Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

Resumo

Descrevemos os procedimentos para registrar os ritmos diários de atividade locomotora de Drosophila E posterior análise de dados. Ritmos atividade locomotora são uma saída confiável de comportamento do animal relógios circadianos e são utilizados como a leitura padrão da função de relógio circadiano ao estudar mutantes ou examinando como o ambiente regula o sistema circadiano.

Resumo

A maioria das formas de vida apresentam ritmos diários no celular, fenômenos fisiológicos e comportamentais que são movidos por circadiano endógeno (≡ 24 hr) pacemakers ou relógios. Avarias no sistema circadiano humano estão associados a inúmeras doenças ou distúrbios. Muito progresso para nossa compreensão dos mecanismos subjacentes ritmos circadianos emergiu das telas genética que conduza a um ritmo facilmente medida comportamental é usado como uma leitura fora da função de relógio. Estudos utilizando Drosophila fizeram contribuições seminais para a nossa compreensão das bases celulares e bioquímicos subjacentes ritmos circadianos. O comportamento padrão circadiano de leitura medida em Drosophila é atividade locomotora. Em geral, o sistema de monitoramento envolve dispositivos especialmente concebidos que podem medir o movimento locomotor de Drosophila. Estes dispositivos estão alojados em viveiros de ambiente controlado localizado em uma câmara escura e são baseados no uso da interrupção de um feixe de luz infravermelha para registrar a atividade locomotora de moscas individuais contidos no interior de tubos de pequeno porte. Quando medida durante muitos dias, Drosophila exibem ciclos diários de atividade e inatividade, um ritmo de comportamento que é governado por sistema endógeno circadiano do animal. O procedimento geral foi simplificada com o advento da comercialmente disponíveis locomotor dispositivos de monitoramento de atividade e desenvolvimento de programas de software para análise de dados. Nós usamos o sistema de Trikinetics Inc., que é o procedimento descrito aqui e é atualmente o mais popular sistema usado no mundo inteiro. Mais recentemente, os dispositivos de monitoramento mesmos têm sido utilizados para estudar o comportamento do sono em Drosophila. Porque o dia vigília-sono ciclos de muitas moscas podem ser medidos simultaneamente e apenas 1 a 2 semanas de dados de atividade contínua locomotor é geralmente suficiente, este sistema é ideal para grandes telas para identificar Drosophila manifestando propriedades alteradas circadiano ou dormir.

Protocolo

O projeto total do protocolo está ilustrado na Figura 1. A configuração para monitorar a atividade locomotora utilizando dispositivos alojados em viveiros de ambiente controlado localizado em uma câmara escura deve ser reunido em primeiro lugar. Uma vez que seja concluído, o sistema pode ser usado em todas as medições posteriores locomotor ritmo de atividade. Para cada experimento, tem-se a (i) preparar animais de experimentação, que pode incluir gerar animais transgênicos ou a criação de cruzes necessárias, (ii) preparar tubos de vidro contendo atividade uma fonte de alimento, (iii) de carga em tubos de moscas atividade e conectar monitores de atividade para o sistema de coleta de dados, e (iv) registrar e analisar os dados usando um software diferente, dependendo do que parâmetros circadianos do sono ou se quer examinar. Aqui, definimos o "start" do experimento como o tempo voa quando nos dispositivos de monitoramento são primeiro expostos à luz desejado / escuro em incubadoras ambiental.

1. Configurando o Sistema de Monitoramento de Atividade Locomotor

1. O sistema de monitoramento envolve itens de equipamentos diversos, tais como dispositivos especiais de monitoramento, incubadoras ambientais que têm a capacidade de controle de luz diurna, os dispositivos de coleta de dados, computadores e periféricos, como cabos para conectar os dispositivos de monitoramento para os dispositivos de coleta de dados (Figura 2). Instruções para instalar o Activity Monitoring Drosophila (DAM) de dados do sistema de coleta são fornecidos pelo fabricante (Trikinetics Inc.).
2. Para abrigar o sistema de monitoramento de atividade locomotora, escolha um quarto bem ventilado, de preferência equipado com sistema de controle de temperatura, para ser uma câmara escura dedicados. Com todos os sistemas elétricos envolvidos (por exemplo, computadores e incubadoras) correndo por um longo período de tempo dentro de um quarto pequeno e confinado, calor excessivo pode ser gerado levando a um rápido aumento na temperatura da sala. Conseqüentemente, as incubadoras serão sobrecarregados com a carga de trabalho extra para manter a temperatura e mais probabilidade de falhar no controle de temperatura. Nós achamos que, mesmo para o bem-ventilados, a transição de ar-condicionado no verão para aquecer no inverno outono / pode tornar difícil para manter a temperatura ambiente. Em tais casos, ventilação adicional pode ter que ser instalado na sala escura para reduzir o risco de superaquecimento. Além disso, é melhor desligar incubadoras que não estão em uso para minimizar a produção de calor desnecessárias.
3. Selar o quarto a partir de fontes de luz externa. Entrada pode ser selada com uma porta giratória ou cortina preta. Nós preferimos uma porta giratória, pois isso minimiza as chances de luz indesejada de entrar na câmara escura. Dentro da câmara escura, não é necessário trabalhar completamente no escuro como o fruto moscas sistema circadiano não é sensível à luz infravermelha (e é muito menos sensível à luz vermelha em comparação com luz verde / azul). Nos casos em que precisamos ver na câmara escura, mas ainda quer manter a escuridão total (por exemplo, rapidamente removendo ou adicionando um dispositivo de monitoramento em uma incubadora que está em sua fase escura), nós simplesmente usar uma lanterna padrão que é coberto com um vermelho filtro. Alternativamente ou em adição, se sua câmara escura tem luzes fluorescentes, cobri-las com papel de filtro vermelho ou ter uma luz desk stand-alone incandescente coberta com papel de filtro tal. É altamente improvável que a exposição de moscas no escuro para exposições muito breve (alguns segundos) de luz vermelha irá afetar seus relógios circadianos. Além disso, embora o sistema circadiano da Drosophila é muito sensível à luz visível, não pensamos range pequena de luz na câmara escura serão conseqüentes, em qualquer caso, uma boa prática é manter as portas incubadora que os monitores de casa aberta somente quando necessário. Além disso, apenas abrir uma incubadora em um momento como este irá minimizar a possibilidade de uma incubadora em sua fase escura sendo exposta à luz de uma incubadora na sua fase de luz.
4. Comprar uma fonte de alimentação ininterrupta (UPS) unidade de backup de emergência que tem capacidade suficiente para alimentar a potência componentes do sistema de monitoramento de atividades em caso de surtos, picos, ou falta de energia no prédio. Ligar a UPS unidade de backup de emergência para o circuito de backup de emergência do edifício, se disponível. Estar ciente de que mesmo se seu equipamento é conectado a uma tomada de emergência durante uma queda de energia não pode ser um curto período de transição como o sistema muda para energia de emergência. Durante essa transição, perda de poder até mesmo para alguns segundos pode levar a desligar computadores e as luzes na incubadora a ser desligado. Assim, é importante assegurar que os computadores sendo usados ​​para coletar os dados de atividade e do sistema de controle de luzes na incubadora não são apenas viciado em energia de emergência, mas também um no-break. Se o sistema de controle de iluminação na incubadora não é regulada diretamente pela incubadora (na maioria dos casos é), então é suficiente para ligar a incubadora para o emergirNCY poder sem uma UPS, como a perda de poder por alguns segundos, não afetará a temperatura da câmara. Note-se que, em geral, um dispositivo UPS só irá manter seu equipamento funcionando para min 50-30, na ausência de poder, o seu objectivo principal é proteger contra a perda temporária de poder durante a transição de regular a energia de emergência.
5. Configurar um computador, PC ou Macintosh, totalmente dedicado para a coleta de dados e / ou para controlar a luz das incubadoras. Desde que o sistema DAM estará funcionando o tempo todo e autônoma, recomenda-se que este computador tem o mínimo de software instalado, de preferência nenhuma conexão de rede para minimizar o risco de cair. Além disso, o sistema precisa de armazenamento de dados portáteis, por exemplo, zip drive, CD / DVD ou USB, para permitir o download dos dados coletados para análise posterior.
6. Organizar manualmente a rede de linha telefônica ordenadamente em torno do arquivamento do incubadoras de ambiente controlado para permitir a facilidade de ligar / desligar de monitores de atividade. Linhas telefônicas padrão, adaptadores, e divisores podem ser comprados em lojas eletrônicas comerciais e usados. Configurar várias linhas telefônicas de uma forma tal que eles vão convergir em uma linha principal e estendem para fora da incubadora para se conectar ao computador.
7. Conecte os dispositivos de monitoramento dentro das incubadoras para o computador através de uma unidade de interface de alimentação (caixa azul aka de Trikinetics Inc.), que serve para alimentar a monitorar a atividade (Trikinetics Inc.), através da linha telefônica. Este poder unidade de interface de fornecimento também atua como uma interface para transferência de dados de comutação de linha telefônica para cabo USB. Controlador de luz opcionais na mesma unidade em que o cabo de linha de energia do sistema de luzes incubadora pode ser conectado a, está disponível para permitir o controle da programação circadiano iluminação incubadora através do computador.
8. Fontes de máscara possível a luz de LED de aparelho eletrônico ou impropriamente vedação da porta com fita incubadora pato ou um pano preto para garantir free-running ritmos são medidos na ausência de luz indesejada.

2. Preparação de Animais Experimentais

1. Fenótipos comportamentais em moscas de fruta, como ritmicidade circadiana e sono / repouso atividade são muito sensíveis a diferenças genotípicas e idade dos animais de teste (Koh et al. 2006). Portanto, é crucial para avaliar esses fenótipos com animais controle adequado que são criados nas mesmas condições ambientais e da mesma idade. Além disso, há dimorfismo sexual na ritmicidade circadiana (Helfrich-Foster 2000). A prática geral é a utilização de machos adultos que são criados em 25 ° C e entre 1-5 dias de idade para os testes de atividade locomotora. Macho voa em vez de moscas fêmeas são tradicionalmente usado porque egg-laying atividade afetará verdadeira medida de atividade locomotora. Porque de dimorfismo sexual, às vezes assaying moscas fêmeas pode ser informativo. Alimentares que consistam em apenas 5% de sacarose e 2% agar Bacto vai evitar que os ovos de fêmeas não-virgens de desenvolvimento e movimentação de larvas eclodidas de causar atividade conta errada. Alternativamente, as moscas fêmeas virgens podem ser utilizados embora possa haver diferenças nos perfis de atividade entre acoplado e fêmeas virgens (Helfrich-Forster, J. Biol. Rhythms 2000).
2. Ao examinar circadiano eo sono / repouso parâmetros específicos de moscas mutantes de interesse, é prudente outcross o estoque mutante com a cepa do tipo selvagem do mesmo fundo genético, por exemplo, w1118 ou yw. Isto irá remover modificadores segundo site genética que pode potencialmente máscara fenótipo circadiano ou sono / descanso. Como não há crossing-over em Drosophila do sexo masculino, é melhor realizar a outcross cruzando fêmeas mutante com tipo selvagem do sexo masculino. A cepa do tipo selvagem também servirá como o controle apropriado para o experimento. Semente tanto o controle do tipo selvagem e moscas mutantes, ao mesmo tempo em Drosophila padrão alimentar cerca de 10 a 14 dias antes do experimento atividade locomotora ritmo (ver Bloomington Centro de Ações para a Drosophila receita de alimentos; http://flystocks.bio.indiana.edu /). Após a eclosão da progênie, coletar 1-5 dias de vida machos e configurá-los de lado para ser usado para os experimentos.
3. Com as inúmeras ferramentas genéticas e recursos como superexpressão, RNAi, e de tecidos específicos linhas motorista GAL4 voar disponível a partir de centros de ações diferentes em todo o mundo, é possível para dissecar os efeitos da superexpressão ou bater-down genes específicos em tecidos e temporal específico maneira (Marca e Perrimon 1993; McGuire et al 2004;.. Osterwalder et al 2001). Para examinar circadiano eo sono / repouso parâmetros usando essa abordagem, as moscas carregando construções transgênicas com tecido específico ou medicamento induzível-driver GAL4 (machos, por exemplo) são cruzados para as moscas carregando construções transgênicas com genes alvo anexado ao responder UAS (por exemplo, mulheres virgem) cerca de 14 dias antes do início da atividade locomotoraexperimentos. Após a eclosão da progênie, coletar 1-5 dias de vida machos e configurá-los de lado para ser usado para os experimentos. Os genitores utilizados para a cruz são rotineiramente usados ​​como controle para os experimentos. Progênie de cruzamentos de UAS responder e GAL4 linhas motorista com moscas do tipo selvagem do mesmo fundo genético também são controles apropriados.
4. Conforme indicado nas etapas (2) e (3), o período de tempo necessário para a preparação de animais experimentais varia muito, dependendo da natureza e do desenho do experimento. No caso em que os animais transgênicos precisam ser geradas ou se esquemas de cruzamento precisa ser executado, mais tempo será, obviamente, necessário. Por razões logísticas, que leva cerca de 14 dias a 25 ° C para a Drosophila para desenvolver a partir de ovos de moscas adultas.

3. Preparação dos tubos de Atividade

1. Tubos de atividade representam o habitat da mosca durante o experimento. Eles são finos (cerca de 5 mm de diâmetro; nota, Trikinetics oferece diferentes tamanhos, dependendo da espécie Drosophila a ser testada) 5 mm tubos de vidro que contêm substância alimentar em uma extremidade e ligado com fio ou o plugue de plástico na outra extremidade. Uma vez que os tubos de vidro de atividade pode ser reutilizada várias vezes, vamos descrever os procedimentos de preparação por meio de sondas de atividade usados ​​/ limpar a partir de experiências anteriores como ponto de partida. Se você estiver usando tubos de nova atividade, simplesmente pule para o passo (11).
2. É preferível usar tubos de atividade que são feitos na hora desde que o alimento no interior dos tubos tem uma tendência a secar e fica contaminada com fungos de horas extras, mesmo quando armazenados a 4 ° C. Eles são geralmente preparadas alguns dias para uma semana antes do início do experimento. Portanto, é importante para avaliar o número de tubos necessários para cada experimento antes de prepará-los.
3. Remova os bujões (plug fios ou plástico) de tubos de atividade utilizados e colocá-los em copo de vidro de grandes dimensões. Os tubos devem apenas preencher até metade do copo. Encha o copo com água da torneira, certificando-se submergir os tubos.
4. Microondas o copo cheio de tubos de vidro até que a água chega a ferver rápida completo para derreter a cera e alimentos agar.
5. Tome cuidado que a água está quente. Retirar o copo do microondas e mexa os tubos com uma espátula de plástico ou uma pipeta 10 mL para permitir cera presos para flutuar até o topo. Em seguida, repita o passo (4).
6. Retirar o copo do microondas e espere até que esfrie. Colocar o copo na câmara fria (se estiver disponível) vai acelerar o processo.
7. Enquanto a água esfria, a cera irá coletar na superfície da água e se solidifica gradualmente. Basta remover a cera solidificou com a mão. Isso deve se livrar da maioria da cera nos tubos.
8. Transferir os tubos de atividade para um copo novo com água fresca e repita os passos (4) e (5).
9. Desde que a maioria da cera foi removido no passo (7), não é necessário esperar para que a cera solidificar. Basta deitar a água fora do copo e transferir os tubos em um outro copo novo. Tome cuidado que a água ainda está quente.
10. Repita os passos (4) e (5) para a última hora. Despeje a água fora do copo e espere que os tubos de atividade para esfriar.
11. Carregá-los verticalmente em 250 mL ou copos de vidro 500ml. Certifique-se que não são muito bem embalado. Esterilizá-los usando um autoclave com um ciclo de seca ou simplesmente usar um forno de secagem para secar os tubos.
12. Em separado, para preparar a comida para carregar dentro dos tubos de atividade, faça uma solução de sacarose 5% (Sigma) e 2% agar Bacto (BD) em água destilada ou água da torneira. Autoclave para esterilizar a solução. A comida autoclavado pode ser usado imediatamente ou armazenado em 4 ° C por um período prolongado de tempo. Uma vez que o alimento se solidifica, um terá de microondas e liquefazê-lo, a fim de encher os tubos. Parte não utilizada do alimento pode ser armazenado e utilizado posteriormente.
13. A comida deve ser idealmente em torno de 65 ° C, quando utilizado para preenchimento de tubos de atividade. Se for muito quente, condensação muito vai se acumular dentro dos tubos. Se não for quente o suficiente, a comida vai solidificar antes os tubos são preenchidos uniformemente. Para encher os tubos de atividade com os alimentos, use uma pipeta 10 mL para pipetar a solução para alimentos líquidos ao longo da parede interior do copo de vidro, permitindo a solução de alimento para encher o tubo de atividade de baixo para cima, até que os tubos são de um terço cheio com a solução. Copo de turbulência ao redor com cuidado para certificar-se de todos os tubos, especialmente os mais no meio do copo, são uniformemente preenchido com solução de alimentos. Aguarde até que o alimento para solidificar completamente ou em temperatura ambiente ou 4 ° C. Prossiga para a próxima etapa uma vez a condensação no interior dos tubos de vidro se dissipar.
14. Para remover os tubos de atividade do copo, empurre os tubos para o fundo do copo e torcer os tubos ao mesmo tempo, para que o alimento solidificado no interior dos tubos e no fundodo copo irá separar. Pegue os tubos de fora do copo, de preferência como um grupo único.
15. Limpe os tubos um a um com papel toalha para remover o excesso de alimentos na superfície externa dos tubos. Definir os tubos de lado em um recipiente limpo.
16. Tome um aquecedor de bloco geral de laboratório sem o suporte do tubo e cobrir o aquecimento cuidadosamente bem com várias camadas de papel alumínio forte. Adicionar parafina (cera) pellets para o aquecimento de alumínio revestido bem para derreter.
17. Segurar os tubos no final não alimentares e mergulhe no final de alimentos para a cera derretida. Mergulhe a parte encerada, para um copo de vidro cheio de água fria para acelerar a solidificação da cera. Repetir uma vez. Mergulhando os tubos em água encerado irá impedir os tubos grudem umas nas outras.
18. Os tubos podem ser usados ​​imediatamente, ou armazenado em um recipiente hermético, em 4 ° C para uso dentro de uma semana. Armazenamento prolongado levará a secagem excessiva do alimento. Se os tubos são armazenados a 4 ° C, certifique-se de aquecê-los até à temperatura ambiente por deixá-los na bancada antes do uso.

4. Carregando Flies em tubos de Atividade e Monitoramento do Sistema Locomotor Atividade

1. Antes de carregá-moscas em tubos de atividade, ligar a incubadoras que serão usados ​​para abrigar os monitores de atividade. Ajuste a temperatura usando os controles incubadora e definir o regime de claro / escuro usando o DAM controlador de luz do sistema ou a incubadoras próprio sistema de controle de luz de acordo com o delineamento experimental desejada. O tempo necessário para carregar as moscas em tubos de atividade deve ser suficiente para a temperatura se estabilize.
2. Anestesiar as moscas com dióxido de carbono.
3. Use um pincel fino para gentilmente transferir uma única mosca em um tubo de atividade.
4. Agarre a meio de um único pedaço de fio que é de cerca de meia polegada com uma pinça fina e insira o fio na extremidade não-alimentares do tubo de atividade para ligar a abertura e impedir a voar a partir de escapar durante o experimento, enquanto no mesmo tempo permitindo que o fluxo de ar dentro do tubo. Alternativamente, tampas de plástico com pequenos furos (Trikinetics, Inc.) pode ser usado para fechar a abertura.
5. Certifique-se que os tubos são colocados em seus lados até que a mosca desperta, ou então existe o risco de ficar preso a mosca ao alimento.
6. Inserir os tubos para o monitora a atividade. Com o modelo mais novo, mais compacto dos monitores Trikinetics (Trikinetics DAM2 e DAM2-7), é necessário para manter os tubos no local com faixas de borracha para garantir que o feixe de infravermelho passa o tubo na posição central.
7. Coloque o monitora a atividade no incubadoras e conectá-los ao sistema de coleta de dados através dos fios de telefone. Verifique, utilizando o software de coleta de DAM sistema para garantir que todos os monitores estão ligados corretamente e os dados estão sendo coletados de cada um deles. O monitor emite feixe de luz infravermelha através do centro de cada tubo de vidro atividade. A atividade locomotora das moscas são registrados como dados binários brutos, onde "um" é registrado cada vez que o feixe de infravermelho é quebrado ou um 'zero' é gravada em que o feixe de infravermelho não está quebrado.

5. Projeto experimental para registro de dados para determinação da periodicidade circadiana e Amplitude

1. As moscas são sincronizados e arrastado, expondo-os ao regime de claro / escuro (LD) e temperatura desejada por 2-5 dias inteiros. A condição de arrastamento mais comumente utilizado é um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz / 12 horas escuro (12:12 LD) a 25 ° C. Esta condição geralmente aceitos padrão baseia-se essencialmente o pensamento que originou Drosophila Afro-equatorial locais. Ao estudar os ritmos circadianos há alguma fraseologia que se precisa para se familiarizar com. Relevantes para este protocolo, o tempo quando as luzes se na na incubadora é definida como zeitgeber tempo 0 (ZT0) e todas as outras vezes são relativos a esse valor (por exemplo, em um ciclo de 12:12 LD, ZT12 é o momento em que o luzes são desligadas). Em condições normais 12:12 LD, tipo selvagem Drosophila melanogaster normalmente exibem duas lutas de actividade; um centrado em torno ZT0 chamado de "manhã" de pico e outro em torno ZT12 chamado de "noite" de pico (Figura 3A). Os ataques manhã e à noite são controlados pelo relógio endógeno, mas também há "sobressalto" respostas que são rajadas de atividade transitória em resposta às transições claro / escuro. Dois dias de arrastamento é o mínimo e poderia ser usado, por exemplo, em telas de grandes dimensões que são mais demorados e são voltadas para a medição de free-running períodos na escuridão constante (ver abaixo, passo 2). No entanto, se você estiver interessado em estudar os padrões de atividade durante um ciclo de claro-escuro diária, é preferível manter as moscas por 4-5 dias em LD de forma a obter mais dados. Essencialmente, o aumento do número de moscas ou o número de dias LD na análise final dos dados (por exemplo, os dados da piscina os dois últimosdias de atividade locomotora LD) vai gerar mais confiável perfis atividade diurna e medições (por exemplo, o momento de pico da manhã ou noite). Além disso, a distribuição diária da atividade varia em função da duração do dia (fotoperíodo) e temperatura. Uma das principais razões para alterar o fotoperíodo e temperatura do padrão é se alguém quisesse estudar como padrões de atividade diária sofrer adequação sazonais (por exemplo, Chen et al 2007). Drosophila também pode ser arrastado para ciclos de temperatura diária (por exemplo, Glaser e Stanewsky 2005.; Sehadova et al. 2009). Ciclos de temperatura que variam por apenas 2-3 ° C são suficientes para ritmos atividade entrain.
2. Livre ritmos de atividade locomotora em execução são medidos sob escuro constante e condições de temperatura após o período de entraining está terminado (veja acima, passo 1). A configuração para o ciclo de luz pode ser alterada a qualquer momento na fase escura, no último dia de LD tal que no dia seguinte do experimento representa o primeiro dia do DD. Sete dias de coleta de dados DD é suficiente para calcular o período circadiano e amplitude (energia, por exemplo, ou a força do ritmo) de moscas. Em geral, um tamanho de amostra de pelo menos 16 moscas é necessário obter confiável free-running períodos de um genótipo particular. Mesmo se um só está interessada em medir a atividade diurna, ainda é melhor para medir o free-running das moscas períodos em DD como mudanças no período endógeno pode alterar a distribuição diária de atividade em LD. Por exemplo, voa com longos períodos de picos endógenos geralmente exibem noite atrasada em LD (por exemplo, ver Figura 4).
3. Na conclusão do experimento, dados binários brutos obtidos utilizando o software Sistema de DAM é baixado em um dispositivo portátil de armazenamento de dados, por exemplo, chaves USB.
4. Os dados binários brutos são processados ​​usando DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) e somados em 15 e 30 minutos caixas ao analisar parâmetros circadianos, ou 1-5 caixas minutos quando se analisa o sono / repouso parâmetros. Atualmente, cinco minutos de inatividade contígua é a definição padrão de sono / descanso em Drosophila (Hendricks et al 2000;. Ho e Sehgal, 2005).
5. Existem muitas maneiras diferentes para analisar os dados coletados no Sistema de DAM mas vamos apenas fornecer os métodos usados ​​rotineiramente em nosso laboratório. Microsoft Excel é usado para atribuir a grupos de amostra genótipo diferente. FaasX software (M. e F. Boudinot Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, França) ou Insomniac (Matlab programa baseado; Leslie Ashmore, da Universidade de Pittsburgh, PA) são usados ​​para examinar circadiano ( período por exemplo, e poder) ou o sono / repouso (por exemplo, o sono percentuais, significa descanso luta comprimento) parâmetros, respectivamente.

6. Resultados representante

Após a conclusão deste protocolo, pode-se usar o mesmo conjunto de dados para analisar parâmetros de ambos os circadiano eo sono dos animais experimentais em relação aos animais controle.

Análise de parâmetros circadianos: Educação gráficos ilustram as atividades de locomoção diária ou atividades médio de moscas durante vários dias em LD ou DD condições podem ser gerados usando FaasX (Figura 3) Drosophila melanogaster geralmente apresentam duas lutas de actividade; um centrado em torno ZT0 (ou CT. ) chamou de "manhã" de pico e outro em torno ZT12 (CT 12) de pico "noite" chamado. Estes dois episódios de atividades são controladas pelo relógio endógeno, e pode até mesmo ser observado em condições de free-running DD (Figura 3B). Mudanças no calendário destes picos de atividade pode ser facilmente observado nos gráficos educação e pode indicar uma mudança nas propriedades do relógio endógeno. Outra propriedade que é indicativo de função de relógio adequada é o aumento antecipado na atividade locomotora observada em ciclos de LD que ocorre antes do transições reais escuro para a luz ou luz-to-escuros (Figura 3A, setas). Este comportamento é claramente observado em moscas do tipo selvagem (Figura 3A), mas está ausente em mutantes arrítmicos, como por ⁰ (Figura 3C) (Konopka e Benzer, PNAS, 1971). No caso dos mutantes por ^0, a "manhã", observou e "noite" picos de LD são respostas puramente sobressalto devido a mudanças bruscas de luz / escuro ('clockless ", ou seja moscas não antecipar as mudanças ambientais, mas apenas reagir a eles ). Perda da ritmicidade comportamental é muito mais pronunciado no DD e geralmente se manifesta na perda total de manhã ou à noite picos de atividade locomotora (ou seja, ataques aleatórios de atividade e inatividade), como visto em moscas por ⁰ (Figura 3D). Além de gráficos de educação, os dados de atividade locomotora pode ser representado como actogram trama dupla (FaasX), onde dois dias de dados são plotados seqüencialmente em cada linha, mas o perfil do último dia começa a próxima linha de dois dias de atividade (Figura 4). Por exemplo, LD1 e 2 são plotados na primeira linha de tele actogram. A linha seguinte começa com uma repetição do LD2 e é seguido por LD3 e assim por diante. Seguindo este formato, os dados de atividade locomotora abrangendo todo o experimento é ilustrado no actogram. Actograms podem ser plotados para cada fly individual, ou para cada genótipo voar. Uma vantagem de mais de actograms gráficos educação é que uma mudança na duração do período de ritmos atividade diária é facilmente observável (Figura 4). Além de gerar gráficos educação e actograms, dados de atividade locomotora da condição DD podem ser submetidos a FaasX para calcular a duração do período usando uma série de programas diferentes, incluindo P-Cycle.

Análise de sono / descanso parâmetros: Ao usar a actual definição de sono / descanso em Drosophila (Hendricks et al 2000.), Que é de cinco minutos de inatividade contíguos, pode-se analisar os dados gravados a partir de ensaios de atividade locomotora e analisar os parâmetros do sono múltipla utilizando Insomniac (L. Ashmore), um programa baseado em Matlab. A porcentagem de tempo que voa gastar dormir pode ser calculada em diferentes intervalos de tempo, por exemplo, o sono por cento a cada hora (Figura 5A), ou 12 horas (Figura 5B). Outros parâmetros do sono mais comuns que podem ser examinados incluem significar descanso luta comprimento (Figura 5C) e contagem de acordar atividade (Figura 5D). A média de sono / descanso luta comprimento é uma medida de como o sono é consolidada e pode ilustrar a qualidade do sono. Atividade de vigília, como o próprio nome sugere, é uma medida da taxa de atividade, quando as moscas estão acordados. Este parâmetro ajuda a diferenciar entre moscas que realmente foram afetadas durante o sono / repouso comportamentos versus aqueles que são doentes ou hiperativo. Por exemplo, as moscas que são simplesmente doente pode parecer para dormir mais, porque eles não são tão móvel. Por essas moscas, sua atividade acordar será menor em relação aos animais controle.

Figura 1: Fluxograma delineando os principais passos para assaying ritmos atividade locomotora em Drosophila Os procedimentos são apresentados à esquerda, enquanto comentários úteis são fornecidos à direita.. A quantidade de tempo necessário para realizar cruzamentos necessários e manipulações genéticas para obter moscas com o genótipo ideal para experiências específicas é variável, dependendo da natureza e desenho do experimento. A dois passos marcados com asteriscos (*) fornecer o prazo para quando as moscas adultas precisam ser semeados / acoplado a gerar progênies da idade apropriada (1-5 dias) para o experimento.

Figura 2: Esquema de ligação ilustrar as conexões entre os diferentes componentes para a coleta de dados Drosophila atividade locomotora utilizando o Sistema de DAM Um computador dedicado é usado para registrar as contagens locomotor atividade de Drosophila.. Monitora a atividade estão alojados dentro de incubadoras equipado com temperatura e iluminação (On ​​/ Off) de controle. O computador também pode ser usado para controlar o tempo de luz On / Off em incubadoras se a fonte de alimentação do sistema de iluminação pode ser ligado à fonte de alimentação (opcional). Comunicações entre o computador e monitora a atividade / incubadoras são geridos pela unidade de interface de alimentação. O computador, fonte de alimentação e incubadoras (se o controle de iluminação é independente do computador) são ligados à tomada eléctrica AC através da UPC para garantir um acompanhamento ininterrupto de atividade e iluminação contínua durante a fase de luz. Recomenda-se conectar todos os aparelhos elétricos para os circuitos de emergência de backup na unidade, se disponível.

Figura 3:. Educação gráficos gerados usando FaasX mostrando ritmos diários de atividade locomotora de rítmica moscas do tipo selvagem (w por ⁰ voa carregando um transgene por +) (A e B) vs arrítmicos w ⁰ por mutantes (C e D) machos foram mantidos a 25 ° C e arrastado por 4 dias em 0:12 LD (luz: escuro) ciclos seguidos de sete dias em DD (escuridão constante). Para cada linha da mosca, os níveis de atividade locomotora de moscas individual (n> 32) foram medidos em caixas de 15 minutos e, em seguida, em média, para obter um perfil do grupo representante dessa linha. A e C mostram os dados gerados a partir de atividade média dos segundo e terceiro dias no ciclo claro / escuro (LD 2-3), enquanto B e D mostram os dados gerados a partir de atividade média dos segundo e terceiro dias na escuridão constante (DD 03/02 ). Barras verticais representam a atividade (em unidades arbitrárias) registrados em 15 minutos caixas durante o período de luz (cinza claro) ou o período escuro (cinza escuro). Barras horizontais na parte inferior dos gráficos LD educação; branco, luzes acesas, preto, luzes apagadas. ZT0 e ZT12 representam o início eo final do fotoperíodo, respectivamente. Para gráficos educação DD; CT0 e CT12 represente o início eo fim do dia subjetiva em constante condições escuro, indicado pela barra cinza. No painel A, M = pico da manhã; E = pico da noite. As setas no painel A representar o comportamento de antecipação de manhã e à noite picos observados nas moscas do tipo selvagem, que estão ausentes em w ⁰ por moscas arrítmicas.

Figura 4:. Double-enredo actogram gerados usando o software FaasX ilustrando os dados de atividade locomotora de moscas com o tipo selvagem, a curto ou longo período moscas machos foram mantidos a 25 ° C e arrastado por 4 dias em ciclos 0:12 LD seguido por oito dias na escuridão constante (DD) para o cálculo do período de free-running (t) usando Ciclo P-in FaasX. Três linhas de voar com período de tipo selvagem [w por ^0; per +; por ⁰ mutante carregando por + transgene], o longo período [w por ^0; por (S47A); por ⁰ mutante levando por (S47A) transgene] período, e curto [w por ^0; por (S47D); por ⁰ mutante levando por (S47D) transgene] são mostrados aqui (Chiu et al 2008).. X-eixo representa ZT ou CT tempo em LD ou DD, respectivamente, e eixo Y representa a atividade conta (unidades arbitrárias) resumiu em 15 minutos caixas. As linhas vermelhas pontilhadas conectar os picos da noite para cada dia dos experimentos. Note-se que durante o pico LD noite é "forçada" para manter a sincronia com o ciclo LD 24 horas, enquanto no DD o período de free-running pode desviar-se 24 horas. Por exemplo, para moscas com curtos períodos de tempo o tempo da atividade de noite vai ocorrer mais cedo em cada dia sucessivo em DD (quando plotados contra uma escala de tempo 24 horas, como mostrado aqui), enquanto que uma mudança para a direita é observado para as moscas, com longos períodos.

. Figure 5: Quantificar os parâmetros do sono nas moscas Drosophila (Canton-S; CS) foram expostos ao ciclo padrão LD 12:12 a 25 ° C. Insomniac (L. Ashmore) foi usado para processar os dados e Microsoft Excel foi utilizado para gerar os gráficos mostrados aqui. Pelo menos 70 moscas foram agrupados para obter as médias de grupo e barras de erro (erro padrão da média) mostrada. (A) do sono da linha de base calculada a cada hora; mostrado é um ciclo representativa diária. (B) da linha de base do sono ciclo diário representante calculada a cada 12 horas. (C) comprimento médio de cada ataque resto calculada em incrementos de 12 horas. (D) Taxa de atividade de vigília calculada a cada 12 horas.

Discussão

Neste protocolo, descrevemos os procedimentos para medir ritmos locomotor Drosophila atividade, uma saída confiável de comportamento da mosca relógios circadianos que é usado como a leitura padrão da função de relógio. Este ensaio tem sido usado em grande escala telas para os mutantes novela clock (por exemplo, Konopka e Benzer 1971;. Dubruille et al 2009) e é continuamente usada para dissecar e entender a função clock in vivo. Também tem sido usado para estudar o ciclo vigília-sono em moscas, apesar de relatórios recentes sugerem que a análise de vídeo digital é muito mais confiável na quantificação de sono do que usando ritmos de atividade locomotora (Zimmerman et al. 2008). Ao usar ritmos atividade locomotora para analisar o sono, a porcentagem de sono durante o dia tendem a ser superestimados.

Para garantir o sucesso e reprodutibilidade deste protocolo, é essencial para as moscas ensaio que são similares em idade, antecedentes genéticos, e criados nas mesmas condições, como fenótipos comportamentais em moscas de fruta, como ritmicidade circadiana e sono / repouso atividade são muito sensíveis a todos esses fatores. Ao usar incubadoras múltiplas para um único experimento, é importante certificar-se de todas as incubadoras são na temperatura antecipada uma vez que alguns parâmetros circadianos podem mudar em função da temperatura. Uma palavra de cautela quando se considera compra de incubadoras para trabalhar com moscas, nem todos são criados iguais. Enquanto hesitamos em recomendar qualquer unidade particular, há muitas opções. Um bom recurso para encontrar empresas que vendem incubadoras para o trabalho Drosophila é fornecido . Algumas empresas chegam a vender "Drosophila circadiano" incubadoras, onde os recursos adicionais disponíveis, como já fio para o sistema Trikinetics e rampa de temperatura (por exemplo, Tritech). Características importantes incluem a capacidade de controle de luz diurna e bom controle de temperatura na faixa fisiológica de Drosophila (~ 15-30 ° C). Preços e tamanhos de incubadoras variam muito, mas com os monitores mais recentes de atividade Trikinetics, mesmo incubadoras pequeno pode acomodar um grande número destes dispositivos. Além disso, embora incubadoras com controle de umidade pode ser usado, este recurso adicional não é necessário, desde que você coloque uma panela pequena com água para fornecer umidade (50-70% é bom). Finalmente, embora rotineiramente usam FaasX e Insomniac para análise de dados neste protocolo, existem programas alternativos e softwares disponíveis (Rosato e Kyriacou 2006), por exemplo, ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Pacote Rhythm (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ), e MAZ (Zordan et al. 2007).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56°C-57°C
Block heater	VWR international	12621-014