Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila</em

Özet

Biz günlük lokomotor aktivite ritimleri kayıt için prosedürler tarif Drosophila Ve daha sonraki veri analizi. Lokomotor aktivite ritimleri hayvan gündelik saatler güvenilir bir davranış çıkış ve sirkadiyen mutantlar okuyan veya çevre sirkadiyen sistemini düzenler inceleyerek, saat fonksiyonu standart okuma olarak kullanılır.

Özet

En çok yaşam formları endojen sirkadiyen tarafından tahrik hücresel, fizyolojik ve davranışsal fenomenler (≡ 24 saat) Kalp pili veya saatler günlük ritimlerin sergilerler. Arızalar insan sirkadiyen sistemi çeşitli hastalıklar veya bozukluklar ile ilişkili. Sirkadiyen ritimleri altında yatan mekanizmaları anlayışımıza karşı çok büyük ilerleme kolayca ölçülen davranış ritmi saat fonksiyonu bir okuma olarak kullanılmasını sağlayan genetik ekranlarından ortaya çıkmıştır. Drosophila kullanılarak yapılan çalışmalar sirkadiyen ritimler altında yatan hücresel ve biyokimyasal temelleri anlayışımıza yeni ufuklar açan katkılar yaptık. Drosophilia'daki okuma ölçülen standart sirkadiyen davranışsal lokomotor aktivite. Genel olarak, izleme sistemi, özel olarak tasarlanmış cihazlar Drosophila lokomotor hareketin ölçebilirsiniz içerir . Bu cihazlar, bir karanlık oda bulunur ve kızılötesi ışık demetinin kesinti kullanarak, küçük tüpler içinde bulunan bireysel sineklerin lokomotor aktivite kayıt dayalı çevre kontrol inkübatörlerde yerleştirilmiştir. Pek çok gün içinde ölçülen zaman, Drosophila günlük aktivite ve hareketsizlik döngüleri, hayvan endojen sirkadiyen sistemi tarafından yönetilir davranışsal bir ritim gösterirler . Genel prosedür ticari lokomotor aktivite izleme cihazları ve veri analizi için yazılım programlarını geliştirme gelişiyle ile basitleştirilmiş oldu. Biz burada açıklanan usul ve şu anda, dünya çapında kullanılan en popüler bir sistemdir Trikinetics A.Ş., sistem kullanır. Daha yakın zamanlarda, aynı izleme cihazları Drosophila uyku davranışlarını incelemek için kullanılmıştır. Birçok sinek günlük uyku uyanıklık döngüleri eş zamanlı olarak ölçülür ve sürekli lokomotor aktivite verileri sadece 1 ila 2 hafta değer genellikle yeterlidir, çünkü bu sistem, Drosophila tezahür değişmiş sirkadiyen veya uyku özelliklerini belirlemek için büyük ölçekli ekranlar için idealdir.

Protokol

Protokolün genel tasarımı Şekil 1'de gösterilmiştir. Lokomotor aktivite, çevre kontrollü inkübatörler bir karanlık oda bulunan ev sahipliği cihazlar kullanılarak izlenmesi için kurulum, ilk kez bir araya gerekir. Bir kere, sistem tamamlandıktan sonraki tüm lokomotor aktivite ritm ölçümlerinde kullanılan olabilir. Her bir deney için, bir, (iii) yük aktivite tüpler içine uçar, (ii) bir besin kaynağı içeren cam faaliyet tüpler hazırlamak, transgenik hayvanlar üreten veya gerekli haçlar kurmak ve etkinliğini izler bağlamak, (i) deney hayvanlarında hazırlamak veri toplama sistemi, ve (iv) kayıt ve incelemek istiyor ne sirkadiyen veya uyku parametreleri bağlı olarak farklı yazılım kullanarak verileri analiz. Burada, biz sinek izleme cihazları ilk olarak istenilen ışık / karanlık çevre inkübatörlerde koşulları maruz süre olarak deney "start" tanımlamak.

1. Lokomotor Hareketi İzleme Sistemi kurma

1. Izleme sistemi, özel izleme cihazları, gündüz ışık kontrolü için kapasitesine sahip çevre inkübatörler, veri toplama cihazları, bilgisayarlar ve veri toplama cihazları (Şekil 2) izleme cihazları bağlamak için kablolama gibi periferik malzemeleri gibi çok sayıda donanım öğeleri içerir. Drosophila Activity Monitoring (DAM) ve veri toplama sistemi kurmak için talimatlar üreticisi (Trikinetics A.Ş.) tarafından sağlanmaktadır.
2. Lokomotor aktivite izleme sistemi ev için, özel bir karanlık oda, tercihen sıcaklık kontrol sistemi ile donatılmış, iyi havalandırılmış oda, seçin. Dahil tüm elektrik sistemleri (örneğin, bilgisayar ve inkübatörler), küçük ve sınırlı bir oda içinde zaman bir süre için çalışırken, aşırı ısı, oda sıcaklığında hızlı artışlara yol açan oluşturulabilir. Sonuç olarak, inkübatör, sıcaklık ve sıcaklık kontrolü başarısız olasılığı daha yüksektir korumak için ekstra iş yükü ile yükü olacak. Biz iyi havalandırılmış odalar için bile zor oda sıcaklığında muhafaza yapabilirsiniz sonbahar / kış, yaz aylarında klima geçiş ısıtmak için bu bulabilirsiniz. Bu gibi durumlarda ek havalandırma, aşırı ısınma riskini azaltmak için karanlık bir odaya monte gerekebilir. Ayrıca, gereksiz ısı üretimi en aza indirmek için kullanımda olmayan inkübatörler kapatmak için en iyisidir.
3. Harici ışık kaynaklarından gelen oda Seal. Giriş döner kapı ya da siyah bir perde ile kapatılmış olabilir. Bu istenmeyen ışık karanlık girme şansını en aza indirir gibi bir döner kapı tercih ederler. Karanlık oda içinde, meyve sirkadiyen sistemi (ve yeşil / mavi ışık ile karşılaştırıldığında çok daha az kırmızı ışık duyarlı) kızılötesi ışığa karşı duyarlı değildir uçar gibi tamamen karanlıkta çalışmak için gerekli değildir. Karanlık oda görmek gerekir ama yine de genel karanlığa (örneğin, hızlı kaldırma veya karanlık aşamasında olan bir inkübatör bir izleme cihazı ekleyerek) korumak isteyen durumlarda, biz sadece kırmızı kaplı olan standart bir el feneri kullanın filtre. Alternatif olarak ya da ek olarak, karanlık oda, floresan ışıkları varsa, kırmızı filtre kağıdı ile kapak ya da böyle bir filtre kağıdı ile kaplı bir stand-alone akkor masası ışık var. Sinekleri, çok kısa süreli olarak kırmızı ışık (birkaç saniye) karanlıkta açığa gündelik saatler etkileyecek son derece düşüktür. Ayrıca, Drosophila sirkadiyen sistemi görünür ışığa karşı çok hassas olmasına rağmen, biz karanlık ışığın küçük creaks dolaylı olacaktır düşünmüyorum; her durumda, iyi bir uygulamadır ev monitörleri sadece açtığınız inkübatör kapıları tutmak için gereklidir. Ayrıca, sadece bu kadar bir defada bir inkübatör açılması, ışık faz üzerinde bir kuluçka ışığa maruz kalma karanlık faz üzerinde bir kuluçka olasılığını en aza indirecektir.
4. Bina içinde dalgalanma, başak, ya da güç kesintisi durumunda güç etkinliği izleme sistemi bileşenleri için yeterli watt kapasitesi olan bir Kesintisiz Güç Kaynağı (UPS) acil durum yedekleme ünitesi satın alın. UPS acil yedekleme ünitesi varsa bina acil yedekleme devresine bağlayın. Sistemi, acil durum güç anahtarları gibi donanım bir elektrik kesintisi sırasında acil bir prize takılı olsa dahi, kısa bir geçiş dönemi olamayacağını farkında olun. Bu geçiş sırasında, hatta birkaç saniye için güç kaybı inkübatör kapalı kapatma bilgisayarlar ve ışıklar yol açabilir. Böylece, bilgisayarlar, faaliyet verileri ve inkübatör ışıkları kontrol sistemi sadece acil güç haline bağımlısı değil, aynı zamanda bir UPS toplamak için kullanılan sağlamak için önemlidir. Inkübatör aydınlatma kontrol sistemi, doğrudan inkübatör (çoğu zaman) tarafından düzenlenen değilse, o zaman ortaya içine inkübatör takmanız yeterli.birkaç saniye için güç kaybı gibi bir UPS olmadan NCY güç, oda sıcaklığı etkilemez. Genel olarak güç yokluğunda bir UPS cihazı sadece 5-30 dakika süreyle çalışan ekipman devam edeceğini unutmayın; ana amacı, düzenli olarak acil durum güç geçiş sırasında geçici güç kaybına karşı korumaktır.
5. Tam veri toplama ve / veya kuluçka ışık kontrolü için özel bir bilgisayar, PC veya Macintosh ayarlayın. DAM sistemi, her zaman ve katılımsız çalıştıran olacağından, bu bilgisayarda minimum yazılım çarpma riskini en aza indirmek için, tercihen bir ağ bağlantısı takılı olması tavsiye edilir. Buna ek olarak, sistem bir sonraki analiz için toplanan verileri indirmek için izin vermek için, taşınabilir veri depolama, örneğin, Zip sürücü, CD / DVD yazıcı veya USB ihtiyacı var.
6. El takıp / etkinliğini izler fişini kolaylaştırmak için çevre kontrollü kuluçka raf etrafında rahatça telefon hattı ağı ayarlayacaktır. Standart telefon hatları, adaptörler ve bölücülerin ticari elektronik mağazalarında satın alınan ve kullanılan olabilir. Birden fazla telefon hattı tek bir ana hat yakınsama ve bilgisayara bağlanmak için kuluçka uzatmak olacağını şekilde ayarlayın.
7. Inkübatörler içinde izleme cihazları, telefon hattı üzerinden güç (Trikinetics A.Ş.) aktivitesini izlemek hizmet veren bir güç kaynağı arabirim ünitesi (Trikinetics Inc aka Mavi kutu) ile bilgisayara bağlayın. Bu güç kaynağı ünitesi, aynı zamanda veri transferi için USB kablosu, telefon hattı geçiş bir arayüz olarak hareket eder. Inkübatör ışık sistemi güç hattı kablosunun bağlı olduğu aynı birimi, isteğe bağlı ışık denetleyici sirkadiyen inkübatör aydınlatma programının bilgisayar üzerinden kontrolünü sağlamak için kullanılabilir.
8. Elektronik cihaz ya da yanlış ördek bant veya serbest çalışan ritimleri sağlamak için siyah bir bez ile mühür inkübatör kapı LED Maske mümkün ışık kaynakları istenmeyen ışığın yokluğunda ölçülür.

2. Deney Hayvanları hazırlanması

1. Meyve Davranış fenotipleri, aktivite, test hayvanların genotipik ve yaş farklılıkları (Koh ve ark 2006) çok duyarlı sirkadiyen rhythmicity ve uyku / dinlenme gibi uçar . Bu nedenle, aynı çevre koşullarında ve aynı yaştaki yetiştirilen uygun kontrol hayvanları kullanarak bu fenotipleri değerlendirmek için çok önemli. Buna ek olarak, sirkadiyen rhythmicity cinsel dimorfizm (Helfrich-Foster, 2000) vardır. Genel uygulama 25 yetiştirilen yetişkin erkek sinekler ° C ve 1 ila 5 gün arasında lokomotor aktivite testleri için eski. Erkek yumurtlama aktivitesi lokomotor aktivite gerçek ölçümünü etkilemez, çünkü geleneksel olarak kullanılan dişi sinekler yerine uçar. Çünkü cinsel dimorfizm, bazen assaying erkek sineklerin bilgilendirici olabilir. Sadece% 5 sakkaroz ve% 2 bacto agar oluşan Gıda hatalı aktivite sayımları neden geliştirilmesi ve yumurtadan çıkan larvalar hareketi bakire olmayan kadınlarda yumurta önleyecektir. Alternatif olarak, faaliyet profilleri evlendirilen ve bakire kadın (Helfrich Forster, J. Biol. Ritimleri 2000) arasında farklılıklar olabilir rağmen bakire erkek sineklerin kullanılabilir.
2. Sirkadiyen ve uyku / dinlenme özel ilgi mutant sinekler parametreleri incelerken, aynı genetik arka plan, örneğin w1118 veya yw yabani tip suşu ile mutant stok outcross ihtiyatlı olduğunu. Bu, potansiyel olarak sirkadiyen veya uyku / dinlenme fenotip maske ikinci bir site genetik değiştiricileri kaldıracaktır. Olduğundan hiçbir kapısı üzerinde Drosophila erkek, yabani tip erkekler mutant kadın geçerek outcross gerçekleştirmek için daha iyidir. Yabani tip suşu da deneme için uygun bir kontrol olarak görev yapacak. Tohum hem yabani tip kontrol ve lokomotor aktivite ritim deneyi yaklaşık 10 ila 14 gün önce standart Drosophila gıda, aynı zamanda mutant sinekler (Bloomington yemek tarifi için Drosophila Stok Merkezi'ne bakın; http://flystocks.bio.indiana.edu /). Döl eclosion üzerine, 1-5 gün eski erkek sineklerin toplamak ve deneylerde kullanılmak üzere bir kenara koyun.
3. Aşırı ekspresyonu, RNAi ve dünya çapında farklı stok merkezlerinden kullanılabilir doku-spesifik GAL4 sürücü sinek hatları gibi çok sayıda genetik araçlar ve kaynaklar ile, eksprese veya vurma aşağı belirli genlerin etkilerini incelemek mümkün. Doku ve geçici özel şekilde (Marka ve Perrimon 1993; McGuire ve ark 2004;. Osterwalder ve ark 2001). Sirkadiyen incelemek ve bu yaklaşımı kullanarak, uyku / dinlenme parametreleri, doku-spesifik veya uyuşturucu indüklenebilir GAL4 sürücüsü (örneğin erkek) UAS cevaplayıcı (örneğin, bakire kadın) bağlı hedef genleri ile transgenik yapıları taşıyan sinekler geçti taşıyan transgenik yapıları uçar lokomotor aktivite başlamadan önce yaklaşık 14 gündeneyler. Döl eclosion üzerine, 1-5 gün eski erkek sineklerin toplamak ve deneylerde kullanılmak üzere bir kenara koyun. Ebeveyn hatları çapraz için kullanılan rutin deneyler için kontrol olarak kullanılır. UAS cevaplayıcı ve aynı genetik arka plan vahşi tip sinekler GAL4 sürücü hatları haçlar Döl da uygun kontrollerin.
4. Adımları belirtilen (2) ve (3), süresini, deney hayvanlarında hazırlanması için gerekli deney doğa ve tasarım büyük ölçüde bağlı olarak değişir. Transgenik hayvanlar elde edilecek veya geçiş şemaları idam gerekiyorsa, daha fazla zaman tabii ki gerekli olacaktır gereken durumda. Lojistik nedenlerden dolayı, 25 yaşında yaklaşık 14 gün sürer ° C Drosophila için yumurtadan ergin sinek geliştirmek.

3. Faaliyet Tüpler hazırlanması

1. Etkinlik tüpler deney sırasında sinek habitatı temsil eder. Bir ucunda besin maddesi içerir ve diğer ucunda iplik veya plastik fiş takılı 5 mm cam tüpler Bunlar; (not Trikinetics çalışılmalıdır Drosophila türler bağlı olarak farklı boyutlarda yaklaşık 5 mm çapında ince). Cam faaliyet tüpleri birden çok kez tekrar edilebilir, biz, başlangıç ​​noktası olarak daha önceki deneylerde kullanılan / temizlenmemiş faaliyet tüpler kullanarak, hazırlık işlemleri anlatacağım. Yeni bir etkinlik tüpler kullanılarak, sadece adım (11) atlayın.
2. Bu tüpler içindeki gıda kadar kuru bir eğilimi vardır ve 4 ° C'de saklanan fazla mesai bile ne zaman mantar ile kontamine olur bu yana taze yapılmış faaliyet tüpleri kullanmak için tercih edilir Genellikle birkaç gün öncesinde deney başlamadan bir hafta hazırlanır. Hazırlamadan önce, her bir deney için gerekli tüplerinin sayısını belirlemek amacıyla bu nedenle önemlidir.
3. Kullanılan faaliyet tüplerinden fişler (iplik veya plastik fiş) çıkarın ve büyük cam beher içine koydu. Tüpler beher sadece yarısı kadar doldurmaları gerekmektedir. Batığın tüpler emin olmak için, beher musluk suyu ile doldurun.
4. Mikrodalga beher cam tüpler dolu su, balmumu ve agar gıda eritmek için tam hızlı kaynama noktasına gelene kadar.
5. Sıcak su olduğundan dikkatli olunuz. Beher mikrodalga çıkarın ve tuzağa balmumu üst float izin vermek için bir spatula veya 10 ml pipet plastik tüpler karıştırın. Sonra adım (4) tekrarlayın.
6. Mikrodalga beher çıkarın ve soğumasını bekleyin. (Varsa), soğuk oda beher koymak süreci hızlandırır.
7. Su soğuduktan olarak, balmumu su yüzeyinde toplamak ve yavaş yavaş katılaşır. Sadece elle katılaşmış balmumu çıkarın. Bu borular üzerine mum kurtulmak gerekir.
8. Faaliyet tüpler taze musluk suyu ve adımları tekrarlayın (4) ve (5) ile yeni bir behere aktarın.
9. Balmumu adım kaldırıldı (7) bu yana, katılaşmaya balmumu için beklemek gerekli değildir. Sadece beher su dökün ve bir başka yeni behere tüpler aktarmak. Suyu hala sıcak olduğunu, dikkatli olunuz.
10. Adımların (4) (5), son kez tekrarlayın ve. Beher su dökün ve faaliyet tüpler için soğumasını bekleyin.
11. 250 ml veya 500 ml cam bardak içine dikey olarak yükleyin. Onlar çok sıkı dolu değil emin olun. Kuru bir döngü ile bir otoklav kullanarak veya basitçe tüpleri kuru bir kurutma fırını kullanın onları sterilize edin.
12. Ayrı ayrı faaliyet tüpler içine yüklemek için yiyecek hazırlamak için, distile su ya da musluk suyu% 5 sakkaroz (Sigma) ve% 2 Bacto agar (BD) bir çözüm olun. Otoklav çözüm sterilize etmek için. Otoklavlanmış gıda uzun bir süre için hemen kullanılabilir veya 4 ° C'de saklanabilir. Gıda katılaşır sonra, bir mikrodalga ihtiyaç ve tüpleri doldurmak amacıyla sıvılaştırılması. Gıda Kullanılmayan kısmı depolanır ve daha sonraki bir tarihte kullanılabilir.
13. Gıda ideal 65 civarında olmalıdır ° C faaliyet tüpleri doldurmak için kullanılır. Çok sıcak ise, çok fazla yoğunlaşma tüpler içinde birikir. Yeterince sıcak değilse, gıda tüpleri eşit şekilde doldurulur önce pekiştireceğiz. Tüpler üçte biri kadar gıda ile faaliyet tüpleri doldurmak için, gıda çözüm aşağıdan yukarıya doğru faaliyet tüp doldurmak için izin veren cam beher iç duvar boyunca sıvı gıda çözeltisi pipetle 10 ml pipet kullanmak dolu çözümü ile. Özellikle tüpleri, beher ortasında olanlar, emin olmak için hafifçe etrafında Swirl beher eşit besin solüsyonu ile doldurulur. Gıda oda sıcaklığında ya da 4 ° C ya tamamen katılaşmasını bekleyin. Cam tüpler içinde yoğunlaşma yaymak sonra bir sonraki adıma geçin.
14. Beher faaliyet tüpleri kaldırmak için, bu nedenle tüplerin kabın alt kısmına doğru itin ve aynı zamanda tüplerin büküm tüpler içinde katılaşmış gıda ve altbeher ayrı. Tercihen tek bir demet olarak, beher tüpleri atın.
15. Borular tek tek tüplerin dış yüzeyinde aşırı gıda kaldırmak için kağıt havlu ile temizleyin. Temiz bir kaba tüpler bir kenara ayarlayın.
16. Tüp tutucu olmayan bir genel laboratuar blok ısıtıcı alın ve dikkatli bir şekilde birkaç kat güçlü alüminyum folyo ile ısıtma kapsayacak. Eritmek için iyi alüminyum kaplı ısıtma parafin (mum) pelet ekleyin.
17. Gıda-dışı sonunda tüpler tutun ve gıda sonuna eritilmiş balmumu içine batırın. Mumlu kısmı balmumu katılaşma hızlandırmak için bir bardak soğuk su ile dolu beher içine batırın. Bir kez tekrarlayın. Suya mumlu tüpler Daldırma tüpleri birbirine yapışmasını önleyecektir.
18. Tüpler hemen kullanılır ya da hava geçirmez bir kapta 4 ° C de bir hafta içinde kullanılmak için saklanan olabilir. Uzun süreli depolama gıda aşırı kurumaya yol açacaktır. Eğer tüpler 4 ° C'de saklanır, kullanmadan önce tezgah üstüne bırakarak ortam sıcaklığına kadar ısıtmak için emin olun.

4. Yükleme Faaliyet Tüpler ve lokomotor Aktivite İzleme Sistemi içine Sinekler

1. Aktivite tüpler içine sinek yüklemeden önce, etkinliğini izler ev için kullanılacak inkübatörler açın. Inkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve istenilen deneysel tasarım göre BARAJI Sistemi ışık kontrol VEYA inkübatörler kendi ışık kontrol sistemi kullanarak açık / koyu rejimi ayarlanır. Aktivite tüpler içine sinek yüklemek için gerekli süre stabilize etmek için sıcaklık için yeterli olmalıdır.
2. Karbondioksit ile sinek anestezisi.
3. Hafifçe bir etkinlik tüp içine bir sinek aktarmak için ince bir fırça kullanın.
4. Ince forseps ile yarım santim çapında ve açılış fişi ve deney sırasında kaçan sineği önlemek için gıda-dışı faaliyet tüpün ucunu eklemek iplik iplik, tek bir parça ortasında tut, aynı zamanda tüpe hava akımı sağlar. Alternatif olarak, küçük delikler (Trikinetics, Inc.) Plastik kapaklar açılış kapatmak için kullanılabilir.
5. Tüpler sinek uyanır kadar onların yüzüne koydu, ya da başka bir gıda saplanıyor sinek riski vardır emin olun.
6. Tüpler etkinliğini izler içine yerleştirin. Trikinetics monitörler daha yeni, daha kompakt modeli (Trikinetics DAM2 ve DAM2-7), kızılötesi ışın tüp merkezi konumunda geçtiği sağlamak için lastik bantlar ile tüpleri tutmak için gereklidir.
7. Etkinliğini izler inkübatörler içine koyun ve telefon telleri üzerinden veri toplama sistemi onları kanca. Tüm monitörler düzgün bağladım ve her biri toplanan ediliyor BARAJI Sistem toplama yazılımı kullanarak kontrol edin. Monitör, her bir cam faaliyet tüp merkezi arasında kızılötesi ışık yayar. Sineklerin lokomotor aktivite "bir", kızılötesi ışın kırılmış ya da her zaman bir 'sıfır', kızılötesi ışın kırık olmadığı kaydedildi kaydedilir ham ikili veri olarak kaydedilir.

5. Sirkadiyen Periyot ve Genlik belirlenmesi için veri kaydetme Deneysel Tasarım

1. Sinekler 2-5 tam gün için istenen açık / koyu (LD) ve sıcaklık rejimi onları teşhir ederek senkronize ve sürüklenmemiş. En sık kullanılan sürüklenmesini durum 25 (12:12 LD) ışık / 12 saat karanlık 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünü ° C Bu genel kabul görmüş standart bir durum aslında Drosophila Afro-ekvatoryal konumlardan kaynaklandığı düşüncesi dayanmaktadır . Sirkadiyen ritimleri okuyan zaman bir ihtiyacı aşina olduğu bir anlatım var. , Bu protokol ile ilgili ışıkları inkübatörde zaman zeitgeber süresi 0 (ZT0) ve Diğer tüm zamanlarda, bu değeri (örneğin, 12:12 LD döngüsü göreceli olarak tanımlanır ZT12 ışıklar) kapatılır. Standart 12:12 LD şartlar altında, vahşi tip Drosophila melanogaster iki nöbetleri tipik olarak faaliyet gösterirler; ZT0 olarak adlandırdığı "sabah" ve "Akşam" tepe (Şekil 3A) olarak adlandırılan başka bir ZT12 etrafında zirve etrafında merkezli bir . Sabah ve akşam nöbetleri endojen saat tarafından kontrol edilen, ancak açık / koyu geçişleri yanıt geçici faaliyet patlamaları "irkilme" cevapları da vardır. Sürüklenmesini iki gün en az ve daha fazla zaman alan ve sürekli karanlıkta serbest çalışan dönemler (aşağıya bakınız, adım 2) ölçüm yönelik büyük ekran, örneğin, kullanılan olabilir. Ancak, günlük ışık-karanlık döngüsü sırasında aktivite kalıpları inceleyerek ilginizi çekiyorsa, daha fazla veri elde etmek için 4-5 gün LD sineklerin korumak için tercih. Esasen, son iki sinek numarası veya son veri analizi LD gün sayısı (örneğin, havuz verileri artanLD lokomotor aktivitesi değerinde gün) daha güvenilir gündüz aktivite profilleri ve ölçümleri (örneğin, sabah veya akşam pik zamanlaması) üretecektir. Ayrıca, günlük aktivite dağılımı, gün uzunluğu (fotoperiyodun) ve sıcaklık bir fonksiyonu olarak değişir. Bir faaliyet kalıplarının mevsimsel adaptasyon (örneğin, Chen ve ark 2007) geçmesi nasıl günlük çalışma istiyorsa Drosophila standart fotoperiyodun veya sıcaklık değiştirmek için önemli bir nedeni de günlük sıcaklık döngüleri (örneğin Glaser ve Stanewsky 2005 sürüklenmemiş olabilir. Sehadova ve ark 2009). Sadece 2-3 değişebilir Sıcaklık döngüleri ° C sürüklemek faaliyet ritimleri yeterlidir.
2. Serbest çalışan lokomotor aktivite ritimleri sürükleyici süresi (bkz. yukarıda, adım 1) bittikten sonra sürekli karanlık ve sıcaklık koşullarında ölçülür. Işık döngüsü için ayar deney, bir sonraki gün DD ilk gün temsil ettiği gibi LD son gününde karanlık aşamasında her zaman değiştirilebilir. GG veri toplama Yedi gün sirkadiyen dönemi ve sinek genlik (örneğin, güç ya da güç ritim) hesaplamak için yeterli. Genel olarak, en az 16 sineklerin bir örneklem büyüklüğü, belirli bir genotip için güvenilir serbest çalışan dönemler elde etmek için gerekli. Biri yalnızca gündüz aktivitesini ölçmek isteyen olsa bile, bu endojen dönemde değişiklikler LD faaliyet günlük dağıtım değiştirebilir DD sinekler 'serbest çalışan dönemler ölçmek için hala en iyi. Örneğin, uzun endojen dönemleri ile uçar genellikle (örneğin, bakınız Şekil 4) LD gecikmiş akşam doruklarına göstermelidir.
3. Deney bitiminde, ham ikili verileri BARAJI Sistem yazılımı taşınabilir bir veri depolama aygıtı, örneğin USB anahtarı indirilmek kullanılarak toplanmıştır.
4. Ham ikili veri BARAJI Filescan102X (Trikinetics, Inc.) Kullanılarak işlenir ve uyku / dinlenme parametreleri analiz ederken sirkadiyen parametreleri veya 1 ila 5 dakika kutuları analiz ederken, 15 ve 30 dakikalık bidonları içine toplanır. Şu anda, beş bitişik dakika hareketsizlik uyku / dinlenme Drosophila standart tanımlı (Hendricks ve ark 2000; Ho ve Sehgal 2005).
5. DAM Sisteminde toplanan verileri analiz etmek, ama biz sadece bizim laboratuvarda rutin olarak kullanılan bu yöntemlerin sağlayacak pek çok farklı yolları vardır. Microsoft Excel, farklı örneklem grupları için genotip atamak için kullanılır. FaasX yazılımı (M. ve F. Boudinot Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Fransa) veya Insomniac (Matlab tabanlı bir program; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA), sirkadiyen incelemek için kullanılan ( örneğin, süresi ve gücü) veya uyku / dinlenme (örneğin yüzde uyku süresini dersin geri kalanında ortalama) parametreler sırasıyla.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokolün tamamlanmasından sonra, bir kontrol hayvanları ile ilgili olarak deney hayvanlarında hem de sirkadiyen ve uyku parametreleri incelemek için aynı veri kullanabilirsiniz.

Sirkadiyen parametreleri Analizi: LD veya DD koşulların birkaç gün içinde günlük lokomotor faaliyetleri veya sinek ortalama faaliyetleri gösteren grafikler Eğitim FaasX (Şekil 3) kullanılarak üretilen Drosophila melanogaster genellikle iki maç faaliyet gösteren bir ZT0 (veya BT etrafında toplanmış. "sabah" tepe ve etrafında başka bir ZT12 (BT 12) olarak adlandırdığı "Akşam" zirve olarak). Bu iki maç faaliyetleri endojen saat tarafından kontrol edilir ve hatta serbest çalışan GG koşulları (Şekil 3B) görülebilir. Bu faaliyet zirvelerinden zamanlama değişiklikler, eğitim grafikleri kolayca gözlenebilir ve endojen saat özelliklerinde bir değişiklik gösterebilir. Doğru saat fonksiyonu gösterge niteliğindeki bir diğer özelliği, gerçek, koyu-açık veya hafif-koyu geçişleri (Şekil 3A, oklar) önce oluşur LD döngüleri gözlenen lokomotor aktivite beklenti artış. Bu davranış, vahşi tip sinekler (Şekil 3A) açıkça gözlenen, ancak ^{başına 0} (Şekil 3C) (Konopka Benzer, üretti, 1971) gibi aritmik mutantları yok . Başına ⁰ mutantlar durumda, gözlemlenen "sabah" ve LD "akşam" zirveleri (yani 'clockless' sinek çevresel bir değişiklik olmasını beklemiyoruz ışık / karanlık ortamlarda ani değişiklikler nedeniyle tamamen irkilme yanıtları sadece onlara tepki .) DD davranışsal rhythmicity kaybı çok daha belirgindir ve genellikle ortalama ⁰ sinekler (Şekil 3B) görüldüğü gibi lokomotor aktivite sabah veya akşam zirvelerinden toplam kaybı (yani rastgele nöbetleri aktivite ve hareketsizlik), tezahür eder. Eğitim grafikler ek olarak, lokomotor aktivite verileri veri iki gün, her satırda sırayla çizilir çift arsa actogram (FaasX) olarak temsil, ancak son günün profilini aktivitesi değerinde iki gün sonraki satıra (Şekil başlar. 4). Örneğin, LD1 ve 2 t on birinci hat olarak çizileno actogram. Sonraki satıra LD2 bir tekrarı ile başlar ve LD3 ve takip eder. Bu format, tüm deney kapsayan lokomotor aktivite veri actogram gösterilmiştir. Actograms için çizilen her bir sinek ya da her sinek genotip için olabilir. Eğitim grafikler üzerinde actograms bir avantajı, günlük aktivite ritimlerin dönemi uzunluğu bir değişiklik kolaylıkla gözlemlenebilir (Şekil 4) olmasıdır. GG lokomotor aktivite durumu verilerinin yanı sıra, eğitim grafikler ve actograms üreten Cycle-P de dahil olmak üzere bir dizi farklı programlar kullanarak süre uzunluğunu hesaplamak için FaasX için teslim edilebilir.

Uyku / dinlenme parametreleri Analizi: Drosophilia'daki uyku / dinlenme (Hendricks ark 2000), hareketsizlik beş bitişik dakika lokomotor aktivite deneyleri kaydedilen verilerin analiz ve Insomniac kullanarak birden fazla uyku parametreleri incelemek güncel bir tanım kullanarak (L. Ashmore), Matlab tabanlı bir program. Uyku harcamak uçar zaman yüzde farklı zaman aralıklarında hesaplanabilir, örneğin yüzde sleep (Şekil 5A), her saat veya 12 saat (Şekil 5B). İncelenen diğer daha sık uyku parametreleri süresini dersin geri kalanı (Şekil 5C) ve ardından faaliyet sayısı (Şekil 5D) anlamına gelir. Ortalama uyku / dinlenme süresini nöbeti, uyku ne kadar konsolide bir ölçüsüdür ve uyku kalitesini göstermek olabilir. Wake aktivite, adından da anlaşılacağı gibi, sinekleri uyanık aktivite oranının bir ölçüsüdür. Bu parametre, ya hasta ya da hiperaktif olanlar vs uyku / dinlenme davranışları gerçekten etkilenen sinekler arasında ayırt etmek için yardımcı olur. Örneğin, sadece hasta olan sinekler gibi mobil olmadığından, daha fazla uyku gibi görünebilir. Bu sinekler için, onların ardından faaliyet hayvanları kontrol etmek için ilgili olarak daha düşük olacaktır.

Şekil 1: Akış Şeması Drosophila lokomotor aktivite ritimleri assaying için en önemli adımları özetleyen işlemleri soldaki sunulmaktadır yararlı bir yorum hakkı verilmektedir. Belirli deneyler için sağ genotip ile sinekler elde etmek için gerekli haçlar ve genetik manipülasyonlar gerçekleştirmek için gerekli zaman miktarı, doğa ve deney tasarımı bağlı olarak değişkendir. Yıldız (*) ile işaretlenmiş iki adım yetişkin sinekler numaralı seribaşı / deneme için uygun yaş (1-5 gün) yavrularıyla oluşturmak evlendirilen gerekir zaman zaman çerçevesi sağlar.

Şekil 2: Kablolama diyagramı DAM Sistemi kullanarak Drosophila lokomotor aktivite veri toplama için farklı bileşenler arasındaki bağlantıları gösteren özel bir bilgisayar Drosophila lokomotor aktivite sayımları kaydetmek için kullanılır. Etkinlik monitörler, sıcaklık ve ışık (Açık / Kapalı) kontrolü ile donatılmıştır inkübatörler içinde muhafaza edilir. Bilgisayar da aydınlatma sistemi güç kaynağı Güç kaynağı ünitesi (isteğe bağlı) takılabilir eğer inkübatörler Açık / Kapalı ışığın zamanlamasını kontrol etmek için kullanılabilir. Bilgisayar arasındaki iletişimi ve etkinliğini izler / inkübatörler Güç kaynağı arabirim ünitesi tarafından yönetilir. Bilgisayar, güç kaynağı ünitesi ve inkübatörler (bilgisayar aydınlatma kontrolü bağımsız ise) ışık aşamasında faaliyet kesintisiz izleme ve sürekli aydınlatma sağlamak için UPC üzerinden AC elektrik prizine bağlı. Varsa, tüm elektrikli ev aletleri tesis acil yedekleme devreleri bağlamak için tavsiye edilir.

Şekil 3: Eğitim FaasX ritmik vahşi tip sinekler (w ⁰ ortalama kişi başına + transgen taşıyan sineklerin) (A ve B) vs. Aritmik w ortalama ⁰ mutantlar (C ve D) günlük lokomotor aktivite ritimleri gösteren kullanarak oluşturulan grafikler Bay sinekler tutuldu 25 ° C ve 4 gün 12:12 LD sürüklenmemiş döngüleri (ışık karanlık), DD (sabit karanlığa) yedi gün izledi. Her sinek hattı için 15 dakikalık kutularına bireysel sinekler (n> 32) lokomotor aktivite düzeyleri ölçülür ve daha sonra bu hat için bir grup profili temsilcisi elde etmek için ortalama edildi. A ve C, B ve D, sürekli karanlıkta, ikinci ve üçüncü gün ortalama (GG 2-3 üretilen faaliyet verileri göstermek ortalama aydınlık / karanlık döngüsü içinde ikinci ve üçüncü gün (LD 2-3) elde edilen faaliyet verileri göstermektedir .) Dikey çubuklar ışık dönemde (açık gri) veya (koyu gri) karanlık bir dönem sırasında 15 dakikalık kutularına kaydedilen aktivite (keyfi birimlerinde) temsil eder. LD eğitim grafikler alt kısmındaki yatay çubuklar; beyaz, ışık, siyah, ışıklar sönük. ZT0 ve ZT12 fotoperiyodun sırasıyla başlangıç ​​ve bitiş temsil eder. CT0 ve CT12 repr; GG eğitim grafikler içinESENT sürekli karanlık koşullarda öznel günün başlangıç ​​ve bitiş, gri çubuk ile gösterilir. Paneli A, M = sabah pik E = akşam zirve. Panelindeki okları ⁰ aritmik sinek başına w yok olan vahşi tip sinekler, gözlenen sabah ve akşam zirvelerinden beklenti davranışı temsil eder.

Şekil 4: vahşi tip, kısa ya da uzun süre ile sinek lokomotor aktivite verileri gösteren FaasX bir yazılım kullanılarak oluşturulan çift-plot actogram Erkek sinek ardından sekiz, 25 ° C'de muhafaza 4 gün 12:12 LD döngüleri için sürüklenmemiş FaasX Cycle-P kullanarak serbest çalışma süresi (t) hesaplanması için sürekli karanlık (DD) gün. Vahşi tip dönemde üç sinek hatları ^[0 ortalama W; başına +; başına ⁰ mutant + transgen ortalama taşıyan uzun bir süre ^[0 ortalama w; başına (S47A); ⁰ ortalama mutant (S47A) transgen ortalama taşıma], ve kısa süre [w ⁰ gereğince; başına (S47D); başına (S47D) transgen başına taşıyan mutant ^0] (. Chiu ve ark 2008) burada gösterilmiştir. X-ekseni, sırasıyla LD veya DD ZT veya CT zamanı temsil etmektedir ve Y ekseni, 15 dakikalık bir bidonları içine özetlenebilir aktivite sayımları (keyfi birimleri) temsil eder. Kırmızı noktalı çizgiler deneyler her gün akşam tepe bağlanır. LD sırasında akşam pik DD serbest çalışma süresi 24 saat sapma ise, 24 saat LD döngüsü ile senkronize korumak için 'zorla' olduğunu unutmayın. Örneğin, sağa doğru bir kayma uzun sinekler için incelendiğinde ise kısa süreler ile sinek için akşam aktivite zamanlaması, DD, birbirini izleyen her gün (burada gösterildiği gibi, bir 24 saat zaman ölçeği karşı çizilen) daha önce meydana gelecek dönemleri.

Şekil 5: Drosophila uyku parametreleri miktarının Sinekler (Kanton-S; CS), 25 ° C'de standart 12:12 LD döngüsü maruz bırakıldı Insomniac (L. Ashmore), veri ve Microsoft Excel Burada gösterilen grafikler oluşturmak için kullanılan işlemek için kullanılır oldu. Gösterilen grup ortalamaları ve hata çubukları (ortalama standart hata) en az 70 sinekler elde etmek için toplandı. (A) her saat hesaplanan Temel uyku; gösterilen günlük temsili bir döngüdür. (B) Temel uyku temsilcisi günlük döngüsü, her 12 saatte hesaplanır. 12 saatlik artışlarla hesaplanan dersin her dinlenme (C) ortalama uzunluğu. (D) her 12 saat uyanık aktivite oranı hesaplanır.

Tartışmalar

Bu protokol, Drosophila lokomotor aktivite ritimleri, saat fonksiyonu standart okuma olarak kullanılan sinek gündelik saatler güvenilir bir davranış çıkış ölçmek için prosedürler nitelendirdi. Bu testte roman saat mutantlar (örneğin Konopka ve Benzer 1971; Dubruille ve ark 2009) büyük ölçekli ekranlarında kullanılan ve sürekli olarak, in vivo olarak saat fonksiyonu incelemek ve anlamak için kullanılır . Ayrıca, son raporlar, video sayısal lokomotor aktivite ritimleri kullanarak daha uyku miktarının belirlenmesi çok daha güvenilir olduğunu göstermektedir rağmen sinekler uyku uyanıklık döngüsü çalışma olmuştur (Zimmerman ve ark 2008) . Uyku analiz lokomotor aktivite ritimleri kullanırken, gündüz uyku yüzdesi abartmış olma eğilimindedirler.

Çok hassas bir meyve gibi davranışsal fenotipleri sirkadiyen rhythmicity ve uyku / dinlenme faaliyetleri gibi uçar gibi bu protokolün başarı ve tekrarlanabilirliği sağlamak için, yaş, genetik arka plan benzer tahlil sinekler için kritik, ve aynı koşullar altında yetiştirilen Tüm bu faktörler. Tek bir deneme için birden fazla inkübatörler kullanırken, bazı sirkadiyen parametreler sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değişebilir bu yana tüm inkübatörler beklenen sıcaklıkta emin olmak için önemlidir. Bir uyarı sinekler ile çalışmak için inkübatörler satın almayı düşünen herkesin eşit oluşturulur. Birçok seçenek vardır herhangi bir özel birim tavsiye tereddüt ederken. Drosophila iş için inkübatörler satmak şirketler bulmak için iyi bir kaynak sağlanmaktadır. Bazı şirketler bile, zaten Trikinetics sistemi ve sıcaklık tırmanışı (örneğin, TriTech) kablolu olarak, ek özellikler mevcuttur, neyin "Drosophila sirkadiyen" inkübatörler satmak. Önemli özellikleri, gündüz ışık kontrolü ve Drosophila fizyolojik aralığında iyi bir sıcaklık kontrolü için yeteneği (~ 15-30 ° C ). Fiyatlar ve inkübatörler boyutları çok değişir ama Trikinetics gelen yeni etkinliğini izler, hatta küçük inkübatörler bu cihazların oldukça çok sayıda barındırabilir. Ayrıca, nem (% 50-70 ince) sağlamak için küçük bir tencerede su ile yer olarak nem kontrolü ile inkübatörler kullanılabilir olsa da, bu eklenen özellik sürece gerekli değildir. Son olarak, biz rutin olarak bu protokolü, veri analizi FaasX ve Insomniac kullanılmasına rağmen, alternatif programlar ve yazılımlar vardır (2006 Rosato ve Kyriacou), örneğin ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Ritim Paketi (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ), MAZ (Zordan ve ark 2007).

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56°C-57°C
Block heater	VWR international	12621-014