الطريقة الثقافة القوارض باستخدام الأجنة الجامع للثقافة الدوار زجاجة من نوع النظام

Summary

ثقافة بأكملها تقنية الجنين يسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران خارج الحي حالة فترات محدودة خلال المقابلة الى مراحل midgestation. في هذا البروتوكول الفيديو ، ونظهر إجراءاتنا القياسية للثقافة الفئران الجنين كله بعد E12.5 باستخدام زجاجة الثقافة المدورة من نوع النظام.

Abstract

وقد وضعت كلها الجنين الثقافة (WEC) في عام 1950 أسلوب جديد من قبل وزملائه ، وقدم طلبا للعلم الأحياء التطوري ^1. على الرغم من تطور ونمو أجنة من الثدييات التي تعتمد بشكل حاسم على وظيفة المشيمة ، WEC تقنية تسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران السابقين شرط المجراة خلال فترات محدودة الموافق المراحل الجنينية midgestation خلال اليوم (E) 6.5 في E12.5 الماوس أو E8.5 - E14.5 في الفئران ^{2 ، 3 ، 4.} في WEC ، يمكننا مباشرة الهدف المنشود مجالات الاجنة باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاج لأنه لا يمكن التلاعب بها أجنة تحت المجهر. لذلك ، WEC القوارض هو تقنية مفيدة جدا عندما نريد دراسة العمليات التنموية الحيوية للأجنة الثدييات postimplanted. حتى الآن ، وقد تم تطوير عدة أنواع من النظم WEC ^1. من بين هؤلاء ، زجاجة الثقافة المدورة من نوع النظام هو الأكثر شعبية ومناسبة على المدى الطويل ثقافة أجنة في midgestation ، أي بعد وE9.5 E11.5 في الفأر والجرذان ، على التوالي ^1. في هذا البروتوكول الفيديو ، ونظهر بمستوى إجراءاتنا WEC الفئران بعد E12.5 باستخدام نموذج راق في النظام المدورة الأصلي ، الذي صممه كوكروفت جديدة و ^{5 و 6} ، وإدخال مختلف تطبيقات تقنية WEC للدراسات الإنمائية في الثدييات البيولوجيا.

Protocol

1. إعداد نظام WEC

1. مشترك غشاء 0.22 ميكرون تصفية لمدخل أنبوب السيليكون داخل النظام WEC ^أ).
2. فتح صمام اسطوانة الغاز التي تحتوي على O ₂ (95 ٪) وثاني أكسيد الكربون ₂ (5 ٪). تدفق خليط الغاز في طبلة عن طريق زجاجة تحتوي على فقاعات الماء تعقيمها.
3. ضبط حجم تدفق خليط الغاز إلى 50 سم.
4. تضاف إلى ترك أنبوب السيليكون في زجاجة المياه وفحص تدفق خليط الغاز.
5. تدوير أسطوانة بسرعة 20 دورة في الدقيقة / دقيقة.

2. إعداد مستنبت

1. الفئران ذوبان الجليد على الفور ، طرد (IC) في مصل الدم 37.0 درجة مئوية ^ب). إضافة D - غلوكوز (2 ملغ / مل) في المصل مذوبة في الدورق 100 مل تعقيمها. وينبغي إعداد المتوسطة الثقافة على مستوى الثقافة الأساسية (على سبيل المثال ، وذلك باستخدام غطاء محرك السيارة).
2. إضافة مضاد فطري للمضادات الحيوية (100X) السائل إلى المصل مع 1 : 400 التخفيف.
3. تبخير isoflurane المتبقية (بسبب تخدير الفئران خلال جمع الدم) من المصل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ^{(RT) ج).}
4. تعقيم مستنبت باستخدام الغشاء 0.45 ميكرون التصفية.
5. صب 3.0 مل من المتوسط ​​في كل زجاجة الثقافة وختم أعلى كل زجاجة مع المكونات السيليكون ، مع تغطية احباط الالومنيوم (أنظر المرجع 14) ^د).
6. إعداد ثلاثة أو أربعة أطباق بتري تحتوي على التخلص من المياه المالحة Tyrode ^ه).

3. التخدير من الفئران والعزلة الرحم

1. تخدير الفئران الحوامل توقيت - عميقا مع التخدير بالحقن أو الاستنشاق.
2. تنظيف منطقة البطن من الفئران الحوامل في تخدير مع الايثانول 70 ٪.
3. يلتقط الجلد مع ملقط وexteriorize جدار البطن عن طريق قطع الجلد مع ^و مقص ^كبير).
4. التقط جدار البطن مع زوج من الملقط واجري على شكل حرف U شقوق طولية كبيرة على جدار البطن مع مقص كبير يصل إلى مستوى الصدر ^ز).
5. الدب بعيدا الأمعاء إلى الجانب الأيسر مع زوج من الملقط وفضح واحدة من نهاية الرحم متصلة المبيض.
6. التقط نهاية الرحم مع زوج من الملقط وقطع الموقف بين الرحم والمبيض مع مقص كبير.
7. اخراج الرحم من الفئران الحوامل عن طريق خفض الدهون حول الرحم حتى نهاية أخرى من الرحم.
8. نقل الرحم على طبق بتري تحتوي على Tyrode المالحة.
9. الموت ببطء الفأر من قبل إدارة المفرط للمواد التخدير أو خلع عنق الرحم بعد إزالة الرحم.

4. إزالة الأجنة من الرحم

1. شطف لفترة وجيزة في الرحم Tyrode المالحة وتحويلها إلى طبق بيتري الثانية مع زوج من غرامة ملقط ^ح).
2. تحت المجهر مجهر ، والتقاط جدار الرحم مع زوج من غرامة وملقط قطع جدار الرحم في الجانب المعاكس للmesometrium التواصل مع الأوعية الدموية باستخدام مقص العيون على التوالي.
3. إدراج غيض من مقص العيون مباشرة الى المسافة بين جدار الرحم والساقط. قطع جدار الرحم طوليا على طول الجانب antimesometrial.
4. تتجمع في الساقط على الجانب mesometrial conceptuses ومنفصلة عن الرحم باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة ^ط).
5. conceptuses نقل إلى طبق بيتري الثالث برصيد ماصة زجاجية معقمة بقطر مناسب.

5. تشريح للأجنة الفئران

1. إدراج أحد غيض من microforceps في الساقط وإحداث شق عرضي على الساقط حول محصول الحمل مع اثنين من أزواج من الملقط.
2. إدراج نصائح من الملقط في الساقط على الجانب المشيمة وجعل اثنين من الشقوق الطولية على الساقط إلى الأعلى.
3. إزالة الساقط على الجانب المشيمة التي باقتلاع ذلك مع اثنين من أزواج من الملقط. إزالة الساقط المتبقية مع اثنين من أزواج من الملقط.
4. تلتقط غشاء رايخرت ، وجعل شق أفقي على ذلك ، وفصل الغشاء من الحمل المستكن في الجانب المعادي المشيمة.
5. جعل ثقب صغير في كيس المح بالقرب من رأس الجنين مع اثنين من أزواج الملقط ، وقطع كيس المح مع زوج من مقص العيون منحنية. فمن المهم ألا يدمر الاوعية الدموية الرئيسية.
6. التقط السلى في موقع حول الرأس الجنين مع اثنين من أزواج ملقط غرامة ، وبرفق خارج الجنين من كيس المح من قبل تمزيق ^{ح سلى).} ينبغي سحب جسم الجنين من كيس المح لزيادة المعروض من الاوكسجين للجنين في مرحلة midgestation.

6. ثقافة بأكملها الجنين

1. التحقق من الأضرار على المشيمة ، كيس المح ، وحالة الضرب القلب والدورة الدموية.
2. يكون على علم لا تمتد الحبل السري ، ونقلالجنين الى زجاجة الثقافة مع ماصة الزجاج المعقمة. وينبغي أن تحمل أكثر من المياه المالحة Tyrode لزجاجات ثقافة يكون أقل قدر ممكن.
3. إزالة المكونات غير السيليكون من ثقب طبلة المدورة. توصيل زجاجة الثقافة مع المكونات مع وجود ثقب في طبلة المدورة للنظام WEC عموديا. يجب الحرص على عدم وضع القوة على الطبل في اتجاهات غير مناسبة منذ طبل المدورة هي معدات دقيقة للغاية. يتم نقل الزجاجات التي تحتوي على الجنين تشريح للثقافة واحدا تلو الآخر ، وينبغي التقليل من فتح الباب أمام حاضنة لتجنب حرارة الحاضنة وانخفض ^ي).
4. بعد 10 ساعة من الثقافة ، وزيادة حجم تدفق خليط الغاز يصل الى 75 سم وحتى 100 سم مكعب بعد 24 ساعة (الجدول 1).
5. ينبغي تغيير الثقافة المتوسطة نحو 24 ساعة عن طريق نقل الجنين مثقف في زجاجة جديدة مع الثقافة المتوسطة الطازجة. زيادة حجم تدفق ما يصل الى 125 سم مكعب بعد 34 ساعة وحتى 150 سم مكعب بعد 48 ساعة (الجدول 1)
6. الاختيار في بعض الأحيان حالة من أجنة مثقف عن طريق العد معدل ضربات القلب (أي 120-150/min هو الأمثل) ، ومراقبة الدورة الدموية. إذا كان المطلوب حساب عدد somites للحكم على نمو الأجنة في المياه المالحة في Tyrode. في التطور الطبيعي ، وأضيف الجسيدة في ساعتين.
7. عندما يتم الانتهاء من WEC ، ووقف إمدادات الغاز وخليط قطع أنبوب مدخل والغشاء تصفية لتجنب العودة الى تدفق أنبوب مدخل من الزجاجة محتدما.

7. تلاحظ

1. يتم الاحتفاظ باستمرار على درجة الحرارة داخل النظام في WEC 37،0-37،5 درجة مئوية.
2. يستخدم بشكل روتيني 100 ٪ IC المصل في الفئران WEC لدينا أجنة الجرذان والفئران ، والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
3. نحن شراء المصل IC الفئران ، والتي يتم جمعها من الفئران التي تم تخدير مع isoflurane.
4. زجاجات يمكن التخلص منها وتتوفر أيضا من Ikemoto ريكا. يجب تعقيمها الزجاجات والمقابس السيليكون.
5. وينبغي إجراء تشريح للأجنة في RT لأن الحفاظ على الأجنة في درجة حرارة منخفضة أو مرتفعة خلال تشريح تؤثر على التطور اللاحق في WEC.
6. يتم تعقيم الأدوات اللازمة لتشريح بواسطة الحرارة الجافة.
7. يجب أن تقطع الجلد وجدار البطن بشكل منفصل لتجنب التلوث من الشعر في صحن ممكن. نغير مقصا كبيرا وملقط مع زوج جديد من لهم عندما نقطع الجلد وعزل الرحم ، على التوالي.
8. باستخدام الملقط الذي على ما يرام نصائح مهمة جدا لتشريح الأنسجة بالتأكيد. علينا شحذ يدويا نصائح من ملقط بحجر والنفط الآلة.
9. نستخدم جانب واحد من مثل سكين ملقط لتجنب الضغط الزائد على الأجنة.
10. عندما تكون درجة الحرارة داخل النظام WEC النقصان من خلال فتح الباب مرارا وتكرارا ، ما زلنا لتشغيل الضوء للحفاظ على درجة الحرارة داخل النظام.

8. ممثل النتائج

الشكل 1 يبين إجراءات تشريح الجنين الجرذان والفئران مثقف الأجنة.

الشكل 1. الجامع ثقافة الجنين الجنين E12.5 الفئران. (أ) من الحمل المستكن تشريح الرحم من الفئران الحوامل. (ب) إزالة الساقط على الجانب المشيمة. (ج) إزالة غشاء رايخرت. (د) فتح الكيس المحي. (E) وزراعة الأجنة الفئران في زجاجة لمدة 6 ساعة بعد بداية WEC. (F) وجنين فأر تربيتها لمدة 42 ساعة. د ، الساقط ؛ R ؛ غشاء رايخرت ، P ، المشيمة ؛ YS ، الكيس المحي ، البريد ، الجنين.

	0 ساعة	12 ساعة	24 ساعة	36 ساعة	48 ساعة
E12.5 جنين فأر	95 ٪ 50 سم	95 ٪ 75 سم (10 ساعة)	95 ٪ 100 سم مكعب	95 ٪ 125 سم مكعب (34 ساعة)	95 ٪ 150 سم مكعب

الجدول 1. الشرط الأمثل الأوكسجين.

Discussion

هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في WEC القوارض للنجاح. أولا ، ينبغي إجراء تشريح لا تكون دقيقة إلى الأجنة الضرر ، لا سيما الأوعية الدموية. ثانيا ، ينبغي أن يكون الإجراء في أسرع وقت ممكن لأن الاوكسجين والمغذيات لم تعد الموردة عبر المشيمة بعد العزلة من الرحم. هذا أمر بالغ ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	نوع	شركة	رقم كتالوج	تعليق
إعداد WEC
WEC النظام (10-0310)	أداة	Ikemoto ريكا	010-0310	نموذج آخر صغير هو متاح أيضا.
السيليكون المكونات بدون حفرة	أداة	Ikemoto ريكا	010-032-08
اسطوانة الغاز المخلوط	أداة	نيكو Sanso	--	تحتوي على 95 ٪ أكسجين و 5 ٪ من ثاني اكسيد الكربون. عرف النظام.
منظم الغاز	أداة	أونو Seisakusho	WR - 11
0.22 ميكرون تصفية Millex GS	أداة	ميليبور	SLGS033SS
التخدير والعزلة الرحم
مقص كبير	أداة	Napox	B - 7H
ملقط	أداة	Napox	A - 3-2
التخلص طبق بتري (90 ملم × 15 ملم)	أداة	Iwaki	SH90 - 15	العميق من نوع الطبق هو أفضل لتشريح.
Isoflurane	الكاشف	ابوت	B506	للتخدير
بنتوباربيتال الصوديوم	الكاشف	شيرينغ بلاو صحة الحيوان	--	للتخدير
Tyrode في المياه المالحة	الكاشف	--	--	وفقا للبروتوكول كما في المرجع. 2. حفظ في 4 درجات مئوية.
توقيت الحامل ، سبراغ داولي	حيوان	تشارلز ريفرز مختبرات اليابان	--
إعداد مستنبت
ثقافة زجاجة	أداة	Ikemoto ريكا	010-032-05
التخلص من ثقافة زجاجة	أداة	Ikemoto ريكا	010-032-06
السيليكون المكونات مع ثقب	أداة	Ikemoto ريكا	010-032-07
رقائق الالومنيوم	أداة	أي شركة	--
التعقيم الحقيبة	أداة	Hogy	HM - 26	الزجاجات الثقافة
التعقيم الحقيبة	أداة	Hogy	HM - 14A	لسدادات السيليكون
0.45 ميكرون تصفية Millex HA	أداة	ميليبور	SLHA033SS
50 مل أنبوب مخروطي	أداة	بيكتون ديكنسون	352070
100 مل دورق	أداة	Iwaki	TE - 32
IC مصل الجرذان	الكاشف	تشارلز ريفرز مختبرات اليابان	--	الرجوع إلى : السيد كونيهيكو Morisaki ، هاتف : +81- (0) 45-474-9336 ؛ فاكس : +81- (0) 45-474-9340
D (+) - الجلوكوز	الكاشف	واكو	041-00595
المضادات الحيوية السائلة antimyotic	الكاشف	Gibco	15240
تشريح للأجنة
مقص العينية على التوالي	أداة	Napox	MB50 - 7	لقطع جدار الرحم
مقص منحني البصريات	أداة	Napox	MB54 - 2	لقطع الكيس المحي
ملقط # 5	أداة	قوة	T6715
ملقط # 5F	أداة	ريجين	T6819
ماصة الزجاج	أداة	--	--	مصنوعة يدويا باستخدام ماصة باستور.
التعقيم الحقيبة	أداة	Hogy	HM - 4	ماصات للزجاج
مجهر مجهر	أداة	لايكا	Mz7s
ضوء	أداة	لايكا	CLS 150XD
النفط حجر	أداة	أوشيدا يوكو	833-2000	لشحذ ملقط
آلة النفط	أداة	أوشيدا يوكو	835-0000	لشحذ ملقط