含量自发活动，研究昼夜节律和睡眠参数果蝇</em

摘要

我们描述用于记录日常的自发活动节律的过程果蝇和随后的数据分析。自发活动节律是一个可靠的动物生物钟的行为输出，时钟功能的标准读数研究昼夜的突变体或环境研究如何调节昼夜节律系统时使用。

摘要

大多数生命形式表现出的细胞，生理和行为现象，是由内源性昼夜驱动（≡24小时）心脏起搏器或时钟的生活节奏。在人体生理系统的故障与许多疾病或功能紊乱。对我们的基本生理节律的机制认识出现了很大的进展，从遗传筛选，据此作为时钟功能读出一个容易测量的行为节奏。利用果蝇的研究，我们了解细胞和生化的昼夜节律的基地作出了开创性的贡献。在果蝇中读出测量的标准生物钟的行为是自发活动。在一般情况下，监控系统包括专门设计的设备，可以测量对果蝇的运动运动。这些设备被安置在环境控制的孵化器坐落在暗室和使用红外光束中断记录的小管内所载的个人苍蝇的自发活动。当过多少天计算， 果蝇表现出每天的活动和不活动周期，行为的节奏，是由动物的内源性昼夜节律系统管辖。与市售的自发活动的监控设备的出现和发展的数据分析软件方案，整个程序已经简化。我们使用系统的Trikinetics公司，这是这里所描述的过程，是目前全世界使用最流行的系统。最近，相同的监控设备已被用于研究在果蝇的睡眠行为。由于日常唤醒许多果蝇的睡眠周期可以同时测量只有1至2周，连续的自发活动数据通常是足够的，这个系统是理想的大型屏幕，以确定果蝇表现改变生物钟或睡眠属性。

研究方案

该协议的整体设计如图1所示。监测自发活动，住在环境控制的孵化器位于暗房设备的设置，首先需要进行组装。一旦完成，该系统可用于所有后续的自主活动的节奏测量。对于每个实验，（一）准备实验动物，其中可能包括转基因动物或设立必要的十字架，（二）准备玻璃活动管含食物来源，（三）活动管装入苍蝇和连接活动监控的数据收集系统，及（四）记录和分析数据，使用不同的软件取决于要检查什么昼夜或睡眠参数。在此，我们定义为“开始”实验监测设备的苍蝇时，第一次接触到所需的环境孵化器的光/暗条件。

1。设立自主活动监测系统

1. 监控系统涉及众多设备项目，如特种监控设备，昼夜光控能力的环境孵化器，数据采集设备，计算机及周边材料，如布线连接监控设备的数据采集设备（图2）。 果蝇活动监控（DAM）的数据采集系统的安装说明，提供制造商（Trikinetics公司） 。
2. 要房子的自发活动的监控系统，选择一个通风良好的房间，最好配备温度控制系统，是一个专门的暗房。涉及所有的电气系统（如计算机和孵化器），一个小而密闭的房间内的时间延长期，可产生过多的热量，导致房间的温度迅速上升。因此，孵化器将背负着额外的工作量，以保持温度和温度控制更容易失败。我们发现，即使是良好的通风良好的房间，空调在夏季过渡到秋季/冬季热量可以使其难以保持室温。在这种情况下，增加通风可能要安装在漆黑的房间，以减少经济过热的风险。另外，最好是关闭在不使用的孵化器，以尽量减少不必要的热量的生产。
3. 从外部光源的密封房间。入口可以封锁走马灯或黑色的窗帘。我们宁愿一个旋转门，因为这可以最大限度地减少不必要的光线进入暗室的机会。暗室里面，这是没有必要完全在黑暗中工作，果蝇昼夜系统是不敏感的红外光（较不敏感红灯绿/蓝灯相比）。在这里，我们需要在暗室中，但仍然要保持整体的黑暗（例如，快速删除或添加一个孵化器，在它黑暗的阶段是在监控设备）的情况下，我们简单地用一个标准的手电筒，是用红色覆盖过滤器。另外除了，如果你的暗房已经荧光灯，封面用红色滤纸或有一个独立白炽灯的台灯等滤纸覆盖。这是极不可能暴露在黑暗中的苍蝇很简短的接触，红灯（几秒钟），会影响他们的生物钟。此外，虽然果蝇的生物钟系统是非常敏感的可见光，我们不认为光的小吱吱作响，在暗室中，将相应的，在任何情况下，一个好的做法是保持孵化器门，房子的显示器只开放时必要的。此外，只开放孵化器之一，在这个时候，将最大限度地减少其黑暗的阶段暴露从孵化器要轻，轻相孵化器的可能性。
4. 购买不间断电源（UPS），应急备用单元，有足够的功率的能力，电源浪涌，尖峰，或在建设电源故障的情况下活动的监测系统的组成部分。如果可用建设应急备用电路连接UPS的紧急备用机组。要知道，即使你的设备是插成一个紧急出口在停电时可以有一个短暂的过渡期，作为系统切换到应急电源。这一过渡期间，甚至几秒钟的功率损耗可能会导致电脑关闭，并在孵化器被关闭的灯光。因此，重要的是要确保计算机被用来收集活动数据，并在孵化器的灯光控制系统不仅迷上应急电源，但也有UPS。如果控制在孵化器的照明系统是不能直接调节孵化器（在大多数情况下它是），那么它是足以插入的出现的孵化器NCY没有UPS电源功率损失了几秒钟，不会影响室温度。请注意，在一般的UPS设备将只保留在没有权力的情况下，您的设备运行5-30分钟，其主要目的是经常到应急电源的过渡期间，以防止权力的暂时损失。
5. 设置一台电脑，PC或Macintosh，充分的数据收集和/或孵化器的光控专用。由于大坝系统将所有的时间和无人值守运行，这是这台计算机上安装最小的软件，最好是没有网络连接，以尽量减少风险的崩溃。此外，该系统需要便携式数据存储，如Zip驱动器，CD / DVD刻录，或USB，允许供后续分析收集到的数据下载。
6. 手动安排周围的环境控制的孵化器搁置整齐的电话线网络允许便于插入/拔出活动监视器。标准电话线，适配器，分路器，可在商业电子商店购买和使用。在这样的一种方式，他们将汇集成一个主线和延伸孵化器连接到计算机设置多个电话线。
7. 孵化器内的监控设备连接到电脑，通过一个电源接口单元（又名Trikinetics公司的蓝色框），服务活动监视器（Trikinetics公司）通过电话线供电。此电源接口单元，也可作为数据传输切换从电话线，USB电缆接口。在同一单位，孵化器的照明系统的电源线可以连接到可选的灯控制器是可允许通过计算机控制昼夜的孵化器照明时间表。
8. 面膜可能光源LED电子设备或不当密封孵化器门与鸭磁带或黑色的布，以确保自由运行节奏，在没有不必要的光线测量。

2。实验动物的制备

1. 水果中的行为表型苍蝇，如昼夜节律和睡眠/休息的活动是非常敏感的实验动物的基因型和年龄的差异（Koh等2006）。因此，它是至关重要的，以评估这些表型，采用适当的控制，在相同的环境条件和同年龄的中饲养的动物。此外，有昼夜节律性异形“（赫尔弗里赫福斯特2000）。一般的做法是用成年雄性苍蝇，饲养25 ° C和1至5天的自发活动实验的旧之间。雄蝇雌性果蝇，而不是传统上使用，因为产蛋活动将影响自发活动的真实测量。由于性别差异，有时化验可能是雌性果蝇信息。食品，仅仅5％的蔗糖和2％的细菌用琼脂将防止非处女的女性的卵子，来自发展中国家和孵幼虫的运动，导致错误的活动计数。可以用另外，处女雌蝇交配和处女雌（赫尔弗里赫福斯特，J.生物学节律2000）之间的活动概况，虽然可能有差异。
2. 研究生物钟和睡眠/休息感兴趣的特定突变的果蝇的参数时，为谨慎起见，交配与野生型菌株相同的遗传背景，如w1118或YW突变的股票。这将删除第二个站点可能掩盖昼夜或睡眠/休息表型的遗传修饰词。由于没有穿越，在果蝇超过男性，这是更好地执行越过突变体与野生型男性女性交配。野生型菌株也将作为适当的控制实验。种子无论是野生型对照和突变的果蝇在同一时间约10至14天前的自发活动的节奏实验果蝇的食物标准（见布卢明顿果蝇的食物配方联合中心; http://flystocks.bio.indiana.edu /）。子代羽化后，收集1至5天的雄蝇，放在一边，实验中使用。
3. 与众多的遗传工具和资源，如过度表达，RNA干扰，并具体组织GAL4驱动程序飞线来自世界各地的不同的股票中心，它是可能的解剖组织的过度表达或特定的基因敲减效果和特定时空方式（品牌和1993年Perrimon麦奎尔等人2004;。奥斯特瓦德等 2001年）。研究生物钟和睡眠/休息参数，使用这种方法，苍蝇携带转基因的结构与组织特异性或药物诱导GAL4驱动程序（如男性）越过苍蝇携带的UAS的响应者（如处女女）的靶基因的转基因结构自主活动开始前14天左右实验。子代羽化后，收集1至5天的雄蝇，放在一边，实验中使用。交叉使用的亲本是经常用来作为实验的控制。 UAS的应答和GAL4与野生型果蝇相同的遗传背景下的驱动程序线杂交后代也适当的控制。
4. 如上步骤（2）（3），准备实验动物所需的时间长短有很大关系的性质和实验设计。在需要生成或穿越的计划，如果需要执行时，显然需要更多的时间将的转基因动物的情况下。后勤方面的原因，它需要14天左右，在25 ° C到对果蝇的发展，从卵到成蝇。

3。动管的制备

1. 动管在实验过程中的苍蝇栖息地。他们很瘦（直径约5毫米;注 ​​意，Trikinetics提供不同的大小，取决于待检果蝇物种）5毫米的玻璃试管包含一端食品物质，并纱或在另一端的塑料插头插入。由于玻璃活动管可重复使用多次，我们将介绍使用为出发点以前的实验中使用/未清理的活动管，编制程序。如果您使用的是新的活动管，直接跳过步骤（11）。
2. 最好是用新鲜的活动，自管内的食品有一种倾向，干起来，加班，即使保存在4 ° C时，被真菌污染管他们一般都准备了一个实验开始前一周几天。因此，它是重要的评估之前，他们准备的每次实验所需的管的数量。
3. 插头（纱或塑料塞），从使用的活动管取出，放入大玻璃烧杯。管子应该只填满一​​半的烧杯中。装满自来水的烧杯中，一定要淹没管。
4. 微波烧杯中充满了玻璃试管，直到水来全面快速煮沸融化的蜡和琼脂食品。
5. 一定要小心，水是热的。从微波炉取出烧杯中，搅拌管，用压舌板或10毫升塑料吸管，让被困蜡浮到顶部。然后重复步骤（4）。
6. 从微波炉中取出烧杯中，并等待它降温。在寒冷的房间里的烧杯中（如果可用）将加快这一进程。
7. 由于水冷却下来，蜡将水面上收集，并逐渐巩固了。只需用手取出凝固的蜡。这应该得到大部分的管蜡除掉。
8. 活动管转移到新鲜的自来水，并重复步骤（4）和（5）新的烧杯。
9. 由于大多数的蜡已删除在步骤（7），这是没有必要等待蜡巩固。简单的烧杯中倒出来的水和管转移到另一个新的烧杯中。一定要小心，水仍然是热的。
10. 重复步骤（4）和（5）最后一次。倒出来的水的烧杯中，并等待活动管降温。
11. 垂直加载它们到250毫升或500毫升的玻璃烧杯。请确定它们不是太紧凑消毒干燥周期使用高压灭菌器，或者干脆使用干燥箱干管。
12. 另外，准备食物装入活动管，使5％的蔗糖（Sigma）和蒸馏水或自来水中的细菌用2％琼脂（BD）的解决方案。高压灭菌消毒的解决方案。可立即使用的蒸压食品，或长时间储存​​在4℃。一旦凝固的食物，微波和液化为了填补管。未使用部分的食品，可以存储和使用，在以后的日子。
13. 食物最好应约65 ° C时，用来填补活动管。如果实在太热，太多的凝结管道内的积累。如果不够热，食物会巩固前管均匀填充。为了填补与食物中的活动管，使用10毫升吸管吸管沿烧杯内壁的液体食品的解决方案，使食品的解决方案，以填补从底部的活动管起来，直到管三分之一充满与解决方案。左右轻轻摇动烧杯，以确保所有的管，特别是在烧杯中的中间的，是均匀地充满了食物的解决方案。等待食物完全巩固，在室温或4 ° C继续下一步，一旦玻璃管内的凝结消散。
14. 为了从烧杯中取出活动管，烧杯底部推向管和扭曲管在同一时间，管内凝固的食品和底部将单独的烧杯。取出烧杯，管，最好是作为一个单一的一群。
15. 清洁用纸巾管的外表面，以消除多余的食物之一，其中一条管道。设置管预留一个干净的容器中。
16. 没有管人一般实验室加热器和加热以及仔细强大的铝箔盖几层。添加到铝内衬加热融化的石蜡（蜡）颗粒。
17. 非食品年底保持在管和浸蜡融化食品年底。到用冷水填补加快蜡凝固的玻璃烧杯浸蜡纸部分。再重复一次。打蜡管浸入水中，防止它们粘在一起的管子。
18. 管可以马上使用，或存放在密闭容器在4 ° C在一个星期内使用。长时间存放会导致过度干燥的食物。如果管储存在4 ° C，确保温暖他们留在替补席上的顶部，使用前的环境温度。

4。载入苍蝇到动管和自主活动监测系统

1. 在此之前加载到活动管苍蝇，打开将用于安置活动监视器的孵化器。调整使用的孵化器控制温度和设置使用坝系光控制器或孵化器自身的灯光控制系统，根据所需的实验设计，光/暗政权。加载到苍蝇活动管所需的时间应该是足够的温度稳定。
2. 麻醉与二氧化碳的苍蝇。
3. 使用精细的画笔，轻轻地转移到单一的飞行活动管。
4. 抓斗的一半左右是用细镊子英寸和活动管插入非食品年底纱堵塞开放，并在实验过程中逸出，防止飞单件的纱线中间，而在同一时间允许进入管中的气流。另外，塑料瓶盖小孔（Trikinetics公司）可以用来关闭的开放。
5. 确保管放在身体两侧，直到飞醒来，否则有卡住食物的飞行风险。
6. 管插入活动监视器。随着Trikinetics显示器的更新，更紧凑的模型（Trikinetics DAM2和DAM2 - 7），有必要举行的地方用橡皮筋管，以确保红外光束通过在管中心的地位。
7. 放入孵化器中的活动监视器和钩他们通过电话线的数据采集系统。检查是否使用了坝系采集软件，以确保所有的显示器都连接正确，数据正在收集来自各。显示器跨越每个玻璃活动管中心发出的红外光束。苍蝇的自发活动记录“一”是每个红外光束被打破或红外光束不破“零”记录的时间记录作为原始二进制数据。

5。实验设计数据记录昼夜的频率和振幅的测定

1. 苍蝇是同步的，夹带，让他们接触到所需的光/暗（LD）和温度2-5天的制度。最常用的夹带的条件是12小时，光/暗周期光/ 12小时黑暗（12:12 LD）在25 ° C。这普遍接受的标准条件，基本上是基于认为果蝇的起源从非洲赤道位置。在研究昼夜节律是一个需要熟悉一些用语。有关此协议，在孵化器的时候灯光熄灭zeitgeber时间0（ZT0）和所有其他时间都是相对的，价值（例如，在12:12劳工处周期定义，ZT12的时间时，关灯）。标准12:12劳工处条件下，野生型果蝇通常表现出两个较量的活动;称为“早晨”的高峰期，各地ZT12另一个称为“黄昏”峰（图3A）ZT0左右居中。早晨和傍晚的较量是由内源性时钟控制，但也有“惊人死不休”的反应活动的瞬时脉冲光/暗转换。夹带两天是最起码的，并可以使用，例如，在大屏幕，比较费时，而且对测量在不断的黑暗中自由运行期间（见下文，第2步）面向。然而，如果您有兴趣学习的活动模式，在每天的光暗周期，它是最好维持4-5天在劳工处的苍蝇，以便获得更多的数据。从本质上讲，增加从过去两年的苍蝇数量或劳工处天在最终的数据分析（例如，池中的数据天LD自发活动的价值），会产生更可靠的昼夜活动概况和测量（如早晨或傍晚高峰时间）。此外，每天的活动分布不同一天的长度（光照）和温度的函数。从标准的光照或温度改变的一个主要的原因是，如果想学习日常活动模式是如何进行季节性适应（如Chen等，2007）。果蝇也可以夹带每日温度循环（例如，格拉泽和Stanewsky 2005年。 Sehadova 等 2009）。只有2-3个不同的温度循环° C，足以乘火车活动节律。
2. 自由运行的自发活动的节奏不断黑暗和温度条件下测量，引气期结束后（见上文第1步）。劳工处等，随后一天的实验代表的DD的第一天的最后一天的黑暗阶段，随时可以改变光周期的设置。 7天DD数据收集足够的计算生理周期和振幅的苍蝇（例如，权力或强弱节奏）。在一般情况下，至少16苍蝇的样本大小是必须获得可靠的自由运行的时期，一个特定的基因型。即使一个是只在测量昼夜活动感兴趣，它仍然是最好的衡量果蝇的自由运行在DD时期内源性时期的变化可以改变在LD的日常活动分布。例如，苍蝇长的内源性时期，通常表现在LD的延迟晚上高峰（例如，参见图4）。
3. 在实验结束时，原始二进制数据收集，使用坝系软件下载到便携式数据存储设备，如USB密钥。
4. 原始二进制数据的处理使用大坝Filescan102X（Trikinetics公司），并归纳成15和30分钟的箱分析睡眠/休息参数时进行分析时，昼夜的参数，或1至5分钟的垃圾箱。目前，5个连续的闲置分钟是在果蝇的睡眠/休息的标准清晰度（亨德里克斯等 2000;何Sehgal 2005年）。
5. 有许多不同的方法来分析坝系收集到的数据，但我们将只提供经常在我们的实验室中使用的方法。使用Microsoft Excel的分配不同的样本群体的基因型。 FaasX软件（M. Boudinot和F. Rouyer，中心的法国国家科学研究，GIF河畔伊薇特Cedex的，法国）或失眠（基于matlab程序;张国荣安石，宾夕法尼亚州匹兹堡大学的）被用来研究昼夜（如期间和电源）或睡眠/休息（如睡眠百分比，意味着其余回合长度）参数分别。

6。代表性的成果

本协议完成后，可以使用相同的数据集，来控制动物的实验动物研究的生物钟和睡眠参数。

生理参数分析：教育图表说明LD或DD条件好几天每天的运动器官的活动或苍蝇的平均活动，可以使用FaasX（图3）生成果蝇通常表现出两个较量的活动;约ZT0（或CT为本。 ）被称为“早晨”高峰和周围ZT12（CT 12）称为“黄昏”高峰。这两个较量的活动是由内源性时钟控制，甚至可以在自由运行的DD条件（图3B）观察。这些活动高峰时间的变化可以很容易地观察到教育的图形，可能表明内源性时钟的属性的变化。另一个即指示适当的时钟功能的财产是在自发活动的预期增加，在LD周期前发生的实际暗光或光到暗的过渡（图3A，箭头）。这种行为是清楚地观察到野生型果蝇（图3A），但不在心律失常的突变体， 如^每 0（图3C）（Konopka和本泽，美国国家科学院院刊，1971年）。在每⁰突变体的情况下，所观察到的“早晨”和“黄昏”在LD峰是纯粹的惊吓反应，由于在光/暗条件的突然变化（即“无时钟”苍蝇不预期的环境变化，而 ​​只是对他们的反应）。行为节律性亏损更为明显DD和一般分为早晨或傍晚高峰自发活动的总损失（即随机较量的活动和不活动^），每0苍蝇（图3D） ，体现。除了教育图，活动的运动数据可以代表双，情节actogram（FaasX），其中两天的数据是绘制每行按顺序的最后一天的个人资料开始的价值活动两天的下一行（图4）。例如，LD1和2个被绘制在第一线的T他actogram。下一行开始重复的LD2，LD3和遵循。这种格式之后，自发活动覆盖了整个实验的数据中的actogram说明。 Actograms可以绘制为每个飞，或为每个飞基因型。对教育的图形actograms的优势之一是，在日常活动节律的周期长度的变化很容易观察到的（图4）。除了生成教育的图表和actograms，可以从DD条件下的自发活动数据提交到FaasX计算期的长短，使用不同的方案，包括周期 - P。

睡眠/休息参数分析：通过使用目前的定义， 在果蝇的睡眠/休息（亨德里克斯等 2000），这是5个连续的闲置分钟，可以自发活动实验记录的数据进行分析和研究多个使用失眠症患者的睡眠参数（L.安石），一个基于matlab程序。例如％％，苍蝇花睡的时间可以在不同的时间间隔计算，睡眠每隔一小时（图5A），或12小时（图5B）。其他较常见的睡眠可以检验包括参数的意思是休息回合的长度（图5C）和唤醒活动计数（图5D）。平均睡眠/休息回合长度是衡量睡眠是如何巩固，并能说明睡眠质量。唤醒活动，顾名思义，是苍蝇是清醒时的活动率的措施。此参数有助于区分，是真正的苍蝇影响睡眠/休息行为与那些生病或亢进。例如，只是生病的苍蝇似乎睡觉，因为他们不能自如地移动。对于这些苍蝇，将其唤醒活动有关的控制动物。

图1：流程图概述化验在果蝇的运动活动节律的主要步骤的程序，而在左边的权利提供了宝贵的意见 。执行必要的跨越和遗传操作，以获得正确的基因型与具体的实验苍蝇所需的时间量取决于变量的性质和实验设计。标有星号（*）的两个步骤提供时限为成蝇需要时将种子/交配，以产生适当的年龄（1至5天）的实验的后代。

图2：接线图，说明果蝇自发活动的数据收集坝系的不同组件之间的连接 ，一台专用计算机是用来记录果蝇的自发活动计数。活动监视器都装里面配有温度和照明（开/关）控制的孵化器。电脑也可以用来控制在孵化器的定时开/关光照明系统的电源，可挂接的电源供应器（可选）。电源接口单元管理的计算机和活动监视器/孵化器之间的通信。通过UPC连接电脑，电源单元和孵化器（如照明控制是独立的计算机）的交流电源插座，以确保不间断的监测活动，并连续照明光阶段。建议连接所有的电器设施的应急备用电路，如果有的话。

图3：教育图表使用FaasX每天运动器官的节奏的野生型果蝇（ ^每0 W苍蝇携带每一个+转基因）（A和B）与心律失常瓦特^每 0突变体（C和D）的活动节律产生雄蝇被保留在25℃，4天在12:12 LD夹带的周期（光：暗）副署长（常数黑暗）7天。对于每个飞线，个人苍蝇（N> 32）的自发活动水平测定在15分钟的垃圾箱，然后平均获得了该行的集团简介代表。 A和C显示活动产生的平均光/暗周期中的第二和第三天（LD 2-3）的数据，而B和D显示活动产生的数据均在不断黑暗的第二天和第三天（DD 2-3 ）。竖线代表活动（任意单位），在光周期（浅灰色）或黑暗时期（深灰）在15分钟的容器记录。 LD教育图表底部的横条，白，灯上;黑，灯光熄灭。 ZT0和ZT12代表的光周期的开始和结束。对于DD教育图表; CT0和CT12再版ESENT在不断的黑暗条件下的主观一天的开始和结束，由灰色条表示。在A组，男=早上繁忙，E =晚高峰。在面板上的箭头，一个代表观察野生型果蝇，这是瓦特^每 0心律失常苍蝇缺席早上和傍晚高峰的预期行为。

图4：双积actogram使用说明与野生型，短期或长期的苍蝇的自发活动数据FaasX软件生成的雄蝇，保持在25 ° C，并夹带在12:12劳工处周期为4天，八在不断的黑暗（DD）天的自由运行的周期，使用周期FaasX - P（T）计算。三与野生型时期飞线[瓦特每⁰每+; 每⁰突变担负每+转基因长期[瓦特每^0;每（S47A）; 每⁰突变每（S47A）基因携带]，和短的时期[瓦特这里显示每^0;每（S47D）; 每⁰突变进行每（S47D）转基因]（邱等，2008年） 。 X轴代表ZT或CT检查的时间，分别在LD或DD和Y轴表示活动计数（任意单位）总结成15分钟的容器。红色虚线连接的实验中的每一天的傍晚高峰。请注意，上下班高峰期间劳工处是“被迫”保持24小时LD周期同步，而在DD的自由运行期间，可以24小时偏离。例如，对于短期内的苍蝇，晚上活动的时间将更早发生连续一天中的每个DD（策划对一个24小时的时间尺度时，如下图所示），而一个正确的转变是观察苍蝇长时期。

图5：在果蝇的睡眠参数量化苍蝇（广- S，CS）在25 ° C暴露于12:12劳工处周期标准失眠（L.安石）是用来对数据进行处理和Microsoft Excel中用于生成此处所示的图表。至少有70苍蝇汇集获得该组的平均值和错误酒吧（平均值的标准误差）所示。 （一）计算基准睡眠每隔一小时;显示，每天有代表性的周期。 （二）基线代表每天循环的睡眠计算，每12小时。 （三）每个休息回合以12小时为单位计算的平均长度。 （四）苏醒活动率计算，每12小时。

讨论

在这个协议中，我们描述了测量果蝇自发活动的节奏，一个可靠的输出时钟功能的标准读数蝇生物钟的行为的程序。这已用于检测新的时钟突变体（如Konopka和1971年本泽 ; Dubruille等2009）的大型屏幕，并不断地剖析和了解在体内的时钟功能。它也被用来研究果蝇的睡眠觉醒周期，尽管最近的报告表明，视频数字化分析是更可靠的量化的睡眠比使用自主活动的节奏（ 齐默尔曼等人，2008年） 。当使用自主活动的节奏来分析睡眠，在白天的睡眠比例往往被高估。

为了确保本议定书的成功和可重复性，它是至关重要的测定年龄，遗传背景相似的苍蝇，并在同等条件下饲养，水果中的行为表型的苍蝇，如昼夜节律和睡眠/休息活动是非常敏感所有这些因素。在一次实验中使用多个孵化器，重要的是要确保所有孵化器在预期的温度作为温度的函数，因为有些昼夜参数可能会改变。一个字谨慎考虑购买苍蝇孵化器时，并非所有的平等。虽然我们毫不犹豫地推荐任何特定的单位有很多的选择。在提供一个很好的资源， 寻找果蝇工作的孵化器公司出售。有些公司甚至出售“ 果蝇生物钟”的孵化器，其中附加功能，如已为Trikinetics系统和温度斜坡（例如，Tritech）有线。重要功能包括周日光控的能力和良好的温度控制在对果蝇的生理范围（〜15-30 ℃）。孵化器的价格和大小有很大的差异，但是从Trikinetics新的活动监视器，即使是小规模的孵化器，可以容纳相当多的这些设备的数量。此外，虽然湿度控制的孵化器，可用于，这个新增的功能是没有必要的，只要你放在一个小泛水提供湿度（50-70％的罚款）。最后，虽然我们经常使用的数据分析，在本议定书FaasX和失眠，有替代方案和软件（2006年Rosato和Kyriacou），如ClockLab（ActiMetrics），布兰代斯节奏包（D.惠勒，医学院，休斯敦贝勒大学），MAZ（Zordan 等，2007）。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56°C-57°C
Block heater	VWR international	12621-014