Saggio attività locomotoria per studiare ritmi circadiani del sonno e parametri in Drosophila</em

Riepilogo

Si descrivono le modalità per la registrazione quotidiana ritmi di attività locomotoria Drosophila E analisi dei dati. Ritmi di attività locomotoria sono una potenza affidabile comportamentale degli animali orologi circadiani e vengono utilizzati come standard di lettura quando si studia la funzione orologio circadiano mutanti o esaminando in che modo l'ambiente regola il sistema circadiano.

Abstract

Maggior parte delle forme di vita presentano ritmi quotidiani in cellulari, fenomeni fisiologici e comportamentali che sono guidati da circadiani endogeni (≡ 24 ore) pacemaker o orologi. Malfunzionamenti nel sistema circadiano umano sono associate a numerose malattie o disturbi. Molti passi avanti verso la comprensione dei meccanismi alla base ritmi circadiani è emerso dagli schermi genetico per cui un ritmo facilmente misurabile comportamentale è utilizzato come lettura della funzione orologio. Gli studi che utilizzano Drosophila hanno dato contributi fondamentali alla comprensione delle basi cellulari e biochimici alla base ritmi circadiani. Il comportamento standard di circadiani di read-out misurato in Drosophila è l'attività locomotoria. In generale, il sistema di monitoraggio coinvolge dispositivi specificamente progettati in grado di misurare il movimento locomotore di Drosophila. Questi dispositivi sono ospitati in incubatori ambiente controllato trova in una camera oscura e si basano sull'uso l'interruzione di un fascio di luce a infrarossi per registrare l'attività locomotoria di mosche individuali contenute all'interno di piccoli tubi. Se misurato per molti giorni, Drosophila presentano cicli giornalieri di attività e inattività, un ritmo di comportamento che è governato da sistema endogeno circadiano dell'animale. La procedura complessiva è stata semplificata con l'avvento di dispositivi disponibili in commercio attività locomotoria il monitoraggio e lo sviluppo di programmi software per l'analisi dei dati. Noi usiamo il sistema da Trikinetics Inc., che è la procedura descritta qui ed è attualmente il sistema più popolare usato in tutto il mondo. Più recentemente, i dispositivi di monitoraggio stesso sono stati utilizzati per studiare il comportamento del sonno in Drosophila. Perché il quotidiano sonno-veglia cicli di molte mosche possono essere misurate simultaneamente e solo 1 a 2 settimane vale la pena di dati continui l'attività locomotoria è solitamente sufficiente, questo sistema è ideale per i grandi schermi per identify Drosophila manifestare properties altered circadiano o dormire.

Protocollo

Il progetto complessivo del protocollo è illustrato nella figura 1. La configurazione per il monitoraggio dell'attività locomotoria utilizzando dispositivi ospitati negli incubatori ambiente controllato trova in una camera oscura deve essere montato per primo. Una volta completata questa procedura, il sistema può essere utilizzato in tutte le misurazioni successive attività locomotoria ritmo. Per ogni esperimento, si deve (i) la preparazione animali da esperimento, che potrebbe includere generare animali transgenici o la creazione di croci necessario, (ii) preparare tubi di attività di vetro contenenti una fonte di cibo, (iii) il carico vola in tubi di attività e collegare monitor attività al sistema di raccolta dei dati, e (iv) registrare e analizzare i dati utilizzando software diversi a seconda quali parametri circadiani sonno o si vuole esaminare. Qui, si definisce la "start" dell'esperimento, come il momento in cui vola a dispositivi di monitoraggio vengono prima esposti alla luce desiderata / condizioni di scarsa illuminazione ambientale nelle incubatrici.

1. Impostazione del locomotore Sistema di monitoraggio attività

1. Il sistema di monitoraggio coinvolge numerose voci di apparecchiature come i dispositivi di monitoraggio di specialità, incubatori ambientali che hanno la capacità di controllo della luce diurna, dispositivi di raccolta dati, computer e materiali secondari, come il cablaggio per collegare i dispositivi di monitoraggio per dispositivi di raccolta dei dati (Figura 2). Istruzioni per l'installazione del Activity Monitoring Drosophila (DAM) sistema di raccolta dati sono forniti dal costruttore (Trikinetics Inc.).
2. Per la casa del locomotore sistema di monitoraggio dell'attività, scegliere una stanza ben ventilata, preferibilmente dotato di sistema di controllo della temperatura, per essere una camera oscura dedicato. Con tutti i sistemi elettrici coinvolti (ad esempio, computer e incubatori) in esecuzione per un lungo periodo di tempo all'interno di una stanza piccola e confinata, calore eccessivo può essere generato portando ad un aumento rapido della temperatura della stanza. Di conseguenza, incubatori dovranno sobbarcarsi il carico di lavoro extra per mantenere la temperatura e più probabilità di fallire nel controllo della temperatura. Troviamo che anche per ben ventilato camere, il passaggio da aria condizionata in estate per riscaldare in inverno autunno / può rendere difficile mantenere la temperatura ambiente. In questi casi la ventilazione supplementari possono essere installati in camera oscura per ridurre il rischio di surriscaldamento. Inoltre, è meglio spegnere incubatori che non sono in uso per minimizzare la produzione di calore inutili.
3. Sigillare la sala da fonti di luce esterne. Ingresso può essere sigillato con una porta girevole o una tenda nera. Noi preferiamo una porta girevole come questo riduce al minimo le possibilità di luce indesiderata entrare nella camera oscura. All'interno della camera oscura, non è necessario lavorare completamente al buio come i moscerini della frutta sistema circadiano non è sensibile alla luce infrarossa (ed è molto meno sensibile alla luce rossa rispetto a luce verde / blu). Nei casi in cui abbiamo bisogno di vedere in camera oscura, ma ancora voglia di mantenere l'oscurità totale (ad esempio, rapidamente la rimozione o l'aggiunta di un dispositivo di monitoraggio in un incubatore che è nella sua fase di buio), è sufficiente utilizzare una torcia elettrica standard che è coperto da un rosso filtro. In alternativa o in aggiunta, se la propria camera oscura ha le luci fluorescenti, copriteli con carta da filtro rosso o hanno una luce scrivania stand-alone incandescente coperte con tale carta da filtro. È altamente improbabile che l'esposizione vola al buio per esposizioni molto breve (pochi secondi) della luce rossa sui loro orologi circadiani. Inoltre, anche se il sistema circadiano di Drosophila è molto sensibile alla luce visibile, non pensiamo scricchiola piccola luce in camera oscura sarà consequenziale, in ogni caso, una buona pratica è quella di tenere le porte incubatore che ospitano i monitor aperto solo quando necessarie. Inoltre, solo aprire uno incubatore in un momento come questo ridurre al minimo la possibilità di un incubatore per la sua fase oscura essere esposto alla luce da un incubatore per la sua fase di luce.
4. Acquistare una ininterrotta (UPS), unità di backup di emergenza che ha abbastanza capacità di potenza per alimentare i componenti del sistema di monitoraggio dell'attività in caso di picchi, picco, o di mancanza di corrente nell'edificio. Collegare l'unità di emergenza UPS di backup al circuito in emergenza di backup del palazzo, se disponibile. Essere consapevoli che anche se il vostro apparecchio è collegato a una presa di emergenza durante un'interruzione di corrente non ci può essere un breve periodo di transizione come il sistema passa alla alimentazione d'emergenza. Durante questo passaggio, la perdita del potere, anche per pochi secondi può portare a spegnere i computer e le luci nell'incubatore è spento. Quindi, è importante assicurarsi che i computer utilizzati per raccogliere i dati relativi all'attività e il sistema di controllo luci nel incubatore non solo sono agganciati alimentazione di emergenza, ma anche un gruppo di continuità. Se il sistema di controllo dell'illuminazione in incubatrice non è direttamente regolata dal incubatore (nella maggior parte dei casi è), allora è sufficiente inserire l'incubatore in emergonoPotenza NCY senza un gruppo di continuità, come la perdita di potenza per alcuni secondi non avrà effetto sulla temperatura della camera. Si noti che in generale un dispositivo UPS solo mantenere la vostra attrezzatura corsa per 5-30 minuti in assenza di potere, il suo scopo principale è quello di proteggere contro la perdita temporanea del potere durante la transizione da regolare per alimentazione d'emergenza.
5. Configurazione di un computer, PC o Macintosh, interamente dedicato alla raccolta dei dati e / o per il controllo della luce degli incubatori. Poiché il sistema diga sarà in esecuzione tutto il tempo e incustodito, si raccomanda che il computer ha installato il software minimo, preferibilmente non connessione di rete per minimizzare il rischio di schiantarsi. Inoltre, il sistema ha bisogno portatile di archiviazione dei dati, unità zip ad esempio, masterizzatore CD / DVD o USB, per permettere il download dei dati raccolti per successive analisi.
6. Manualmente organizzare la rete di linea telefonica ordinatamente attorno al scaffali degli incubatori ambiente controllato per permettere la facilità di collegamento / scollegamento di monitor attività. Linee telefoniche standard, adattatori, e splitter possono essere acquistati in negozi di commercio elettronico e utilizzato. Istituire linee telefoniche multiple in modo tale che essi convergono in una sola linea principale e si estendono dell'incubatore per connettersi al computer.
7. Collegare i dispositivi di monitoraggio all'interno delle incubatrici al computer tramite una unità di interfaccia di alimentazione (aka scatola blu da Trikinetics Inc.), che serve per alimentare il monitor attività (Trikinetics Inc.) attraverso la linea telefonica. Questo alimentatore interfaccia agisce anche come interfaccia per il trasferimento dati passaggio da linea telefonica a USB. Controller opzionale luce nella stessa unità in cui il cavo della linea di alimentazione del sistema luminoso di incubazione può essere collegato a, è disponibile per consentire il controllo del programma di illuminazione circadiano incubatore tramite il computer.
8. Fonti di luce possibile maschera da LED di dispositivo elettronico o non guarnizione della porta con nastro incubatore d'anatra o un panno nero per garantire la free-running ritmi sono misurati in assenza di luce indesiderati.

2. Preparazione degli animali da esperimento

1. Fenotipi comportamentali nei moscerini della frutta come la ritmicità circadiana e il sonno / riposo attività sono molto sensibili alle differenze genotipiche e dell'età degli animali di prova (Koh et al. 2006). Pertanto, è fondamentale per valutare questi fenotipi l'uso di animali un adeguato controllo che vengono allevati nelle stesse condizioni ambientali e della stessa età. Inoltre, vi è dimorfismo sessuale nella ritmicità circadiana (Helfrich-Foster 2000). La prassi generale è quella di utilizzare le mosche adulte di sesso maschile che vengono allevati in 25 ° C e tra 1 e 5 giorno di vita per le prove di attività locomotoria. Maschio vola invece di mosche femmine sono tradizionalmente utilizzate per la deposizione delle uova attività interesserà vera misurazione dell'attività locomotoria. A causa del dimorfismo sessuale, a volte saggio mosche femmina potrebbe essere informativo. Alimentari costituiti semplicemente saccarosio al 5% e 2% agar bacto volontà di evitare che le uova non vergine femmine da sviluppare e la circolazione delle larve nati da causare conta attività errati. In alternativa, le mosche femmina vergine può essere utilizzato anche se ci potrebbero essere delle differenze nei profili di attività tra accoppiati e femmine vergini (Helfrich-Forster, J. Biol. Ritmi 2000).
2. Nell'esaminare circadiano e del sonno / riposo parametri specifici mosche mutanti di interesse, è prudente outcross lo stock mutante con il ceppo selvatico del fondo stesso genetico, ad esempio w1118 o yw. Questo eliminerà secondo sito modificatori genetici che potrebbero potenzialmente maschera fenotipo circadiano o sonno / riposo. Poiché non esiste un crossing-over nei maschi della drosofila, è meglio eseguire l'outcross attraversando femmine mutante con wild-type maschi. Il ceppo selvatico servirà anche come il controllo appropriato per l'esperimento. Seme sia il wild-type di controllo e moscerini mutanti nello stesso tempo in standard Drosophila cibo circa 10 a 14 giorni prima dell'esperimento locomotore ritmo l'attività (vedi Bloomington Drosophila Stock Center per ricetta alimentare; http://flystocks.bio.indiana.edu /). Su eclosion della progenie, raccogliere 1 a 5 giorni vola vecchi maschi e metterle da parte per essere utilizzato per gli esperimenti.
3. Con i numerosi strumenti e le risorse genetiche come l'iperespressione, RNAi e tessuto-specifica GAL4 linee di volo dei driver sono disponibili da magazzino diversi centri in tutto il mondo, è possibile analizzare gli effetti della sovraespressione o bussare a tendina specifici geni nei tessuti e temporali specifici modo (Brand e Perrimon 1993; McGuire et al 2004;.. Osterwalder et al 2001). Per esaminare circadiano e del sonno / riposo parametri utilizzando questo approccio, vola portando i costrutti transgenici con tessuto-specifica o farmaco-inducibile GAL4 driver (ad esempio i maschi) sono incrociate per le mosche che trasportano i costrutti transgenici con geni bersaglio attaccato al risponditore SUP (es. femmine vergini) circa 14 giorni prima dell'inizio delle attività locomotoriaesperimenti. Su eclosion della progenie, raccogliere 1 a 5 giorni vola vecchi maschi e metterle da parte per essere utilizzato per gli esperimenti. Le linee parentali utilizzati per la croce sono abitualmente utilizzati come controlli per gli esperimenti. Progenie di incroci delle SUP responder e GAL4 linee guida con le mosche wild-type del fondo stesso genetici sono anche i controlli appropriati.
4. Come indicato ai punti (2) e (3), la lunghezza del tempo necessario per la preparazione di animali da esperimento varia notevolmente a seconda della natura e il design di questo esperimento. Nel caso in cui gli animali transgenici devono essere generati o schemi di incrocio bisogno di essere eseguito, più tempo sarà ovviamente necessario. Per motivi logistici, ci vogliono circa 14 giorni a 25 ° C per Drosophila per sviluppare dalle uova di mosche adulte.

3. Preparazione dei Tubi attività

1. Tubi di attività rappresentano l'habitat volare durante l'esperimento. Essi sono sottili (circa 5 mm di diametro; nota, Trikinetics offre diverse dimensioni a seconda della specie Drosophila da testare) 5 tubi di vetro mm che contengono sostanze alimentari ad una estremità e collegato con filo o la spina di plastica all'altra estremità. Visto che i tubi attività di vetro possono essere riutilizzati più volte, descriveremo le procedure di preparazione, utilizzando tubi di attività utilizzate / non puliti da precedenti esperimenti come punto di partenza. Se si utilizza tubi nuova attività, è sufficiente passare al punto (11).
2. E 'preferibile utilizzare tubi attività che sono appena compiuti dopo il cibo all'interno dei tubi ha la tendenza ad asciugarsi e si contaminati con funghi straordinari anche se conservato a 4 ° C. Sono generalmente preparato un paio di giorni per una settimana prima dell'inizio dell'esperimento. E 'quindi importante valutare il numero di tubi necessari per ciascun esperimento prima di preparare loro.
3. Rimuovere i tappi (plug filato o plastica) da attività di tubi usati e metterli in bicchiere di vetro di grandi dimensioni. I tubi devono riempire a metà il bicchiere. Riempire il bicchiere con acqua di rubinetto, facendo attenzione a sommergere i tubi.
4. Forno a microonde il bicchiere pieno di tubi di vetro fino a quando l'acqua arriva alla piena ebollizione rapida per sciogliere la cera e il cibo agar.
5. Fare attenzione che l'acqua è calda. Togliere il becher dal microonde e mescolare i tubi con una spatola o plastica da 10 ml pipettare per consentire cera intrappolati a galleggiare verso l'alto. Ripetere il passo (4).
6. Togliere il becher dal forno a microonde e attendere che si raffreddi. Mettere il recipiente in camera fredda (se disponibile) si accelera il processo.
7. Come l'acqua si raffredda, la cera si raccolgono sulla superficie dell'acqua e si solidifica a poco a poco. Basta rimuovere la cera solidificata a mano. Questo dovrebbe eliminare la maggior parte della cera sui tubi.
8. Trasferire i tubi attività in un recipiente di nuovo con acqua potabile fresca e ripetere i passaggi (4) e (5).
9. Poiché la maggior parte della cera è stata rimossa nel passo (7), non è necessario aspettare che la cera si solidifichi. Basta versare l'acqua fuori dal bicchiere e trasferire i tubi in un altro bicchiere nuovo. Fare attenzione che l'acqua è ancora calda.
10. Ripetere i passaggi (4) e (5) per l'ultima volta. Versare l'acqua fuori dal bicchiere e attendere che i tubi attività si raffreddi.
11. Caricarli verticalmente in 250 bicchieri di vetro ml o 500ml. Assicurarsi che non siano troppo fitto. Sterilizzarli utilizzando un autoclave con un ciclo a secco o semplicemente utilizzare un forno di essiccazione per asciugare i tubi.
12. A parte, preparare cibo per caricare nei tubi di attività, rendono una soluzione di 5% di saccarosio (Sigma) e il 2% agar Bacto (BD) in acqua distillata o acqua del rubinetto. Autoclave per sterilizzare la soluzione. Il cibo in autoclave può essere utilizzata immediatamente o conservato a 4 ° C per un periodo prolungato di tempo. Una volta che il cibo si solidifica, si avrà bisogno di forno a microonde e liquefare in modo da riempire i tubi. Porzione non utilizzata di cibo può essere conservata e utilizzata in un secondo momento.
13. Il cibo dovrebbe essere idealmente intorno a 65 ° C se utilizzato per il riempimento tubi attività. Se è troppo caldo, troppa condensa si accumula all'interno dei tubi. Se non è abbastanza caldo, il cibo prima di solidificare i tubi sono riempiti in modo uniforme. Per riempire i tubi di attività con il cibo, usare una pipetta 10 ml di pipetta la soluzione liquida cibo lungo la parete interna del bicchiere di vetro, permettendo la soluzione cibo per riempire il tubo attività dal basso verso l'alto, fino a quando i tubi sono riempiti di un terzo con la soluzione. Agitare il contenitore delicatamente attorno per assicurarsi che tutti i tubi, in particolare quelli al centro della coppa, sono uniformemente riempito con una soluzione di cibo. Attendere che il cibo per solidificare completamente a temperatura ambiente oa 4 ° C. Procedere con il passo successivo alla formazione di condensa all'interno dei tubi di vetro dissipare.
14. Per rimuovere i tubi attività dal bicchiere, spingere i tubi verso il fondo del bicchiere e torcere i tubi al tempo stesso in modo che il cibo solidificata all'interno dei tubi e la parte inferioredel bicchiere si separeranno. Prendete i tubi del bicchiere, preferibilmente come un gruppo unico.
15. Pulire i tubi uno ad uno con tovaglioli di carta per rimuovere l'eccesso di cibo sulla superficie esterna dei tubi. Impostare i tubi da parte in un contenitore pulito.
16. Prendete un generale riscaldamento blocco di laboratorio senza che il titolare del tubo e coprire il riscaldamento e accuratamente con diversi strati di fogli di alluminio forte. Aggiungi paraffina (cera) pellet nel riscaldamento in alluminio rivestiti bene a sciogliersi.
17. Tenere le provette a non alimentare e tuffo finale alla fine cibo nella cera fusa. Immergere la parte cerata in un bicchiere di vetro riempito con acqua fredda per accelerare la solidificazione della cera. Ripetere una volta. Immergendo i tubi cerati in acqua impedirà i tubi si attacchino.
18. I tubi possono essere utilizzati subito, o conservati in un contenitore ermetico a 4 ° C per l'impiego entro una settimana. Conservazione prolungata porterà ad essiccamento eccessivo del cibo. Se i tubi sono conservati a 4 ° C, assicurarsi per riscaldarsi fino a temperatura ambiente, lasciando loro sul banco prima dell'uso.

4. Caricamento di mosche in tubi di attività e Locomotore Sistema di monitoraggio attività

1. Prima di essere caricato vola in tubi di attività, accendere il incubatori che verrà utilizzato per ospitare il monitoraggio dell'attività. Regolare la temperatura utilizzando i controlli incubatore e impostare il chiaro / scuro regime utilizzando il sistema di controllo DAM di luce o il proprio sistema di controllo incubatori luce in base al disegno sperimentale desiderato. Il tempo necessario per caricare vola in tubi attività dovrebbe essere sufficiente per la temperatura si stabilizzi.
2. Anestetizzare le mosche con anidride carbonica.
3. Utilizzare un pennello fine per trasferire delicatamente una mosca in una provetta di attività.
4. Prendete la metà di un unico pezzo di filo che è di circa un centimetro con una pinza sottile e inserire il filo nel non alimentare estremità del tubo per collegare l'attività di apertura e impedire la fuoriuscita di volare durante l'esperimento, mentre allo stesso tempo permettendo il flusso d'aria nel tubo. In alternativa, tappi di plastica con piccoli fori (Trikinetics, Inc.) può essere utilizzato per chiudere l'apertura.
5. Assicurarsi che i tubi sono disposti su un fianco fino a quando si sveglia al volo, altrimenti c'è il rischio di rimanere bloccati al volo per il cibo.
6. Inserire i tubi nel monitoraggio dell'attività. Con il modello più nuovo, più compatto dei monitor Trikinetics (Trikinetics DAM2 e DAM2-7), è necessario tenere i tubi in posizione con degli elastici per garantire che il raggio infrarosso passa il tubo in posizione centrale.
7. Mettere il monitoraggio dell'attività nel incubatori e agganciarli al sistema di raccolta dati attraverso i fili del telefono. Controllare con il software di sistema DAM raccolta per assicurarsi che tutti i monitor sono collegati correttamente e dati vengono raccolti da ciascuno di essi. Il monitor emette raggi infrarossi della luce attraverso il centro di ogni attività tubo di vetro. L'attività locomotoria delle mosche sono registrati come dati binari grezzi, dove viene registrato "uno" ogni volta che viene rotto il raggio a infrarossi o un 'zero' viene registrata in cui il raggio infrarosso non è rotto.

5. Disegno sperimentale per registrare i dati per la determinazione della periodicità circadiana e Amplitude

1. Le mosche sono sincronizzati e trascinato esponendoli al regime desiderato luce / buio (LD) e la temperatura per 2-5 giorni interi. La condizione di trascinamento più comunemente usato è un ciclo luce / buio di 12 ore luce / 12 ore buio (12:12 LD) a 25 ° C. Questa condizione generalmente accettato di serie si basa essenzialmente sul pensiero che Drosophila origine da afro-equatoriale località. Quando si studiano i ritmi circadiani vi è una certa fraseologia che bisogna conoscere. Relativi a questo protocollo, il momento in cui le luci si accendono in incubatrice è definito come il tempo zeitgeber 0 (ZT0) e tutte le altre volte sono relativi a quel valore (ad esempio, in un ciclo di LD 12:12, ZT12 è il momento in cui il le luci sono spente). Secondo lo standard 12:12 condizioni LD, wild type Drosophila melanogaster tipicamente presentano due periodi di attività; uno centrato attorno ZT0 chiamato picco "mattina" e un altro picco intorno ZT12 definito "sera" (Figura 3A). I periodi mattina e sera sono controllati dall'orologio endogeno, ma ci sono anche "spaventare" le risposte che sono esplosioni transitoria di attività in risposta alla luce / buio transizioni. Due giorni di trascinamento è il minimo e può essere usato, per esempio, nelle grandi schermi che sono più tempo e sono orientati verso la misurazione free-running periodi di buio costante (vedi sotto, punto 2). Tuttavia, se siete interessati a studiare i modelli di attività nel corso di un quotidiano ciclo luce-buio, è preferibile mantenere le mosche per 4-5 giorni in LD in modo da ottenere più dati. In sostanza, aumentando il numero di mosche o il numero di giorni LD nell'analisi dei dati finali (ad esempio, i dati del pool degli ultimi duegiorni vale la pena di attività locomotoria LD) genererà più affidabile profili di attività diurne e misurazioni (ad esempio, i tempi di punta del mattino o la sera). Inoltre, la distribuzione quotidiana di attività varia in funzione della lunghezza del giorno (fotoperiodo) e la temperatura. Una delle principali ragioni per alterare il fotoperiodo o la temperatura dalla norma è che se si volesse studiare come i modelli di attività quotidiana subiscono adattamento stagionale (ad esempio, Chen et al 2007). Drosophila possono anche essere trascinato a cicli giornalieri di temperatura (ad esempio, Glaser e Stanewsky 2005.; Sehadova et al. 2009). Cicli di temperatura che variano da soli 2-3 ° C sono sufficienti a ritmi attività salire sul treno.
2. Free running ritmi attività locomotoria sono stati misurati nelle condizioni di buio costante e la temperatura dopo il periodo di inglobamento è finito (vedi sopra, punto 1). L'impostazione per il ciclo di luce può essere modificato in qualsiasi momento nella fase di buio l'ultimo giorno di un tale che il giorno successivo dell'esperimento rappresenta il primo giorno di DD LD. Sette giorni di raccolta DD dati sono sufficienti per calcolare il periodo circadiano e l'ampiezza (ad esempio, il potere o la forza del ritmo) delle mosche. In generale, un campione di almeno 16 vola è necessaria per ottenere affidabili free-running periodi per un particolare genotipo. Anche se uno è interessato solo a misurare l'attività diurna, è ancora migliore per misurare la free-running le mosche 'periodi in DD come cambiamenti di periodo endogene possono alterare la distribuzione quotidiana di attività in LD. Per esempio, le mosche con lunghi periodi endogena di solito mostrano picchi sera ritardato in LD (ad esempio, vedi figura 4).
3. Al termine dell'esperimento, i dati binari grezzi raccolti tramite il software di sistema DAM viene scaricato su un dispositivo di archiviazione dati portatile, ad esempio una chiave USB.
4. I dati binari grezzi sono trattati con DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) e sommati in 15 minuti e 30 cassonetti quando si analizzano i parametri circadiani, o da 1 a 5 bin minuti quando si analizza il sonno / riposo parametri. Attualmente, a cinque minuti di inattività contigui è la definizione standard di sonno / riposo in Drosophila (Hendricks et al 2000;. Ho Sehgal e 2005).
5. Ci sono molti modi per analizzare i dati raccolti sul sistema DAM, ma ci limiteremo a fornire i metodi utilizzati di routine nel nostro laboratorio. Microsoft Excel viene utilizzato per assegnare genotipo a gruppi campione diversi. FaasX software (M. e F. Boudinot Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francia) o Insomniac (Matlab programma basato, Leslie Ashmore, dell'Università di Pittsburgh, PA) sono utilizzati per esaminare circadiano ( periodo ad esempio, e il potere) o il sonno / riposo (percentuale ad esempio il sonno, significa riposo attacco lunghezza) i parametri, rispettivamente.

6. Rappresentante Risultati

Al completamento di questo protocollo, si può usare gli stessi dati di esaminare i parametri sia circadiano e del sonno degli animali da laboratorio in relazione agli animali di controllo.

Analisi dei parametri circadiano: Educazione grafici che illustrano le attività locomotoria quotidiana o attività media di mosche nell'arco di diversi giorni in LD o condizioni DD può essere generato usando FaasX (Figura 3) Drosophila melanogaster generalmente presentano due periodi di attività; uno centrato attorno ZT0 (o CT. ) chiamato picco "mattina" e un altro intorno ZT12 (CT 12) chiamato picco "sera". Questi due periodi di attività sono controllate dall'orologio endogeno, e può anche essere osservato in condizioni di free-running DD (Figura 3B). Cambiamenti nella tempistica di questi picchi di attività può essere facilmente osservata in grafici istruzione e possono indicare un cambiamento nelle proprietà dell'orologio endogeno. Un'altra proprietà che è indicativo della funzione orologio corretta è l'aumento di anticipazione di attività locomotoria osservato in cicli LD che si verifica prima della effettiva transizioni scuro-luce o luce-buio (Figura 3A, frecce). Questo comportamento è chiaramente osservato nei moscerini wild-type (Figura 3A), ma è assente nei mutanti aritmici come per ⁰ (Figura 3C) (Konopka e Benzer, PNAS, 1971). Nel caso dei mutanti per ^0, la osserva "mattina" e "sera" picchi di LD sono risposte puramente soprassalto a causa di bruschi cambiamenti di luce / buio condizioni (ad esempio 'clockless' mosche non anticipare i cambiamenti ambientali, ma semplicemente di reagire ad essi ). La perdita di ritmicità comportamentale è molto più pronunciato in DD e si manifesta generalmente in la perdita totale dei picchi di mattina o di sera di attività locomotoria (cioè attacchi casuali di attività e inattività), come si vede in ogni ⁰ mosche (Figura 3D). Oltre ai grafici istruzione, dati relativi alle attività locomotoria può essere rappresentato come doppio complotto actogram (FaasX), dove sono tracciate due giorni di dati in modo sequenziale su ogni riga, ma il profilo l'ultimo giorno comincia la riga successiva di due giorni vale la pena di attività (Figura 4). Per esempio, LD1 e 2 sono riportati sulla prima linea di tha actogram. La riga successiva inizia con una ripetizione di LD2 ed è seguita da LD3 e così via. A seguito di questo formato, i dati di attività locomotoria abbracciano l'intero esperimento è illustrato nel actogram. Actograms possono essere tracciate per ogni singolo volo, o per ogni genotipo volare. Un vantaggio di oltre actograms grafici istruzione è che un cambiamento nella durata del periodo di ritmi attività quotidiana è facilmente osservabile (Figura 4). Oltre a generare grafici di istruzione e actograms, dati relativi alle attività locomotoria dalla condizione DD può essere sottoposto a FaasX per calcolare la durata del periodo con una serie di programmi diversi, tra cui ciclo-P.

Analisi di sonno / riposo parametri: Con l'attuale definizione di sonno / riposo in Drosophila (Hendricks et al 2000.), Che è a cinque minuti di inattività contigui, si possono analizzare i dati registrati da saggi di attività locomotoria ed esaminare i parametri del sonno multipli usando Insomniac (L. Ashmore), un programma basato su Matlab. La percentuale del tempo che vola trascorrere sonno possono essere calcolati in tempi diversi, per cento ad esempio il sonno ogni ora (Figura 5A), o 12 ore (Figura 5B). Altri parametri del sonno più comuni che possono prendere in esame figurano significa riposo attacco lunghezza (Figura 5C) e l'attività contare scia (Figura 5D). Significa sonno / riposo attacco lunghezza è una misura di quanto il sonno è consolidato e può illustrare la qualità del sonno. Attività di risveglio, come suggerisce il nome, è una misura del tasso di attività quando le mosche sono svegli. Questo parametro consente di distinguere tra le mosche che sono veramente colpito nel sonno / riposo comportamenti rispetto a quelli che sono o malati o iperattivi. Per esempio, le mosche che sono semplicemente malati può sembrare a dormire di più perché non sono come mobili. Per queste mosche, la loro attività scia sarà più bassa rispetto agli animali di controllo.

Figura 1: Diagramma di flusso che illustra le misure più importanti per saggiare ritmi di attività locomotoria in Drosophila Le procedure sono presentate a sinistra, mentre gli utili commenti sono forniti sulla destra.. La quantità di tempo necessario per eseguire incroci e manipolazioni genetiche necessarie per ottenere le mosche con il genotipo giusto per esperimenti specifico è variabile a seconda della natura e il design di questo esperimento. I due passaggi contrassegnati con asterisco (*) forniscono l'arco di tempo per quando le mosche adulte devono essere seminato / accoppiati per generare progenie di età adeguata (1 a 5 giorni) per l'esperimento.

Figura 2: Schema che illustra le connessioni tra le diverse componenti per la raccolta dei dati riguardanti le attività locomotoria Drosophila utilizzando il sistema di DAM Un computer dedicato viene utilizzato per registrare i conteggi attività locomotoria di Drosophila.. Controlla l'attività sono alloggiati all'interno di incubatori dotato di temperatura e illuminazione (On / Off) il controllo. Il computer può anche essere usato per controllare i tempi della luce On / Off nelle incubatrici se la fonte di alimentazione del sistema di illuminazione può essere collegato a l'alimentatore (opzionale). La comunicazione tra il computer e controlla l'attività / incubatori gestiti dalla unità di interfaccia di alimentazione. L', computer di unità di alimentazione e incubatori (se il controllo della luce è indipendente dal computer) sono collegati alla presa di corrente attraverso il UPC per assicurare il monitoraggio continuo di attività e di illuminazione continua durante la fase di luce. Si consiglia di collegare tutti gli apparecchi elettrici per i circuiti di backup l'emergenza nella struttura, se disponibile.

Figura 3:. Istruzione grafici generati utilizzando FaasX mostrando ogni giorno ritmi locomotore attività di ritmica mosche wild-type (w per ⁰ vola per portare un + transgene) (A e B) vs aritmici w per ⁰ mutanti (C e D) sono state mantenute le mosche maschio a 25 ° C e trascinato per 4 giorni in 12:12 LD (luce: buio) cicli seguiti da sette giorni in DD (buio costante). Per ogni linea di volo, i livelli di attività locomotoria di mosche individuali (n> 32) sono stati misurati in bidoni di 15 minuti e poi media per ottenere un rappresentante profilo di gruppo per quella riga. A e C mostrano i dati relativi all'attività generata dalla media del secondo e terzo giorno di ciclo luce / buio (LD 2-3), mentre B e D mostrano i dati relativi all'attività generata dalla media del secondo e terzo giorno nel buio costante (2-3 GG ). Le barre verticali rappresentano l'attività (in unità arbitrarie) registrata in 15 minuti di cassonetti durante la fase luminosa (grigio chiaro) o il periodo di buio (grigio scuro). Barre orizzontali nella parte inferiore del DL grafici istruzione; bianco, luci accese, nero, luci spente. ZT0 ZT12 e rappresentano l'inizio e la fine del fotoperiodo, rispettivamente. Per i grafici educazione DD; CT0 e CT12 reprESENT l'inizio e la fine della giornata soggettiva in condizioni di buio costante, indicata con la barra grigia. Nel pannello A, M = punta del mattino; E = picco sera. Le frecce nel pannello A rappresentare il comportamento anticipatorio di picchi mattina e sera osservato nelle mosche wild-type, che sono assenti in w per ⁰ vola aritmici.

Figura 4:. Doppio complotto actogram generati utilizzando il software FaasX illustrando i dati di attività locomotoria vola con wild-type, breve o lungo periodo le mosche maschio sono state mantenute a 25 ° C e trascinato per 4 giorni in cicli 12:12 LD seguito da otto giorni nel buio costante (DD) per il calcolo del free-running periodo (t) utilizzando Cycle-P in FaasX. Tre linee di volare con periodo wild-type [w per ^0; per +; per ⁰ mutante portando al + transgene], lungo periodo [w per ^0; per (S47A), per ⁰ mutante portando per (S47A) transgene] periodo, e breve [w per ^0; per (S47D); per ⁰ mutante portando per (S47D) transgene] sono mostrati qui (Chiu et al 2008).. Asse X rappresenta il tempo ZT o TC in LD o DD rispettivamente, e l'asse Y rappresenta conta attività (unità arbitrarie) riassunse in 15 minuti di cassonetti. Le linee rosse tratteggiate collegare le cime sera per ogni giorno degli esperimenti. Da notare che durante il picco LD sera è 'costretto' a mantenere la sincronia con la 24-ore del ciclo LD, mentre nel DD del free-running periodo può discostarsi da 24 ore. Ad esempio, per brevi periodi vola con i tempi dell'attività serata avverrà prima di ogni giorno successivo in DD (quando contro una scala di 24 ore di tempo, come mostrato qui), mentre uno spostamento a destra si osserva per le mosche con la lunga periodi.

. Figura 5: Quantificazione dei parametri dormire in Drosophila Flies (Canton-S; CS) sono stati esposti a ciclo standard 12:12 LD a 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) è stato utilizzato per elaborare i dati e Microsoft Excel è stato utilizzato per generare i grafici mostrati qui. Almeno 70 le mosche sono stati raggruppati per ottenere le medie di gruppo e le barre di errore (errore standard della media) indicato. (A) al basale calcolato sonno ogni ora; mostrato è un ciclo rappresentativo quotidiana. (B) sonno di base di rappresentante ciclo giornaliero calcolato ogni 12 ore. (C) Durata media di ogni attacco resto calcolato in 12 ore con incrementi. (D) Tasso di attività risveglio calcolato ogni 12 ore.

Discussione

In questo protocollo, abbiamo descritto le procedure per la misurazione della Drosophila ritmi attività locomotoria, un output affidabile comportamentale di volare orologi circadiani che viene utilizzato come la lettura standard di funzione orologio. Questo test è stato utilizzato in larga scala schermi per mutanti orologio romanzo (per esempio, Konopka e Benzer 1971;. Dubruille et al 2009) ed è continuamente utilizzato per analizzare e comprendere la funzione orologio in vivo. E 'stato anche utilizzato per studiare il ciclo sonno veglia nelle mosche, anche se i rapporti recenti suggeriscono che l'analisi video digitale è molto più affidabile nel quantificare il sonno che usare ritmi attività locomotoria (Zimmerman et al. 2008). Quando si utilizzano ritmi attività locomotoria per analizzare il sonno, la percentuale di sonno durante il giorno tendono ad essere sovrastimati.

Per garantire il successo e la riproducibilità di questo protocollo, è fondamentale per le mosche test che sono simili per età, background genetico, e allevati nelle stesse condizioni, come fenotipi comportamentali nei moscerini della frutta come la ritmicità circadiana e il sonno / riposo attività sono molto sensibili a tutti questi fattori. Quando si utilizzano incubatori multipli per un singolo esperimento, è importante assicurarsi che tutti gli incubatori sono a temperatura anticipata dal momento che alcuni parametri circadiano possono cambiare in funzione della temperatura. Una parola di cautela nel considerare l'acquisto di incubatrici per lavorare con le mosche, non tutti sono creati uguali. Mentre esitiamo a raccomandare qualsiasi particolare unità ci sono molte opzioni. Una buona risorsa per trovare aziende che vendono incubatori per il lavoro Drosophila viene fornito . Alcune aziende persino vendere "Drosophila circadiani" incubatori, in cui funzionalità aggiuntive sono disponibili, come già cablati per il sistema Trikinetics e rampa di temperatura (ad esempio, Tritech). Importanti caratteristiche includono la possibilità per il controllo della luce diurna e buon controllo della temperatura nel range fisiologico di Drosophila (~ 15-30 ° C). I prezzi e le dimensioni degli incubatori variano molto, ma con i monitor più recenti attività di Trikinetics, anche incubatori di piccole dimensioni può ospitare un certo numero di questi dispositivi. Inoltre, anche se incubatori con controllo di umidità può essere utilizzato, questa funzione aggiunta non è necessaria fino a quando si inserisce un pentolino con acqua per fornire umidità (50-70% va bene). Infine, anche se abitualmente uso FaasX e Insomniac per l'analisi dei dati in questo protocollo, ci sono programmi alternativi e software disponibili (Rosato e Kyriacou 2006), ad esempio ClockLab (ActiMetrics), Brandeis ritmo Package (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ), e MAZ (Zordan et al. 2007).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56°C-57°C
Block heater	VWR international	12621-014