم / الراحة النشاط هي حساسة جدا للاختلافات وراثية وعمر حيوانات التجربة (كوه وآخرون 2006). لذا ، من الأهمية بمكان لتقييم هذه الظواهر باستخدام حيوانات الرقابة السليمة التي يتم تربيتها في الظروف البيئية ونفس من نفس الفئة العمرية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك إزدواج الشكل الجنسي في الإيقاعية النظمية (Helfrich فوستر 2000). الممارسة العامة هي استخدام الذباب الذكور البالغين التي يتم تربيتها في 25 درجة مئوية وبين 1 إلى 5 أيام قديمة لفحوصات النشاط الحركي. ذكور الذباب بدلا من الذباب الإناث وتستخدم عادة لوضع البيض سوف تؤثر على النشاط الحقيقي لقياس النشاط الحركي. بسبب إزدواج الشكل الجنسي ، والذباب الإناث قد يكون في بعض الأحيان يعاير بالمعلومات. وسوف تتكون من المواد الغذائية السكروز مجرد 5 ٪ و 2 ٪ آغار bacto منع البيض من غير عذراء الإناث من البلدان النامية وحركة اليرقات من التسبب في تهم النشاط الخاطئة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الذباب عذراء الإناث على الرغم من أنه قد تكون هناك اختلافات في نشاط التشكيلات تزاوج بين إناث والبكر (Helfrich - فورستر ، J. بيول. إيقاعات 2000).
2. عند دراسة الساعة البيولوجية والنوم / الراحة المعلمات من الذباب الطافر محددة من الفائدة ، فإنه من الحكمة أن تهجين المخزون متحولة مع سلالة البرية من نوع من الخلفية الجينية نفسها ، على سبيل المثال أو w1118 YW. سيؤدي هذا إلى إزالة الموقع الثاني المعدلات الوراثية التي يحتمل أن تكون قد قناع الإيقاعية النمط الظاهري أو النوم / الراحة. حيث لا يوجد عبور أكثر من الذكور في ذبابة الفاكهة ، فمن الأفضل لأداء تهجين عن طريق عبور متحولة مع الإناث البرية من نوع الذكور. وسلالة من النوع البري أيضا بمثابة عنصر التحكم المناسب للتجربة. البذور كلا من التحكم من النوع البري والذباب متحولة في نفس الوقت في ذبابة الفاكهة القياسية الغذائية حوالي 10 الى 14 يوما قبل التجربة الإيقاع الحركي النشاط (انظر بلومينغتون مركز ألبوم لذبابة الفاكهة وصفة غذائية ؛ http://flystocks.bio.indiana.edu /). عند eclosion من ذرية ، وجمع 1-5 أيام الذباب الذكور القديمة ووضعها جانبا لاستخدامها في التجارب.
3. مع العديد من الأدوات والموارد الوراثية مثل overexpression ، رني ، وأنسجة محددة يطير السائق GAL4 خطوط المتوفرة من مراكز مختلفة في جميع أنحاء العالم الأسهم ، فمن الممكن أن يشرح آثار overexpressing أو يطرق إلى أسفل جينات معينة في الأنسجة والزمنية المحددة الطريقة (العلامة التجارية وPerrimon 1993 ؛ ماغواير وآخرون 2004 ؛. Osterwalder وآخرون 2001). لدراسة الساعة البيولوجية والنوم / الراحة المعلمات باستخدام هذا النهج ، والذباب يحمل يبني المعدلة وراثيا مع وعبرت الأنسجة محددة أو المخدرات محرض GAL4 السائق (مثل الذكور) ليبني الذباب يحمل جينات معدلة وراثيا مع الهدف تعلق على الرد UAS (مثل الإناث البكر) حوالي 14 يوما قبل بدء النشاط الحركيالتجارب. عند eclosion من ذرية ، وجمع 1-5 أيام الذباب الذكور القديمة ووضعها جانبا لاستخدامها في التجارب. وتستخدم بشكل روتيني على خطوط الوالدية تستخدم لعبور وضوابط لهذه التجارب. ذرية من الصلبان من مستجيب UAS وخطوط التشغيل GAL4 مع الذباب البرية من نوع الخلفية الوراثية نفسها هي أيضا الضوابط المناسبة.
4. كما هو مبين في الخطوات التالية (2) و (3) ، وطول الوقت اللازم لإعداد حيوانات التجارب تختلف اختلافا كبيرا تبعا لطبيعة وتصميم التجربة. في حالة الحيوانات المعدلة وراثيا يجب أن يتم إنشاؤها أو إذا مخططات معبر حاجة لتنفيذه ، سيكون هناك حاجة الى مزيد من الوقت من الواضح أن. لأسباب لوجستية ، ويستغرق حوالي 14 يوما عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لذبابة الفاكهة لوضع البيض من الذباب الكبار.

3. إعداد أنابيب نشاط

1. أنابيب النشاط تمثل موائل الذبابة أثناء التجربة. فهي رقيقة (حوالي 5 ملم وقطرها ؛ المذكرة ، Trikinetics تقدم بأحجام مختلفة تبعا للأنواع ذبابة الفاكهة إلى أن يعاير) 5 ملم أنابيب زجاجية تحتوي على مادة غذائية واحدة في نهاية وتوصيله مع الغزل أو المكونات البلاستيكية في الطرف الآخر. حيث يمكن إعادة استخدام أنابيب زجاجية النشاط عدة مرات ، فإننا سوف تصف إجراءات إعداد باستخدام الأنابيب المستخدمة النشاط / تنظف من التجارب السابقة كنقطة انطلاق. إذا كنت تستخدم أنابيب نشاط جديد ، انتقل ببساطة إلى الخطوة (11).
2. فمن الأفضل استخدام أنابيب النشاط التي تمت حديثا منذ الطعام داخل الأنابيب لديه ميل لتجف ويحصل مع الفطريات الملوثة حتى الوقت بدل الضائع عند تخزينها في 4 درجة مئوية. انهم مستعدون عموما بضعة أيام إلى أسبوع قبل بدء التجربة. ولذلك فمن المهم لتقييم عدد من الأنابيب اللازمة لكل تجربة قبل إعدادهم.
3. إزالة شمعات (الغزل أو البلاستيك المكونات) من أنابيب الأنشطة المستخدمة ووضعها في كوب زجاجي كبير. وينبغي ملء الأنابيب فقط ما يصل الى نصف كوب. ملء الكأس مع ماء الصنبور ، والتأكد من أن يغرق في الأنابيب.
4. الميكروويف الكأس مملوءة أنابيب زجاجية حتى يأتي الماء لغلي الكامل السريع لإذابة الشمع والمواد الغذائية آغار.
5. الحيطة والحذر من أن الماء الساخن. إزالة كوب من فرن الميكروويف ويحرك الأنابيب مع ملعقة بلاستيكية أو ماصة 10 مل للسماح الشمع المحاصرين الى تطفو الى الاعلى. ثم كرر الخطوة (4).
6. إزالة كوب من فرن الميكروويف وانتظر حتى يبرد. وسوف يضع الكأس في غرفة باردة (إذا كان متوفرا) تسريع هذه العملية.
7. كما يبرد الماء ، وجمع الشمع على سطح الماء ويتصلب تدريجيا. ببساطة إزالة الشمع طدت باليد. هذا يجب التخلص من أكثر من الشمع على الأنابيب.
8. أنابيب نقل النشاط إلى دورق جديدة مع الاستفادة من المياه العذبة وكرر الخطوات من (4) و (5).
9. منذ تمت إزالة معظم الشمع في الخطوة (7) ، فإنه ليس من الضروري الانتظار لالشمع ليصلب. ببساطة صب الماء من كوب ونقل الأنابيب إلى آخر الكأس الجديدة. الحيطة والحذر من أن المياه لا تزال ساخنة.
10. كرر الخطوات من (4) و (5) للمرة الأخيرة. صب الماء من كوب والانتظار لأنابيب النشاط حتى يبرد.
11. تحميلها عموديا إلى 250 مل أو الأكواب الزجاجية 500mL. تأكد من أنها ليست معبأة بإحكام جدا. تعقيم لهم باستخدام الأوتوكلاف مع دورة جافة أو ببساطة استخدام فرن تجفيف لتجفيف الأنابيب.
12. بشكل منفصل ، لإعداد الطعام ليتم تحميلها في أنابيب النشاط ، وجعل حل السكروز بنسبة 5 ٪ (سيغما) و 2 ٪ Bacto آغار (دينار بحريني) في الماء المقطر أو ماء الحنفية. الأوتوكلاف لتعقيم الحل. ويمكن استخدام الغذاء تعقيمها مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية لفترة ممتدة من الزمن. بمجرد أن يتصلب الطعام ، وسوف يحتاج المرء إلى تسييل الميكروويف وذلك من أجل سد الأنابيب. ويمكن تخزين الجزء غير المستخدم من المواد الغذائية واستخدامها في وقت لاحق.
13. الطعام وينبغي من الناحية المثالية حوالي 65 درجة مئوية عند استخدامه لملء الأنابيب النشاط. إذا كان الجو حارا جدا ، وسوف تتراكم الكثير من التكثيف داخل الأنابيب. إذا لم يكن ساخنا بما فيه الكفاية ، وسوف يصلب قبل الطعام تمتلئ بالتساوي الأنابيب. لملء الأنابيب النشاط مع الغذاء ، واستخدام ماصة 10 مل إلى ماصة الحل الطعام السائل على طول الجدار داخل الدورق الزجاجي ، والسماح للحل الطعام لملء الأنبوب النشاط من أسفل إلى أعلى ، حتى الأنابيب هي ثلث شغلها مع الحل. تمتلئ بالتساوي دوامة حول الدورق بلطف للتأكد من جميع الأنابيب ، وخصوصا تلك الموجودة في وسط الكأس ، مع حل الغذائية. انتظر الغذائية لترسيخ تماما سواء في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. انتقل إلى الخطوة التالية مرة واحدة التكثيف داخل أنابيب زجاجية تتبدد.
14. لإزالة أنابيب النشاط من الكأس ، ودفع الأنابيب باتجاه أسفل الدورق وتطور الأنابيب في نفس الوقت بحيث توطد الغذائية داخل الأنابيب والقاعإرادة دورق منفصل. تتخذ أنابيب من الدورق ، ويفضل أن حفنة واحدة.
15. تنظيف الأنابيب واحدا تلو الآخر مع المناشف الورقية لإزالة المواد الغذائية الزائدة على السطح الخارجي للأنابيب. تعيين أنابيب جانبا في وعاء نظيف.
16. تأخذ كتلة المختبر العام دون تدفئة حامل أنبوب التدفئة وتغطية بعناية بشكل جيد مع عدة طبقات من رقائق الألومنيوم قوية. إضافة البارافين (الشمع) في كريات التدفئة الالومنيوم مبطنة جيدا في الذوبان.
17. عقد في نهاية أنابيب غير الغذائية وتراجع في نهاية الغذاء في الشمع المنصهر. تراجع الجزء مشمع في دورق زجاجي مملوء بالماء البارد لتسريع تصلب الشمع. أكرر مرة واحدة. وسوف ينخفض ​​الأنابيب في المياه مشمع منع أنابيب من الالتصاق معا.
18. ويمكن استخدام هذه الأنابيب على الفور ، أو تخزينها في وعاء محكم في 4 درجات مئوية للاستخدام في غضون أسبوع. سوف التخزين لفترات طويلة يؤدي إلى جفاف المفرطة من المواد الغذائية. إذا تم تخزين الأنابيب عند درجة 4 ، تأكد من الحار لهم حتى لدرجة الحرارة المحيطة من خلال ترك لهم على مقاعد البدلاء قبل أعلى للاستخدام.

4. تحميل الذباب في أنابيب النشاط الحركي ، ونظام مراقبة النشاط

1. قبل التحميل الذباب في أنابيب النشاط ، تشغيل الحاضنات التي سيتم استخدامها لإيواء تراقب النشاط. ضبط درجة حرارة الحاضنة باستخدام عناصر التحكم وضبط النظام الضوء / الظلام باستخدام ضوء نظام تحكم السد أو في حاضنات خاصة نظام مراقبة الضوء وفقا لتصميم التجارب المطلوبة. وينبغي أن الوقت اللازم لتحميل الذباب في أنابيب النشاط يكون كافيا لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة.
2. تخدير الذباب مع ثاني أكسيد الكربون.
3. استخدام الفرشاة بلطف غرامة لنقل ذبابة واحدة في أنبوب النشاط.
4. الاستيلاء على منتصف قطعة واحدة من الغزول التي تبلغ حوالي نصف بوصة مع ملقط غرامة الغزل وتضاف الى نهاية غير الغذائية من الأنبوب النشاط لسد افتتاح ومنع الطيران من الهرب خلال التجربة ، بينما في الوقت نفسه الوقت يسمح بتدفق الهواء في الأنبوب. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أغطية من البلاستيك مع الثقوب الصغيرة (Trikinetics ، المؤتمر الوطني العراقي) لإغلاق الفتحة.
5. تأكد من وضع أنابيب على جنوبهم حتى يوقظ يطير ، وإلا كان هناك خطر على ذبابة يعلقوا على الغذاء.
6. تضاف إلى أنابيب مراقبي النشاط. مع نموذج أحدث وأكثر إحكاما من المراقبين Trikinetics (Trikinetics DAM2 وDAM2 - 7) ، فمن الضروري عقد الأنابيب في مكان مع الأربطة المطاطية لضمان أن تكون حزمة الأشعة تحت الحمراء أنبوب يمر في موقف الوسط.
7. وضع مراقبين في نشاط الحاضنات وربط لهم حتى لنظام جمع البيانات عن طريق أسلاك الهاتف. الاختيار باستخدام مجموعة برمجيات نظام السد للتأكد من التوصيل جميع المراقبين بشكل صحيح ويتم جمع البيانات من كل واحد منهم. رصد الأشعة تحت الحمراء تنبعث شعاع ضوء في وسط كل أنبوب زجاجي النشاط. يتم تسجيل النشاط الحركي للذباب والبيانات الثنائية الخام حيث سجلت "واحد" في كل مرة يتم كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء أو يتم تسجيل "صفر" الذي لم تكسر شعاع الأشعة تحت الحمراء.

5. التصميم التجريبي لتسجيل البيانات لتحديد وتيرة الإيقاعية والسعة

1. تتم مزامنة الذباب ومجرور عن طريق تعريضها لضوء النظام / الظلام (LD) ودرجة الحرارة المرغوبة ل2-5 أيام كاملة. الشرط entrainment الأكثر شيوعا هي دورة الضوء / الظلام من 12 ساعة ضوء / 12 ساعة مظلمة (12:12 LD) عند 25 درجة مئوية. ويستند هذا الشرط أساسا المقبولة عموما على مستوى الفكر التي نشأت من ذبابة الفاكهة الاستوائية المنحدرين من المواقع. عند دراسة ايقاعات كل يوم هناك بعض العبارات التي يحتاج المرء ليصبح على دراية. ذات الصلة في هذا البروتوكول ، ويعرف الوقت الذي يكون فيه الأضواء على الانتقال في الحاضنة مع مرور الوقت zeitgeber 0 (ZT0) وجميع أوقات أخرى هي بالنسبة إلى تلك القيمة (على سبيل المثال ، في دورة LD 12:12 ، ZT12 هو الوقت الذي يكون فيه يتم تشغيل الأنوار). تحت الظروف القياسية LD 12:12 والبرية نوع ذبابة الفاكهة السوداء البطن يحمل في العادة مرتين نوبات من النشاط ، واحدة تتمحور حول ZT0 يسمى "الصباح" الذروة وآخر حول ZT12 يسمى "المساء" الذروة (الشكل 3A). يتم التحكم في نوبات صباحية ومسائية من الساعة الذاتية ولكن هناك أيضا "فزع" الاستجابات التي هي عابرة رشقات نارية من النشاط في الاستجابة للضوء التحولات / الظلام. بعد يومين من entrainment هو الحد الأدنى ، ويمكن استخدامها ، على سبيل المثال ، في الشاشات الكبيرة التي هي أكثر وقتا طويلا وتكون موجهة نحو قياس حرة تعمل في الظلام فترات ثابتة (انظر أدناه ، الخطوة 2). ومع ذلك ، إذا كنت ترغب في دراسة أنماط النشاط خلال دورة الظلام الخفيف يوميا ، فمن الأفضل للحفاظ على الذباب ل4-5 أيام في LD وذلك للحصول على المزيد من البيانات. أساسا ، وزيادة عدد من الذباب أو عدد أيام دينار في تحليل البيانات النهائية (على سبيل المثال ، تجمع البيانات من الأخيرينسيكون يوما بقيمة النشاط الحركي LD) تولد أكثر موثوقية ملامح النشاط نهاري والقياسات (على سبيل المثال ، وتوقيت الذروة الصباحية أو المسائية). وعلاوة على ذلك ، والتوزيع اليومي للنشاط يختلف كدالة طول اليوم (الضوئية) ودرجة الحرارة. والسبب الرئيسي لتغيير الإضاءة أو درجة الحرارة من هو معيار إذا كان أحد المطلوبين لدراسة كيفية أنماط النشاط اليومي الخضوع التكيف الموسمية (على سبيل المثال تشن وآخرون 2007). ويمكن أيضا أن تكون ذبابة الفاكهة مجرور لدورات درجة الحرارة اليومية (مثل جلاسر وStanewsky 2005 ؛ Sehadova وآخرون 2009). دورات في درجة الحرارة التي تختلف من 2-3 درجات مئوية فقط تكفي لإيقاعات نشاط جر.
2. ويتم قياس النشاط الحركي الحر تشغيل إيقاعات تحت جنح الظلام المستمر وظروف الحرارة بعد الانتهاء من فترة الجر (انظر أعلاه ، الخطوة 1). يمكن تغيير الإعداد للدورة ضوء في أي وقت في المرحلة المظلمة في اليوم الأخير من هذا القبيل أن LD اليوم التالي للتجربة يمثل اليوم الأول من DD. سبعة أيام من جمع البيانات DD كافية لحساب فترة الإيقاعية والسعة (على سبيل المثال ، قوة أو قوة الإيقاع) من الذباب. بشكل عام ، وحجم العينة لا يقل عن 16 من الذباب من الضروري الحصول موثوقة حرة تعمل لفترات معينة الوراثي. حتى إذا كان أحد لا يهتم إلا في قياس نشاط نهاري ، فإنه لا يزال أفضل لقياس الذباب حرة تعمل في فترات DD عن التغيرات في الفترة الذاتية يمكن تغيير التوزيع اليومي للنشاط في LD. على سبيل المثال ، والذباب مع فترات طويلة الذاتية المعرض عادة في ذروة المساء المتأخر دينار (على سبيل المثال ، انظر الشكل 4).
3. في ختام التجربة ، التي تم جمعها باستخدام البيانات الثنائية الخام يتم تحميل برنامج نظام السد على جهاز محمول لتخزين البيانات ، على سبيل المثال مفتاح USB.
4. تتم معالجة البيانات الثنائية الخام باستخدام السد Filescan102X (Trikinetics ، المؤتمر الوطني العراقي) ، ولخص في 15 و 30 دقيقة عند تحليل صناديق المعلمات الإيقاعية ، أو صناديق دقيقة 1-5 عند تحليل النوم / الراحة المعلمات. حاليا ، خمس دقائق متواصلة من الخمول هو تعريف موحد من النوم / الراحة في ذبابة الفاكهة (هندريكس وآخرون 2000 ؛. سيغال هو و2005).
5. هناك العديد من الطرق المختلفة لتحليل المعطيات التي جمعت حول نظام السد لكننا لن توفر سوى تلك الأساليب المستخدمة عادة في المختبر. يستخدم Microsoft Excel لتعيين التركيب الوراثي للجماعات عينة مختلفة. FaasX البرمجيات (M. Boudinot وRouyer F. ، المركز الوطني للبحث العلمي لا ، GIF سور ايفيت سيدكس ، فرنسا) أو المؤرق (مطلب يستند البرنامج ؛ يزلي أشمور ، جامعة بيتسبرغ ، والسلطة الفلسطينية) وتستخدم لفحص الإيقاعية ( على سبيل المثال فترة والسلطة) أو النوم / الراحة (مثل النوم مئوية ، يعني بقية المباراة طول) معلمات على التوالي.

6. ممثل النتائج

عند الانتهاء من هذا البروتوكول ، يمكن للمرء استخدام نفس البيانات تعيين المعلمات على حد سواء لدراسة الساعة البيولوجية والنوم من حيوانات التجارب في ما يتعلق الحيوانات السيطرة.

تحليل معلمات الإيقاعية : يمكن إنشاء الرسوم البيانية التي توضح أنشطة التعليم الحركي اليومي أو أنشطة من الذباب المتوسط ​​على مدى عدة ايام في ظروف دينار أو DD FaasX به (الشكل 3) ذبابة الفاكهة السوداء البطن المعرض عموما اثنين نوبات من النشاط ، واحدة تتمحور حول ZT0 (أو التصوير المقطعي. ) تسمى "الصباح" الذروة وآخر حول (CT 12) ZT12 يسمى الذروة "المساء". وتسيطر هذه نوبات اثنين من الأنشطة التي تقوم بها على مدار الساعة الذاتية ، بل ويمكن أن يلاحظ في ظروف خالية من تشغيل DD (الشكل 3B). ويمكن بسهولة تغيير في توقيت هذه القمم النشاط الواجب مراعاتها في التعليم والرسوم البيانية قد يشير إلى تغيير في خصائص الذاتية على مدار الساعة. آخر الممتلكات التي تدل على وظيفة مناسبة على مدار الساعة هو زيادة النشاط الحركي في الاستباقي لوحظ في دورات LD أن يحدث قبل الانتقال الفعلي الظلام إلى النور أو الضوء إلى الظلام (3A الشكل والسهام). لوحظ بشكل واضح هذا السلوك في البرية نوع الذباب (الشكل 3A) ، ولكن غير موجودة في المسوخ في عدم اتساق نبضات القلب مثل ⁰ (الشكل 3C) (كونوبكا وBenzer ، PNAS ، 1971). في حالة من المسوخ ⁰ لكل واحظت "الصباح" و "المساء" في قمم LD هي ردود باغت بحتة نظرا لحدوث تغيرات مفاجئة في ضوء / الظروف المظلمة (أي 'clockless" الذباب لا نتوقع تغيرات بيئية ولكن مجرد رد فعل لهم ). فقدان النظمية السلوكية هي أكثر وضوحا في DD ويظهر عموما في فقدان تام للقمم الصباح أو في المساء من النشاط الحركي (نوبات عشوائية أي من النشاط والخمول) ، كما رأينا في الذباب ⁰ في (الشكل 3D). بالإضافة إلى الرسوم البيانية التعليم ، ويمكن تمثيل بيانات النشاط الحركي كما actogram المزدوج مؤامرة (FaasX) ، حيث يتم رسم يومين من البيانات بشكل تسلسلي في كل سطر ، لكن ملف في اليوم الأخير ليبدأ السطر التالي من يومين بقيمة النشاط (الشكل 4). على سبيل المثال ، يتم رسم LD1 و 2 في السطر الأول من رانه actogram. السطر التالي يبدأ مع تكرار LD2 وتبعتها LD3 وهلم جرا. بعد هذا الشكل ، ويتضح من البيانات المتعلقة بالنشاط الحركي تمتد التجربة برمتها في actogram. يمكن رسم Actograms لكل فرد يطير ، أو يطير لكل الوراثي. ميزة واحدة من خلال الرسوم البيانية actograms التعليم هو أن التغيير في طول فترة إيقاعات النشاط اليومي يمكن ملاحظتها بسهولة (الشكل 4). إلى جانب التعليم وتوليد الرسوم البيانية actograms ، يمكن تقديم البيانات المتعلقة بالنشاط الحركي من حالة إلى DD FaasX لحساب طول فترة استخدام عدد من البرامج المختلفة ، بما في ذلك دورة ف.

تحليل من النوم / الراحة المعلمات : باستخدام التعريف الحالي من النوم / الراحة في ذبابة الفاكهة (هندريكس وآخرون 2000) ، الذي هو خمس دقائق متواصلة من الخمول ، يمكن للمرء أن تحليل البيانات المسجلة من النشاط الحركي المقايسات ودراسة متعددة باستخدام المعلمات النوم المؤرق (L. أشمور) ، وهو برنامج ماتلاب مقرا لها. ويمكن أن يحسب في المئة من الوقت الذي تنفق الذباب النوم في فترات زمنية مختلفة ، مثل النوم في المئة في كل ساعة (الشكل 5A) ، أو 12 ساعة (الشكل 5B). معلمات أخرى النوم أكثر شيوعا التي يمكن دراستها وتشمل بقية يعني طول موجة (الشكل 5C) وبعد فرز النشاط (الشكل 5D). يعني النوم / الراحة نوبة طول هو مقياس لكيفية دمج النوم ويمكن أن توضح نوعية النوم. النشاط عقب ، كما يوحي اسمها ، هو مقياس لمعدل النشاط عند الذباب في اليقظة. هذه المعلمة يساعد على التفريق بين الذباب التي تتأثر حقا في النوم / الراحة السلوكيات مقابل تلك التي هي إما مريضة أو مفرط. على سبيل المثال ، قد سئموا الذباب الذي يبدو ببساطة الى النوم أكثر لأنهم ليسوا كما النقالة. لهذه الذباب ، ونشاطهم بعد أن تكون أقل بالنسبة للسيطرة على الحيوانات.

الشكل 1 : مخطط انسيابي يبين الخطوات الرئيسية لمعايرة النشاط الحركي في الإيقاعات ذبابة الفاكهة وترد الإجراءات على اليسار في حين ترد تعليقات مفيدة على الحق. مقدار الوقت المطلوب لتنفيذ الصلبان اللازمة والتلاعب الجيني للحصول على الذباب مع الحق الوراثي للتجارب محددة متغيرة تبعا لطبيعة وتصميم التجربة. خطوتين التي تحمل علامة النجمة (*) تقديم الإطار الزمني لالذباب الكبار عندما تحتاج إلى المصنف / تزاوج لتوليد السلالات من العمر المناسب (1 الى 5 أيام من العمر) للتجربة.

الشكل 2 : رسم تخطيطي يوضح أسلاك الاتصالات بين المكونات المختلفة للنشاط الحركي ذبابة الفاكهة جمع البيانات باستخدام نظام دام يتم استخدام جهاز كمبيوتر مخصص لتسجيل التهم النشاط الحركي لذبابة الفاكهة. ويعيش داخل تراقب نشاط الحاضنات مجهزة درجة الحرارة والإضاءة (تشغيل / إيقاف) السيطرة. ويمكن أيضا أن تستخدم الكمبيوتر للسيطرة على توقيت ضوء تشغيل / إيقاف في الحاضنات إذا كان يمكن التوصيل مصدر الطاقة لنظام الإضاءة تصل إلى السلطة وحدة العرض (اختياري). تدار الاتصالات بين الكمبيوتر وتراقب النشاط / الحاضنات من قبل واجهة وحدة امدادات الطاقة. يتم توصيل جهاز الكمبيوتر امدادات الطاقة ، وحدة وحاضنات (إذا كان التحكم في الإضاءة مستقلة عن الكمبيوتر) لمأخذ التيار المتردد عن طريق اتحاد الوطنيين الكونغوليين لضمان مراقبة متواصلة من النشاط المستمر والإضاءة خلال المرحلة الخفيفة. فمن المستحسن لربط جميع الأجهزة الكهربائية للدوائر احتياطي للطوارئ في المرافق ، إذا كانت متوفرة.

الشكل 3 : التعليم تم إنشاؤها باستخدام الرسوم البيانية اليومية تظهر FaasX النشاط الحركي للايقاعات الايقاعي الذباب نوع البرية (ث ⁰ في الذباب يحمل في + التحوير) (A و B) في مقابل عدم اتساق نبضات القلب ⁰ ث في المسوخ (C و D) تم الاحتفاظ بها الذباب ذكر عند 25 درجة مئوية ومجرور لمدة 4 أيام في LD 12:12 (النور : الظلام) تليها دورات سبعة أيام في DD (ظلام مستمر). لكل خط الطيران ، تم قياس مستويات النشاط الحركي للفرد الذباب (ن> 32) في صناديق لمدة 15 دقيقة ثم بلغ متوسط ​​للحصول على ملف ممثل المجموعة لهذا الخط. A و C تظهر البيانات الناتجة عن نشاط متوسط ​​في اليومين الثاني والثالث في ضوء / دورة الظلام (LD 2-3) في حين B و D تظهر البيانات الناتجة عن نشاط متوسط ​​في اليومين الثاني والثالث في ظلام مستمر (2-3 DD ). أشرطة عمودية تمثل النشاط (في وحدات التعسفي) سجلت في 15 دقيقة خلال الفترة صناديق الضوء (رمادي فاتح) أو الفترة المظلمة (رمادي غامق). قضبان أفقية في أسفل الرسوم البيانية التعليم LD ؛ أبيض ، أضواء ، أسود ، الأنوار. وZT0 ZT12 تمثل بداية ونهاية الإضاءة على التوالي. الرسوم البيانية لتعليم DD ؛ CT0 وrepr CT12ESENT بداية ونهاية اليوم ذاتي في ظروف مظلمة ثابتة ، الرمز بواسطة شريط الرمادية. في لوحة A ، M = الذروة الصباحية ؛ E = ذروة المساء. الأسهم في لوحة تمثل والسلوك الاستباقي من قمم الصباح والمساء لوحظت في الذباب نوع البرية ، والتي هي غائبة في ث ⁰ الذباب في عدم اتساق نبضات القلب.

بقيت نقرا مزدوجا مؤامرة actogram تم إنشاؤها باستخدام برنامج FaasX توضح بيانات النشاط الحركي مع نوع من الذباب البرية ، وقصيرة ، أو فترة طويلة ذكر الذباب في 25 درجة مئوية ومجرور لمدة 4 أيام في دورات LD 12:12 تليها ثمانية : الشكل 4. أيام في ظلام مستمر (DD) لحساب فترة حرة تعمل (ر) باستخدام دورة في FaasX - P. خطوط الطيران الثلاثة مع الفترة نوع البرية [ث لكل ⁰ ؛ في + ؛ في ⁰ متحولة تحمل في + التحوير] ، فترة طويلة [ث لكل ⁰ ؛ في (S47A) ؛ في ⁰ متحولة تحمل في التحوير (S47A)] ث [الفترة ، وقصيرة وترد في ⁰ متحولة تحمل في (S47D) التحوير] هنا ​​(تشيو وآخرون 2008) ؛ في ⁰ ؛ في (S47D). ويمثل المحور X - ZT أو CT في الوقت دينار أو DD على التوالي ، ويمثل المحور Y - تهم النشاط (وحدات اعتباطية) لخص في الدقيقة 15 صناديق. الخطوط الحمراء المنقطة الاتصال القمم مساء كل يوم من التجارب. نلاحظ أنه خلال LD هو "اضطر" ذروة المساء للحفاظ على التزامن مع دورة دينار على مدار 24 ساعة ، في حين أنه في الفترة DD الحرة يمكن تشغيل تحيد عن 24 ساعة. على سبيل المثال ، ليطير مع فترات قصيرة فإن توقيت النشاط تحدث في وقت سابق من مساء كل يوم على التوالي في DD (عندما تآمر ضد مقياس الوقت 24 ساعة ، كما هو موضح هنا) ، في حين لوحظ تحول إلى اليمين لفترة طويلة مع الذباب الفترات.

تعرضوا لمعيار دورة LD 12:12 في 25 درجة مئوية ؛ تحديد مقدار المعلمات النوم في ذبابة الفاكهة الذباب (كانتون CS - S) : الشكل 5 وقد استخدم ساهد (L. أشمور) لمعالجة البيانات واستخدام Microsoft Excel لإنشاء الرسوم البيانية هو موضح هنا. وقد تجمع ما لا يقل عن 70 الذباب الحصول على المعدلات المجموعة وأشرطة الخطأ (الخطأ المعياري للمتوسط) المبين. (أ) النوم الأساس تحسب كل ساعة ، أظهرت هو ممثل دورة اليومية. (ب) من دورة النوم الأساس اليومية ممثل تحسب كل 12 ساعة. (ج) متوسط ​​طول كل نوبة بقية المحسوبة في ال 12 ساعة الزيادات. (د) معدل النشاط الاستيقاظ تحسب كل 12 ساعة.

Discussion

في هذا البروتوكول ، وصفنا إجراءات لقياس النشاط الحركي الإيقاعات ذبابة الفاكهة ، وخرج من الساعات موثوقة السلوكية الإيقاعية الطيران التي تستخدم مثل قراءات مستوى وظيفة على مدار الساعة. وقد استخدم هذا الاختبار على نطاق واسع لشاشات رواية المسوخ ساعة (على سبيل المثال كونوبكا وBenzer 1971 ؛. Dubruille وآخرون 2009) ، ويستخدم باستمرار لتشريح وفهم وظيفة على مدار الساعة في الجسم الحي. كما تم استخدامه لدراسة دورة النوم في أعقاب الذباب ، وعلى الرغم من التقارير الأخيرة تشير إلى أن تحليل الفيديو الرقمي هو أكثر موثوقية في قياس النوم من استخدام الإيقاعات النشاط الحركي (زيمرمان وآخرون 2008). عند استخدام الإيقاعات النشاط الحركي لتحليل النوم ، والنسبة المئوية من النوم في النهار تميل الى أن تكون المبالغة.

لضمان نجاح واستنساخ هذا البروتوكول ، فمن الأهمية بمكان أن الذباب مقايسة التي تتشابه في العمر والخلفية الوراثية ، وتربى في ظل نفس الظروف ، والظواهر السلوكية في ذبابة الفاكهة مثل الإيقاعية النظمية والنشاط النوم / الراحة حساسة للغاية كل هذه العوامل. عند استخدام حاضنات متعددة لتجربة واحدة ، فمن المهم للتأكد من جميع الحاضنات هي في درجات الحرارة المتوقعة منذ بعض المعلمات الإيقاعية قد تتغير كدالة لدرجة الحرارة. كلمة واحدة من الحذر عند النظر في شراء حاضنات للعمل مع الذباب ، لا يتم إنشاء جميع على قدم المساواة. بينما نحن نتردد في التوصية أي وحدة خاصة أن هناك العديد من الخيارات. ويرد موردا جيدا للعثور على الشركات التي تبيع حاضنات للأعمال في ذبابة الفاكهة. بعض الشركات تبيع حتى "ذبابة الفاكهة الإيقاعية" حاضنات ، وفيه ميزات إضافية متوفرة ، مثل السلكية بالفعل للنظام Trikinetics التعلية ودرجة الحرارة (على سبيل المثال ، Tritech). الميزات الهامة تشمل القدرة للسيطرة على ضوء نهاري وحسن التحكم في درجة الحرارة في نطاق الفسيولوجية للذبابة الفاكهة (~ 15-30 درجة مئوية). أسعار وأحجام مختلفة من الحاضنات تختلف كثيرا ولكن مع المراقبين أجدد النشاط من Trikinetics وحاضنات حتى ولو كانت صغيرة يمكن أن تستوعب عددا كبيرا من هذه الأجهزة. أيضا ، بالرغم من أنه يمكن استخدام الحاضنات مع مراقبة الرطوبة وهذه الميزة المضافة هي ليست ضرورية طالما كنت مكان وعاء صغير مع الماء لتوفير الرطوبة (50-70 ٪ على ما يرام). أخيرا ، على الرغم من أننا تستخدم بشكل روتيني FaasX والمؤرق لتحليل البيانات في هذا البروتوكول ، وهناك برامج بديلة والبرمجيات المتاحة (Rosato وكيرياكو 2006) ، على سبيل المثال ClockLab (ActiMetrics) ، برانديز حزمة إيقاع (دال ويلر ، كلية بايلور للطب في هيوستن ) ، وMAZ (Zordan وآخرون 2007).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56°C-57°C
Block heater	VWR international	12621-014