Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila</em

Resumen

Se describen los procedimientos para el registro diario de los ritmos de actividad locomotora Drosophila Y el posterior análisis de datos. Ritmos actividad locomotora es una salida confiable del comportamiento de los relojes circadianos de los animales y se utilizan como la lectura de la norma de funcionamiento del reloj circadiano en el estudio de mutantes o el examen de cómo el medio ambiente regula el sistema circadiano.

Resumen

La mayoría de las formas de vida muestran ritmos diarios en los fenómenos celulares, fisiológicos y de comportamiento que son impulsados ​​por circadiano endógeno (≡ 24 h) los marcapasos o los relojes. Disfunciones en el sistema circadiano humano están asociados con varias enfermedades o trastornos. Avanzado mucho hacia la comprensión de los mecanismos subyacentes a los ritmos circadianos ha surgido de las pantallas de genética mediante el cual un ritmo fácil de medir la conducta se utiliza como una lectura de la función de reloj. Los estudios con Drosophila han hecho contribuciones fundamentales a la comprensión de las bases celulares y bioquímicos subyacentes a los ritmos circadianos. El comportamiento estándar circadiano de lectura se mide en Drosophila es la actividad locomotora. En general, el sistema de control consiste en dispositivos especialmente diseñados que pueden medir el movimiento del aparato locomotor de Drosophila. Estos dispositivos se encuentran en incubadoras de ambiente controlado localizado en un cuarto oscuro y se basan en el uso de la interrupción de un haz de luz infrarroja para grabar la actividad locomotriz de moscas individuales contenidas dentro de pequeños tubos. Cuando se mide durante muchos días, Drosophila muestran los ciclos diarios de actividad e inactividad, un ritmo de comportamiento que se rige por el sistema circadiano endógeno del animal. El procedimiento general se ha simplificado con el advenimiento de dispositivos disponibles en el mercado del aparato locomotor seguimiento de la actividad y el desarrollo de programas de software para análisis de datos. Utilizamos el sistema de Trikinetics Inc., que es el procedimiento que se describe aquí y es actualmente el sistema más popular en todo el mundo. Más recientemente, los dispositivos de vigilancia mismas se han utilizado para estudiar el comportamiento del sueño en la mosca Drosophila. Debido a que el diario de sueño-vigilia de los ciclos de muchas moscas se pueden medir simultáneamente y sólo 1 a 2 semanas de continua actividad locomotora de datos suele ser suficiente, este sistema es ideal para grandes pantallas para identificar Drosophila manifiesta alteración de las propiedades circadiano o el sueño.

Protocolo

El diseño general del protocolo se ilustra en la Figura 1. La configuración de la supervisión de la actividad locomotora usando dispositivos alojados en las incubadoras de ambiente controlado localizado en un cuarto oscuro debe ser montado en el. Una vez que se haya completado, el sistema puede ser utilizado en todas las mediciones posteriores ritmo de actividad locomotora. Para cada experimento, se tiene que (i) preparar los animales de experimentación, que podría incluir la generación de animales transgénicos o la creación de cruces es necesario, (ii) preparar los tubos de vidrio que contiene la actividad de una fuente de alimento, (iii) la carga moscas en los tubos de la actividad y conectar los monitores de la actividad al sistema de recolección de datos y registro (iv) y analizar los datos utilizando el software diferente en función de qué parámetros circadiano o el sueño que se quiere examinar. En este documento, se define el "inicio" de la experiencia como el momento cuando las moscas en los dispositivos de control están expuestas a la luz deseada / condiciones de oscuridad en las incubadoras del medio ambiente.

1. Configuración del sistema de monitoreo de la actividad locomotora

1. El sistema de control consiste en numerosos artículos de equipo como dispositivos de vigilancia especiales, las incubadoras de medio ambiente que tienen la capacidad para el control de la luz diurna, los dispositivos de recopilación de datos, equipos y materiales adicionales, tales como el cableado para conectar los dispositivos de control para los dispositivos de captación de datos (Figura 2). Instrucciones para instalar el Monitoreo de las Actividades de Drosophila (DAM) del sistema de recolección de datos son proporcionados por el fabricante (Trikinetics Inc.).
2. Para albergar el sistema de monitoreo de actividad del aparato locomotor, elija una habitación bien ventilada, de preferencia equipado con un sistema de control de temperatura, que se dedica un cuarto oscuro. Con todos los sistemas eléctricos involucrados (por ejemplo, equipo e incubadoras) que se ejecuta durante un largo periodo de tiempo dentro de un cuarto pequeño y limitado, el calor excesivo puede generar que lleva a un rápido aumento de la temperatura de la habitación. En consecuencia, las incubadoras tendrán que cargar con la carga de trabajo adicional para mantener la temperatura y más probabilidades de fracasar en el control de la temperatura. Nos encontramos con que incluso para los cuartos bien ventilados, la transición de aire acondicionado en el verano de calor en el invierno otoño / puede hacer que sea difícil mantener la temperatura ambiente. En estos casos, ventilación adicional que tenga que ser instalado en el cuarto oscuro para reducir el riesgo de sobrecalentamiento. Además, lo mejor es apagar las incubadoras que no están en uso para reducir al mínimo la producción de calor innecesario.
3. Selle la habitación de fuentes de luz externa. La entrada se puede sellar con una puerta giratoria o una cortina de color negro. Preferimos una puerta giratoria ya que esto minimiza las posibilidades de la luz no deseada de entrar en el cuarto oscuro. En el interior del cuarto oscuro, no es necesario trabajar por completo en la oscuridad como la mosca de la fruta sistema circadiano no es sensible a la luz infrarroja (y es mucho menos sensible a la luz roja en comparación con la luz verde / azul). En los casos en que tenemos que ver en el cuarto oscuro, pero todavía quiere mantener la oscuridad total (por ejemplo, suprimir o añadir rápidamente un dispositivo de vigilancia en una incubadora que se encuentra en su fase oscura), basta con utilizar una linterna estándar que se cubre con un color rojo filtro. Como alternativa, o además de, si su cuarto oscuro tiene luces fluorescentes, cúbralos con papel de filtro de color rojo o una lámpara de escritorio independiente incandescentes cubiertas con papel de filtro tales. Es muy poco probable que la exposición de moscas en la oscuridad a la exposición muy breve (unos segundos) de la luz roja se afectan sus relojes circadianos. Además, aunque el sistema circadiano de la Drosophila es muy sensible a la luz visible, no creemos que cruje pequeña de la luz en el cuarto oscuro será consecuentes, en todo caso, una buena práctica es mantener las puertas de la incubadora que la casa de los monitores se abren solamente cuando es necesario. Además, sólo abrir una incubadora en un momento en que esto reducirá al mínimo la posibilidad de una incubadora en su fase oscura se expone a la luz de una incubadora en la fase de luz.
4. Compra de un suministro ininterrumpido de energía (UPS) de emergencia unidad de copia de seguridad que tiene la capacidad suficiente potencia para alimentar los componentes del sistema de control de la actividad en caso de picos de tensión, picos, o falla de energía en el edificio. Conecte la unidad de respaldo UPS de emergencia al circuito de copia de seguridad de emergencia del edificio si está disponible. Tenga en cuenta que incluso si su equipo está conectado a una toma de emergencia durante un corte de energía no puede haber un breve período de transición como el sistema cambia a energía de emergencia. Durante esa transición, la pérdida de poder de unos pocos segundos, incluso puede llevar a los ordenadores cerrando y las luces en la incubadora de ser apagado. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los equipos se utilizan para recopilar los datos de actividad y el sistema de control de luces en la incubadora no sólo están enganchados en energía eléctrica de emergencia, sino también una UPS. Si el sistema de control de iluminación en la incubadora no está directamente regulada por la incubadora (en la mayoría de los casos lo es), entonces es suficiente para tapar la incubadora en el emergerncia de energía sin un SAI, como la pérdida de poder de unos pocos segundos no afectará a la temperatura de la cámara. Tenga en cuenta que, en general, un dispositivo UPS sólo mantener su equipo trabajando para un mínimo de 5.30 en la ausencia de poder, y su objetivo principal es proteger contra la pérdida de poder temporal durante la transición de regular para energía de emergencia.
5. Establecer una computadora, PC o Macintosh, totalmente dedicado a la recopilación de datos y / o para el control de la luz de las incubadoras. Dado que el sistema DAM va a correr todo el tiempo y sin supervisión, se recomienda que este equipo tiene instalado el software mínimo, preferiblemente sin conexión a la red para minimizar el riesgo de estrellarse. Además, el sistema de las necesidades de almacenamiento de datos portátil, por ejemplo una unidad zip, grabadora de CD / DVD o USB, para permitir la descarga de los datos recogidos para su posterior análisis.
6. Manual de organizar la red de línea telefónica cuidadosamente alrededor de los estantes de las incubadoras de ambiente controlado para permitir la facilidad de conectar / desconectar de los monitores de la actividad. Líneas telefónicas estándar, adaptadores y divisores se pueden comprar en tiendas de electrónica y comerciales utilizados. Establecido varias líneas de teléfono de una manera tal que converjan en una línea principal y se extienden fuera de la incubadora para conectarse a la computadora.
7. Conectar los dispositivos de vigilancia en el interior de las incubadoras en el ordenador a través de una unidad de interfaz de energía de alimentación (también conocido como caja azul de Trikinetics Inc.), que sirve para alimentar el monitor de actividad (Trikinetics Inc.) a través de la línea telefónica. Esta fuente de alimentación de la unidad de interfaz también actúa como una interfaz para la transferencia de datos de conmutación de la línea de teléfono para cable USB. Control de iluminación opcional en la misma unidad en la que puede ser el cable de la línea de alimentación del sistema conectado a la luz incubadora, está disponible para permitir el control de horario circadiano incubadora de iluminación a través del ordenador.
8. Fuentes de la máscara de la luz de LED posible de dispositivos electrónicos o mal sellado de la puerta incubadora con cinta aislante o un paño negro para asegurar la libertad de movimientos, los ritmos se mide en la ausencia de luz no deseados.

2. Preparación de los animales de experimentación

1. Fenotipos de comportamiento en moscas de la fruta, tales como ritmo circadiano y del sueño / descanso de actividad son muy sensibles a las diferencias genotípicas y la edad de los animales de experimentación (Koh et al. 2006). Por lo tanto, es crucial para evaluar estos fenotipos con los animales de control adecuadas que se crían en las mismas condiciones ambientales y de la misma edad. Además, no hay dimorfismo sexual en el ritmo circadiano (Helfrich y Foster 2000). La práctica general es utilizar moscas adultas masculinas que se crían en 25 ° C y de 1 a 5 días de edad para los ensayos de la actividad locomotora. Macho de la mosca en lugar de las moscas hembras se utilizan tradicionalmente por la puesta de huevos la actividad afectará a la medición real de la actividad locomotora. Debido al dimorfismo sexual, a veces analizando las moscas hembras podrían ser informativos. Alimentos que consiste en simplemente sacarosa al 5% y 2% de agar Bacto evitará que los huevos de las hembras no vírgenes de desarrollo y el movimiento de las larvas nacidas de causar conteos erróneos actividad. Por otra parte, las moscas hembras vírgenes se pueden utilizar, aunque puede haber diferencias en los perfiles de actividad entre el acoplado y hembras vírgenes (Helfrich-Forster, J. Biol. Ritmos 2000).
2. Al examinar circadianos y el sueño / descanso de los parámetros específicos de moscas mutantes de interés, es prudente a la polinización cruzada la acción mutante con la cepa de tipo salvaje de los mismos antecedentes genéticos, por ejemplo, o w1118 yw. Esto eliminará los modificadores segundo sitio genético que potencialmente podría enmascarar o fenotipo circadiano del sueño / descanso. Puesto que no hay entrecruzamiento de machos de Drosophila, que es mejor para llevar a cabo la polinización cruzada, cruzando las hembras mutantes de tipo salvaje hombres. La cepa de tipo salvaje también servirá como el control adecuado para el experimento. De semillas, tanto el control de tipo salvaje y las moscas mutantes, al mismo tiempo en el estándar de Drosophila alimentos de 10 a 14 días antes del experimento la actividad de ritmo locomotor (ver Bloomington Drosophila Stock de Centro para la receta de la comida; http://flystocks.bio.indiana.edu /). Tras la eclosión de la progenie, tomar 1 a 5 días macho de la mosca de edad y los puso a un lado para ser utilizados para los experimentos.
3. Con las numerosas herramientas y recursos genéticos, tales como la sobreexpresión, RNAi, y tejidos específicos de las líneas GAL4 volar controlador disponible de centros de acopio en todo el mundo diferente, es posible analizar los efectos de la sobreexpresión o golpeando hacia abajo genes específicos en el tejido y temporales específicos forma (Brand y Perrimon 1993, McGuire et al 2004;.. Osterwalder et al 2001). Para examinar circadianos y el sueño / descanso parámetros de uso de este enfoque, las moscas de llevar a las construcciones transgénicas específicas de tejido o de drogas-inducible GAL4 conductor (por ejemplo, los hombres) se cruzan a las moscas llevar construcciones transgénicas con genes diana adjunta a la respuesta UAS (por ejemplo, las hembras vírgenes) alrededor de 14 días antes del inicio de la actividad locomotoraexperimentos. Tras la eclosión de la progenie, tomar 1 a 5 días macho de la mosca de edad y los puso a un lado para ser utilizados para los experimentos. Las líneas parentales utilizadas para la cruz se utilizan habitualmente como controles para los experimentos. Progenie de los cruces de UAS de respuesta y líneas GAL4 conductor con moscas de tipo salvaje de los mismos antecedentes genéticos son también los controles adecuados.
4. Como se indica en los pasos (2) y (3), el tiempo necesario para la preparación de los animales de laboratorio varía mucho dependiendo de la naturaleza y el diseño del experimento. En el caso de que los animales transgénicos deben ser generados o si los sistemas de cruce deben ser ejecutadas, más tiempo, obviamente, será necesario. Por razones logísticas, se tarda unos 14 días a 25 ° C para el desarrollo de Drosophila de los huevos de las moscas adultas.

3. Preparación de los tubos de Actividad

1. Los tubos de la actividad representan el hábitat de volar durante el experimento. Son delgados (aproximadamente 5 mm de diámetro; nota, Trikinetics ofrece diferentes tamaños dependiendo de la especie Drosophila se vaya a analizar) 5 mm tubos de vidrio que contienen sustancias alimenticias en un extremo y conectado con hilo o el tapón de plástico en el otro extremo. Dado que la actividad de tubos de vidrio se puede reutilizar varias veces, vamos a describir los procedimientos de preparación utilizando utilizados / limpiar los tubos de la actividad de los experimentos anteriores como punto de partida. Si se utilizan tubos de nueva actividad, simplemente vaya al paso (11).
2. Es preferible utilizar tubos de actividad que están recién hechos ya que la comida dentro de los tubos tiene una tendencia a secarse y se contamina con hongos horas extras, incluso cuando se almacenan a 4 ° C. Generalmente se preparan unos días a una semana antes del inicio del experimento. Por tanto, es importante evaluar el número de tubos necesarios para cada experimento antes de prepararlos.
3. Retire los tapones (plug hilo o de plástico) de los tubos de la actividad utilizados y ponerlas en el vaso de cristal. Los tubos sólo se debe llenar hasta la mitad del vaso. Llenar el vaso con agua del grifo, asegurándose de sumergir los tubos.
4. Microondas el vaso lleno de tubos de vidrio hasta que el agua hierva rápido completo para derretir la cera y la comida agar.
5. Tome la precaución de que el agua está caliente. Retirar el vaso del microondas y remover los tubos con una espátula de plástico o una pipeta 10 ml para permitir que la cera atrapado a flotar a la superficie. Luego repita el paso (4).
6. Retirar el vaso del microondas y esperar a que se enfríe. Poner el vaso en el cuarto frío (si está disponible) se acelerará el proceso.
7. A medida que el agua se enfría, la cera se acumulan en la superficie del agua y se solidifica gradualmente. Basta con quitar la cera solidificada con la mano. Esto debe deshacerse de la mayoría de la cera en los tubos.
8. La transferencia de los tubos de la actividad a un vaso de nuevo con agua fresca del grifo y repita los pasos (4) y (5).
9. Dado que la mayoría de la cera se ha quitado en el paso (7), no es necesario esperar a que la cera se solidifique. Simplemente vierta el agua fuera del vaso y la transferencia de los tubos en otro vaso nuevo. Tome la precaución de que el agua está caliente.
10. Repita los pasos (4) y (5) por última vez. Vierta el agua fuera del vaso y esperar a que los tubos de la actividad que se enfríe.
11. Carga verticalmente en 250 ml o vasos de vidrio de 500 ml. Asegúrese de que no son demasiado apretados. Esterilizan mediante el uso de un autoclave con un ciclo seco o simplemente utilizar un horno para secar los tubos.
12. Por otra parte, para preparar la comida para cargar en los tubos de la actividad, hacer una solución de sacarosa al 5% (Sigma) y 2% de agar Bacto (BD) en agua destilada o agua del grifo. Autoclave para esterilizar la solución. La comida en autoclave se puede utilizar inmediatamente o almacenar en 4 ° C durante un período prolongado de tiempo. Una vez que los alimentos se solidifica, será necesario para microondas y licuar en el fin de llenar los tubos. Parte no utilizada de los alimentos pueden ser almacenados y utilizados en una fecha posterior.
13. La comida ideal debe estar alrededor de 65 ° C cuando se utiliza para el llenado de los tubos de la actividad. Si hace demasiado calor, demasiada condensación se acumulan en el interior de los tubos. Si no está lo suficientemente caliente, la comida se solidifique antes de los tubos están igualmente llenos. Para llenar los tubos de la actividad con los alimentos, el uso de una pipeta 10 ml de la solución de pipeta de alimentos líquidos a lo largo de la pared interior del vaso de vidrio, lo que permite la solución de los alimentos para llenar el tubo de la actividad desde abajo hacia arriba, hasta que los tubos están llenos de un tercio con la solución. Agitar el vaso alrededor con cuidado para asegurarse de que todos los tubos, en especial los de la mitad del vaso, se llena con una solución de manera uniforme los alimentos. Espere a que la comida que se solidifique por completo o bien a temperatura ambiente o 4 ° C. Continúe con el siguiente paso una vez la condensación dentro de los tubos de vidrio se disipe.
14. Para retirar los tubos de la actividad del vaso, empujar los tubos hacia el fondo del vaso y el giro de los tubos al mismo tiempo para que el alimento ha solidificado en el tubo y el fondodel vaso de precipitados se separan. Tomar los tubos de la copa, preferentemente como un grupo único.
15. Limpiar los tubos, uno por uno con toallas de papel para eliminar el exceso de comida en la superficie exterior de los tubos. Conjunto de los tubos a un lado en un recipiente limpio.
16. Tener un calentador de bloque de laboratorio en general sin el soporte del tubo y la cubierta de la calefacción y cuidadosamente con varias capas de papel de aluminio fuerte. Añadir parafina (cera) pastillas en la calefacción de aluminio forrado, así que se derrita.
17. Mantenga los tubos en el extremo no-alimentos y sumergir el extremo de alimentos en la cera fundida. Sumerja la porción de cera en un vaso de vidrio lleno de agua fría para acelerar la solidificación de cera. Repetir una vez. Inmersión de los tubos de cera en el agua evitará que los tubos se peguen entre sí.
18. Los tubos pueden ser utilizados de inmediato, o almacenado en un recipiente hermético a 4 º C para su uso dentro de una semana. El almacenamiento prolongado dará lugar a un exceso de sequedad de los alimentos. Si los tubos se almacenan a 4 ° C, asegúrese de calentar a temperatura ambiente por dejarlos en mesa de trabajo antes de su uso.

4. Las moscas de carga en los tubos de la actividad y Aparato Locomotor Activity Monitoring

1. Antes de cargar las moscas en los tubos de la actividad, a su vez en las incubadoras que se utilizarán para albergar a los monitores de la actividad. Ajuste la temperatura usando los controles de la incubadora y establecer el régimen de luz / oscuridad con el sistema DAM controlador de la luz o las incubadoras propio sistema de control de luz de acuerdo con el diseño experimental deseado. El tiempo necesario para cargar las moscas en los tubos de la actividad debería ser suficiente para que la temperatura se estabilice.
2. Anestesiar a las moscas con el dióxido de carbono.
3. Use un pincel fino para transferir suavemente una mosca en un tubo de la actividad.
4. Coge la mitad de una sola pieza de hilo que es de alrededor de media pulgada con unas pinzas finas e insertar el hilo en el final no alimentarios de la trompa de la actividad para tapar la abertura y evitar que la marcha se escape durante el experimento, y al mismo tiempo tiempo que permite el flujo de aire en el tubo. Por otra parte, las tapas de plástico con agujeros pequeños (Trikinetics, Inc.) se puede utilizar para cerrar la abertura.
5. Asegúrese de que los tubos se ponen en sus lados hasta que la marcha se despierta, o se corre el riesgo de la mosca se queda pegada a la comida.
6. Introducir las mangueras en los monitores de la actividad. Con el modelo más nuevo, más compacto de los monitores Trikinetics (Trikinetics DAM2 y DAM2 7), es necesario para sostener los tubos en su lugar con bandas de goma para asegurar que el haz de luz infrarroja pasa el tubo a la posición central.
7. Poner los monitores de la actividad en las incubadoras y conectarlos al sistema de recolección de datos a través de los cables de teléfono. Verificación mediante el sistema DAM colección de software para asegurarse de que todos los monitores están conectados correctamente y los datos están siendo recogidos de cada uno de ellos. El monitor emite luz infrarroja a través del centro de cada tubo de vidrio de la actividad. La actividad locomotora de las moscas, se registran como datos binarios sin formato en el que se registró "un" cada vez que se rompe el haz de infrarrojos o un "cero" se registra en el que el haz de infrarrojos no está roto.

5. Diseño experimental para el registro de datos para la determinación de la periodicidad circadiana y la amplitud

1. Las moscas son sincronizados y arrastrado al exponerlos al régimen deseado de luz / oscuridad (LD) y de la temperatura durante 2-5 días completos. La condición de arrastre más común es un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas de luz / oscuridad de 12 horas (12:12 LD) a 25 ° C. Esta condición generalmente aceptada se basa esencialmente en la idea de que la Drosophila se originó a partir de los afro-ecuatorial lugares. Cuando se estudian los ritmos circadianos hay alguna fraseología que se necesita para familiarizarse con. Relación con el Protocolo, el momento en que se encienden las luces en la incubadora se define como el tiempo zeitgeber 0 (ZT0) y el resto del tiempo son relativos a ese valor (por ejemplo, en un ciclo LD 12:12, ZT12 es el momento en que la las luces se apagan). Bajo la norma 12:12 condiciones LD, de tipo salvaje Drosophila melanogaster típicamente exhiben dos períodos de actividad, uno centrado en ZT0 llamado "mañana" pico y otra alrededor de ZT12 denomina "la noche" pico (Figura 3). Las series de mañana y tarde son controlados por el reloj endógeno, pero también hay "sorpresa" las respuestas que se rompe transitoria de la actividad en respuesta a las transiciones de luz / oscuridad. Dos días de arrastre es el mínimo y podría ser utilizado, por ejemplo, en pantallas de gran tamaño que se requiere más tiempo y están orientadas hacia la medición de libertad de movimientos, períodos de oscuridad constante (ver más abajo, paso 2). Sin embargo, si usted está interesado en el estudio de los patrones de actividad diaria durante un ciclo luz-oscuridad, es preferible mantener las moscas durante 4-5 días en LD con el fin de obtener más datos. En esencia, lo que aumenta el número de moscas o el número de días de LD en el análisis de datos final (por ejemplo, agrupar los datos de los últimos dosdías el valor de la actividad locomotora LD) va a generar perfiles diurnos más fiable la actividad y las medidas (por ejemplo, el momento de pico de la mañana o por la noche). Por otra parte, la distribución diaria de actividad varía en función de la duración del día (fotoperiodo) y la temperatura. Una de las principales razones para modificar el fotoperiodo o la temperatura de la norma es que si uno quería estudiar cómo los patrones de actividad diaria sufren la adaptación estacional (por ejemplo, Chen et al 2007). Drosophila también puede ser arrastrado a los ciclos diarios de temperatura (por ejemplo, Glaser y Stanewsky 2005.; Sehadova et al. 2009). Ciclos de temperaturas que varían de sólo 2-3 ° C son suficientes para arrastrar ritmos de actividad.
2. Funcionamiento libre ritmos de actividad locomotora se miden en las oscuras condiciones de temperatura constante y después del período de arrastre se termina (ver más arriba, el paso 1). El ajuste para el ciclo de luz se puede cambiar en cualquier momento en la fase de oscuridad en el último día de tal manera que al día siguiente de la experiencia representa el primer día de DD LD. Siete días de la DD de recolección de datos es suficiente para calcular el período circadiano y amplitud (por ejemplo, el poder o la fuerza del ritmo) de las moscas. En general, un tamaño de muestra de al menos 16 moscas es necesario obtener datos fiables de funcionamiento libre períodos de un genotipo particular. Incluso si sólo se está interesado en la medición de actividad diurna, es todavía la mejor manera de medir las moscas 'free-running períodos en DD, como cambios en el período endógeno puede alterar la distribución diaria de la actividad de LD. Por ejemplo, las moscas con largos períodos endógena suelen presentar retraso en los picos de la noche en LD (véase la Figura 4).
3. Al término del experimento, los datos binarios recolectados a través del software del sistema DAM se descarga en un dispositivo de almacenamiento portátil de datos, por ejemplo, la llave USB.
4. Los datos binarios sin formato se procesa mediante DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) y se suman a los 15 y 30 contenedores de minutos en el análisis de los parámetros circadianos, o de 1 a 5 compartimentos minutos la hora de analizar el sueño / descanso parámetros. En la actualidad, a cinco minutos de inactividad contigua es la definición estándar de sueño / descanso en Drosophila (Hendricks et al, 2000;. Ho y Sehgal 2005).
5. Hay muchas maneras de analizar los datos recogidos en el sistema DAM, pero sólo daremos los métodos utilizados habitualmente en nuestro laboratorio. Microsoft Excel se utiliza para asignar el genotipo de los grupos de muestras diferentes. FaasX software (M. Boudinot y Rouyer F., Centro Nacional de Investigación Científica, Gif-sur-Yvette Cedex, Francia) o Insomniac (Matlab programa basado, Leslie Ashmore de la Universidad de Pittsburgh, PA) se utilizan para examinar circadiano ( por ejemplo, plazo y el poder) o el sueño / descanso (sueño, por ejemplo el porcentaje, significa que el resto pelea de largo) los parámetros, respectivamente.

6. Resultados representante

Tras la finalización de este protocolo, se puede utilizar el mismo conjunto de datos para examinar los parámetros tanto circadianos y el sueño de los animales de experimentación en relación con los animales control.

Análisis de los parámetros circadianos: los gráficos que ilustran las actividades diarias de Educación del aparato locomotor o las actividades de promedio de las moscas durante varios días en LD o las condiciones de DD se pueden generar utilizando FaasX (Figura 3) Drosophila melanogaster generalmente presentan dos períodos de actividad, uno centrado en ZT0 (o CT. ) denomina "la mañana" pico y otra alrededor de ZT12 (CT 12) denomina "la noche" pico. Estos dos episodios de actividades son controladas por el reloj endógeno, e incluso se puede observar en las condiciones de funcionamiento libre DD (Figura 3B). Cambios en el calendario de estos picos de actividad se puede observar fácilmente en los gráficos de la educación y puede indicar un cambio en las propiedades del reloj endógeno. Otra propiedad que es indicativo de la función de reloj adecuado es el aumento anticipado en la actividad locomotora observada en los ciclos de LD que se produce antes de la transición actual de oscuro a la luz o la luz a la oscuridad (Figura 3 A, flechas). Este comportamiento se observa claramente en las moscas de tipo salvaje (Figura 3), pero está ausente en los mutantes arrítmicos, como por ⁰ (Figura 3C) (Konopka y Benzer, PNAS, 1971). En el caso de los mutantes por ^0, lo observado "mañana" y "noche" picos de LD son las respuestas puramente sobresalto debido a los cambios bruscos de luz / la oscuridad ('clockless "es decir, las moscas no anticiparse a los cambios del medio ambiente sino que simplemente reaccionar ante ellos ). La pérdida de la ritmicidad del comportamiento es mucho más pronunciado en DD y por lo general se manifiesta en la pérdida total de los picos de la mañana o por la noche de la actividad locomotora (es decir, ataques al azar de la actividad y la inactividad), como se ve en cada ⁰ moscas (Figura 3D). Además de los gráficos la educación, los datos de la actividad locomotora se puede representar como doble trama actogram (FaasX), donde dos días de los datos se representan de forma secuencial en cada línea, pero el perfil del último día comienza la siguiente línea de dos días de actividad (Figura 4). Por ejemplo, LD1 y 2 están ubicados en la primera línea de tque actogram. La siguiente línea comienza con una repetición de LD2 y es seguido por LD3 y así sucesivamente. Después de este formato, los datos de la actividad locomotora que abarca todo el experimento se ilustra en el actogram. Actograms se pueden trazar para cada vuelo individual, o para cada genotipo volar. Una de las ventajas de actograms más gráficos que la educación es un cambio en la duración del período de los ritmos de actividad diaria es fácilmente observable (Figura 4). Además de generar gráficos de la educación y la actograms, los datos de la actividad locomotora de la condición de DD puede ser sometido a FaasX para calcular la duración del período con una serie de programas diferentes, incluyendo el ciclo-P.

El análisis de los parámetros del sueño / descanso: Mediante el uso de la definición actual de sueño / descanso en Drosophila (Hendricks et al, 2000.), Que está a cinco minutos de inactividad contiguos, uno puede analizar los datos registrados a partir de los ensayos de la actividad locomotora y examinar varios parámetros del sueño con Insomniac (L. Ashmore), un programa basado en Matlab. El porcentaje de tiempo que pasa durmiendo moscas se puede calcular en diferentes intervalos de tiempo, por ejemplo, espera por ciento de cada hora (Figura 5), ​​o 12 horas (Figura 5). Otros parámetros del sueño más comunes que pueden ser examinados incluyen significa resto pelea longitud (Figura 5) y el recuento de despertar la actividad (Figura 5D). La media de sueño / descanso pelea longitud es una medida de la consolidación del sueño y puede ilustrar la calidad del sueño. La actividad de vigilia, como su nombre indica, es una medida de la tasa de actividad cuando las moscas están despiertos. Este parámetro ayuda a diferenciar entre las moscas que son realmente afectados en las conductas de sueño / descanso contra los que están enfermos o hiperactivo. Por ejemplo, las moscas que son simplemente enfermos puede parecer un sueño más, ya que no son móviles. Por estas moscas, su actividad tras serán menores en relación con los animales control.

Figura 1: Diagrama de flujo describiendo los pasos principales para el ensayo de ritmos actividad locomotora en Drosophila Los procedimientos se presentan a la izquierda, mientras que sus valiosos comentarios son siempre a la derecha.. La cantidad de tiempo necesario para realizar cruces necesarios y la manipulación genética para obtener las moscas con el genotipo adecuado para experimentos específicos es variable dependiendo de la naturaleza y el diseño del experimento. Los dos pasos marcados con un asterisco (*) proporcionan el marco de tiempo para que las moscas adultas que ser cabeza de serie / acoplado a generar progenies de la edad adecuada (1 a 5 días de edad) para el experimento.

Figura 2: Esquema que ilustra las conexiones entre los diferentes componentes del aparato locomotor para la recogida de datos de Drosophila mediante el sistema DAM Un equipo dedicado se utiliza para registrar los impulsos actividad locomotora de Drosophila.. Supervisa la actividad se encuentra dentro de las incubadoras equipado con temperatura e iluminación (encendido / apagado) de control. El ordenador también se puede utilizar para controlar el tiempo de la luz de encendido / apagado en las incubadoras, si la fuente de alimentación del sistema de iluminación puede ser conectado a la fuente de alimentación (opcional). Comunicaciones entre el equipo y los monitores de actividad / incubadoras son administrados por la unidad de interfase de potencia de suministro. El ordenador, la fuente de alimentación y las incubadoras (si el control de la iluminación es independiente de la computadora) conectado a la toma de alimentación de CA a través de la UPC para garantizar el seguimiento continuo de la actividad y la iluminación continua durante la fase de luz. Se recomienda conectar todos los aparatos eléctricos a los circuitos de emergencia de seguridad en la instalación, si está disponible.

Figura 3:. Educación gráficos generados con FaasX mostrando ritmos diarios de actividad locomotora rítmica moscas de tipo salvaje (w ⁰ por moscas que lleva un transgén por +) (A y B) vs w arrítmicos por ⁰ mutantes (C y D) machos se mantuvieron a 25 ° C y arrastrado por 4 días en 12:12 LD (luz: oscuridad) ciclos, seguido de siete días en DD (oscuridad constante). Para cada línea de la mosca, los niveles de la actividad locomotora de moscas individuales (n> 32) se midieron en los contenedores de 15 minutos y luego se promediaron para obtener un perfil de grupo representante de esa línea. A y C muestran los datos de actividad generada a partir de un promedio de los días segundo y tercero en el ciclo luz / oscuridad (LD 03/02), mientras que B y D muestran los datos de actividad generada a partir de un promedio de los días segundo y tercero en la oscuridad constante (DD 3.2 ). Las barras verticales representan la actividad (en unidades arbitrarias), registrados en 15 minutos de contenedores durante el período de luz (gris claro) o el período oscuro (gris oscuro). Las barras horizontales en la parte inferior de los gráficos LD educación, blanco, luces encendidas, el negro, las luces apagadas. ZT0 y ZT12 representan el comienzo y el final del fotoperíodo, respectivamente. Para los gráficos de la educación DD; CT0 y repr CT12ESENT el inicio y el final del día subjetivo en condiciones de oscuridad constante, representado por la barra gris. En el panel A, M = pico de la mañana, E = pico de la tarde. Las flechas en el panel A representa el comportamiento de anticipación de los picos de la mañana y por la tarde observó en las moscas de tipo salvaje, que están ausentes en w por ⁰ moscas arrítmico.

Figura 4:. Doble trama actogram generados con el software de datos que ilustran FaasX actividad locomotora de las moscas con el tipo salvaje, a corto o largo período machos se mantuvieron a 25 ° C y arrastrado por 4 días en 12:12 ciclos LD seguido por ocho días en la oscuridad constante (DD) para el cálculo del período de funcionamiento libre (t) con ciclo-P en FaasX. Tres líneas de mosca con un periodo de tipo salvaje [w por ^0; por +; por ⁰ mutante llevar por + transgén], largo período de tiempo [w por ^0; por (S47A); por ⁰ mutante llevar por (S47A) transgén] período, a corto y [w por ^0, por (S47D); por mutante ⁰ por llevar (S47D) transgén] se muestran a continuación (Chiu et al 2008).. El eje X representa el tiempo o la ZT CT en LD o DD, respectivamente, y el eje Y representa cuenta con la actividad (unidades arbitrarias) resumió en 15 minutos de contenedores. Las líneas de puntos rojos conectar los picos de la noche por cada día de los experimentos. Tenga en cuenta que durante el pico de la tarde LD es "forzado" para mantener la sincronía con el ciclo de 24 horas LD, mientras que en DD el período de funcionamiento libre puede desviarse de las 24 horas. Por ejemplo, para las moscas, con cortos períodos de tiempo el momento de la actividad de la tarde tendrá lugar a principios de cada día consecutivo en DD (cuando conspiró contra una escala de tiempo de 24 horas, como se muestra aquí), mientras que un giro a la derecha se observa a las moscas con tiempo períodos.

. Figura 5: La cuantificación de los parámetros del sueño en moscas Drosophila (Cantón-S, CS) fueron expuestos a la norma ciclo LD 12:12 a 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) se utilizó para procesar los datos y Microsoft Excel se utiliza para generar los gráficos que se muestran aquí. Por lo menos 70 moscas se agruparon para obtener los promedios de grupo y barras de error (error estándar de la media) que se muestran. (A) del sueño de referencia calculado cada hora que se muestra es representativa de un ciclo diario. (B) del sueño de referencia de ciclo diario representante calcula cada 12 horas. (C) Duración media de cada pelea resto calculado en 12 incrementos de hora. (D) Tasa de actividad de vigilia calcula cada 12 horas.

Discusión

En este protocolo, que describe los procedimientos para la medición de Drosophila ritmos de actividad locomotora, un resultado confiable del comportamiento de la mosca de los relojes circadianos que se utiliza como estándar de la lectura de la función de reloj. Este ensayo se ha utilizado en gran escala de pantallas para los mutantes reloj nuevo (por ejemplo, Konopka y Benzer 1971;. Dubruille et al 2009) y se utiliza continuamente para diseccionar y comprender la función de reloj en vivo. También se ha utilizado para estudiar el ciclo sueño-vigilia en las moscas, aunque informes recientes sugieren que el análisis de vídeo digital es mucho más confiable en la cuantificación de sueño que con ritmos de actividad locomotora (Zimmerman et al. 2008). Cuando se utilizan ritmos de actividad locomotora para analizar el sueño, el porcentaje de sueño durante el día tienden a ser sobreestimadas.

Para asegurar el éxito y la reproducibilidad de este protocolo, es fundamental para las moscas de ensayo que son similares en edad, los antecedentes genéticos, y se ha criado en las mismas condiciones, como los fenotipos de comportamiento en moscas de la fruta, tales como ritmo circadiano y la actividad del sueño / descanso son muy sensibles a todos estos factores. Cuando se utiliza incubadoras múltiples para un solo experimento, es importante asegurarse de que todas las incubadoras están a la temperatura prevista, ya que algunos parámetros circadianos puede cambiar en función de la temperatura. Una palabra de precaución al considerar la compra de incubadoras para el trabajo con las moscas, no todos son creados iguales. Aunque no nos atrevemos a recomendar ninguna unidad en particular hay muchas opciones. Un buen recurso para encontrar las empresas que venden incubadoras para el trabajo de Drosophila se proporciona en . Algunas empresas incluso venden "Drosophila circadiano" incubadoras, donde se dispone de características adicionales, como ya está cableado para el sistema de Trikinetics y rampa de temperatura (por ejemplo, Tritech). Las características importantes incluyen la capacidad para el control de la luz diurna y buen control de temperatura en el rango fisiológico de Drosophila (~ 15-30 ° C). Los precios y tamaños de las incubadoras varían mucho, pero con los monitores de la actividad más reciente de Trikinetics, incluso pequeñas incubadoras puede acomodar un gran número de estos dispositivos. Además, a pesar de incubadoras con control de humedad se puede utilizar, esta característica adicional no es necesario, siempre y cuando se coloca un recipiente pequeño con agua para proporcionar humedad (50-70% está bien). Finalmente, a pesar de que utilizan de forma habitual y FaasX Insomniac para el análisis de los datos de este protocolo, hay programas alternativos y programas disponibles (Rosato y Kyriacou 2006), por ejemplo, ClockLab (ActiMetrics), Paquete de Brandeis Ritmo (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ) y MAZ (Zordan et al. 2007).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56°C-57°C
Block heater	VWR international	12621-014