Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Özet

Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin verir Ex vivo Midgestation aşamaları ile ilgili sınırlı dönemlerinde durum. Bu video protokolde, E12.5 rotator tip şişe kültür sistemi kullanarak sonra sıçan tüm embriyo kültürü standart prosedürleri göstermektedir.

Özet

Tüm embriyo kültürü (WEC) tekniği, Yeni ve arkadaşları tarafından 1950'li yıllarda geliştirilmiş ve gelişim ^biyolojisi 1 için uygulanan olmuştur . Memeli embriyolarının gelişim ve büyüme plasentanın fonksiyonu üzerine eleştirel bağımlı olmasına rağmen, WEC teknik embriyonik gün (E) 6.5-E12.5 sırasında midgestation aşamalarına karşılık gelen sınırlı dönemlerde kültür fare ve sıçan embriyolar ex vivo durumu sağlar fare veya sıçan ^{2, 3, 4} E8.5-E14.5. Embriyoların mikroskop altında manipüle edilebilir, çünkü WEC, ince cam kapilerleri kullanarak embriyo alanlarda doğrudan istenen hedef yapabilirsiniz. Bu nedenle, biz postimplanted memeli embriyolarının dinamik gelişim süreçlerini incelemek için istediğiniz zaman kemirgen WEC çok yararlı bir tekniktir. Bugüne kadar, çeşitli WEC sistemleri ¹ geliştirilmiştir. Bunların arasında, sırasıyla ^1, fare ve sıçan E9.5 ve E11.5, sonra rotator tip şişe kültür sistemi, en popüler ve en uzun vadeli midgestation, yani embriyoların kültürü için uygundur . Bu video protokolde, Yeni ve Cockroft ^{5, 6} tarafından tasarlanmış orijinal rotator sistemi, zarif bir model kullanılarak E12.5 sonra sıçan WEC standart prosedürler göstermek ve memeli gelişim çalışmaları için WEC tekniğin çeşitli uygulamalarını tanıtmak biyolojisi.

Protokol

1. WEC sistemi kurmak

1. Ortak WEC sistemi içinde giriş silikon tüp filtre 0.22 mikron ^membran).
2. O ₂ (% 95) ve CO ₂ (% 5) içeren bir gaz silindir valfini açın. Otoklava su içeren köpürme şişe ile davul içine gaz karışımı akış.
3. Gaz karışımı akışını hacmi 50 cc ayarlayın.
4. Dışında bir su şişesi içine silikon tüp izin ve gaz karışımı akışını kontrol yerleştirin.
5. 20 dev / dak hızında davul döndürün.

2. Kültür ortamı hazırlanması

1. 37.0 çözülme sıçan hemen santrifüje (IC) serum ° C ^b). Otoklavlanmış 100 ml beher çözülmüş serum içine ekleyin D-glukoz (2 mg / ml). Kültür orta birincil kültür seviyesi (örneğin, bir başlık kullanarak) hazırlanmalıdır.
2. 400 seyreltme: 1 ile serum antibiyotik antimikotik (100X) sıvı ekleyin.
3. Kalan izofluran buharlaşacak (sıçanlarda kan toplama sırasında anestezi nedeniyle), oda sıcaklığında ^{(RT) c)} 20 dakika serum .
4. 0.45 mikron membran filtre kullanılarak kültür ortamı sterilize edin.
5. Her kültürün şişe, orta 3,0 ml dökün ve alüminyum folyo kaplı bir silikon fişi ile her şişe üst, mühür (ref 14) ^d).
6. Tyrode en tuzlu ^e içeren üç ya da dört bertaraf Petri kapları ^{hazırlayın).}

3. Anestezi, rahim sıçan ve izolasyon

1. Parenteral veya inhalasyon anesteziklerin derinden zamanlanmış bir gebe sıçan anestezisi.
2. % 70 etanol ile anestezi gebe sıçan karın bölgesini temizleyin.
3. Forseps ile cilde Pick up ^ve) büyük makasla ^f cilt keserek karın duvarı exteriorize.
4. Forseps bir çift ile karın duvarı Pick ^up) torasik düzeyde ^g büyük makas ile karın duvarı U-şekilli büyük uzunlamasına insizyonlar makyaj.
5. Forseps bir çift ile sol tarafına uzak Bear bağırsak ve rahim, yumurtalık bağlı bir ucunu göstermek.
6. Forseps bir çift rahim sonuna Pick up ve büyük makas ile rahim ve yumurtalık arasındaki konumunu kesmek.
7. Gebe sıçan rahim, rahim diğer sonuna kadar rahim çevresindeki yağ keserek çıkartın.
8. Tyrode Kullanıcı tuzlu su içeren Petri rahim aktarın.
9. Rahim çıkardıktan sonra anesteziklerin aşırı idaresi veya servikal dislokasyon sıçan Euthanize.

4. Embriyolar rahim çıkarılması

1. Kısaca yıkayın ve Tyrode Kullanıcı salin ^rahim), ince ^forseps h bir çift ile ikinci Petri kabı transfer .
2. Binoküler mikroskop altında, ince forseps bir çift rahim duvarına pick up ve oftalmik düz makas kullanarak kan damarları ile bağlantı mesometrium karşı tarafında rahim duvarına kesmek.
3. Rahim duvarı ve desidua arasında uzaya oftalmik düz makas ucu takın. Rahim duvarına boydan boya antimesometrial kenarı boyunca kesin.
4. Mesometrial tarafında desidua ve ince forseps ⁱ⁾ iki çift rahim ayrı conceptuses tutam.
5. Uygun bir çapa sahip bir steril cam pipet ile üçüncü Petri kabı conceptuses aktarın.

5. Rat embriyoları diseksiyonu

1. Desidua microforceps bir ucu takın ve iki çift forseps ile konseptus etrafında desidua enine bir kesi yapmak.
2. Plasenta tarafında desidua forseps ipuçları takın ve üst için desidua iki uzunlamasına insizyonlar yapmak.
3. Bu iki çift forseps ile ripping tarafından plasenta tarafında desidua çıkarın. Iki çift forseps ile kalan desidua çıkarın.
4. Reichert membranı Alış üzerinde yatay bir kesi yapmak ve anti-plasenta tarafında konseptus membran ayrı.
5. Forseps iki çifti ile yolk kesesi embriyo kafa yakın küçük bir delik açın ve oftalmik kavisli makas bir çift ile yolk sac kesme. Büyük kan damarlarının zarar vermemek için çok önemlidir.
6. Embriyo başının etrafında yerinde iki çift ince forseps amniyon Pick up ve ^{hafifçe), amniyon} h yırtılma yolk kesesi embriyo çekin . Embriyonun vücut midgestation aşamada embriyo için oksijen kaynağı artırmak için yumurta sarısı kesesi dışarı çekilmelidir.

6. Tüm embriyo kültürü

1. Plasenta, yolk kesesi, kalp dayak ve kan dolaşımı durumu zararlar kontrol edin.
2. Göbek kordonu uzanan farkında olmak, transfer, steril bir cam pipet ile bir kültür şişe embriyo. Tyrode Kullanıcı tuzlu su kültürü şişeleri üzerinde taşır, mümkün olduğunca az olmalıdır.
3. Rotator davul delik olmayan bir silikon fişini çıkartın. WEC sistemi rotator davul dik bir deliği olan bir eklenti ile kültür şişe bağlayın. Rotator davul çok ince bir ekipman olduğundan olumsuz yönde davul tarihinde yürürlüğe koymak için dikkatli olun. Disseke embriyo içeren şişeler tek kültür tek aktarılır; kuluçka ön kapının ^açılması) kuluçka sıcaklığı önlemek için ^j azalma minimize edilmelidir.
4. Kültür 10 saat sonra, 24 saat sonra (Tablo 1) gaz karışımı akış hacmi 75 cc ve 100 cc kadar varan artış.
5. Kültür ortamı, yeni bir kültür ortamı ile taze hazırlanmış şişeye kültürlü embriyo transfer ederek 24 saat etrafında değiştirilmesi gerekir. 34 saat sonra 125 cc akış hacmini artırmak ve 48 saat sonra 150 cc (Tablo 1)
6. Bazen, kalp atışı hızı (yani, 120-150/min optimum) sayarak ve kan dolaşımını gözlemleyerek kültürlü embriyoların durumunu kontrol edin. Gerekirse Tyrode Kullanıcı salin embriyoların büyüme yargılamak için Somitlerin sayısını. Normal bir gelişme olarak, bir iki saat hücre gruplarının eklenir.
7. WEC bittiğinde, gaz karışımı kaynağı durdurmak ve giriş borusu ve köpürme şişe giriş tüpe geri akışı önlemek için filtre membran kesmek.

7. Notlar

1. WEC sistem içinde sıcaklığı sürekli 37,0-37,5 ° C tutulur
2. Sıçan ve fare embriyoları WEC% 100 sıçan IC serum rutin olarak kullanılan ve kullanımdan önce -20 ° C'de muhafaza edilir.
3. Biz sıçan IC serum, izofluran anestezisi sıçan toplanan satın alın.
4. Tek kullanımlık şişe Ikemoto Rika da mevcuttur. Şişeler ve silikon fişler otoklava olmalıdır.
5. Diseksiyon sırasında embriyoların düşük ya da yüksek ısıda muhafaza WEC sonraki gelişimini etkileyebilir, çünkü embriyo Diseksiyon RT yapılmalıdır.
6. Diseksiyon için Araçlar kuru ısı ile sterilize edilir.
7. Deri ve karın duvarı, mümkün olduğunca bir çanak içine kılların bulaşmayı önlemek için ayrı ayrı kesilmesi gerekir. Biz deri kestiğiniz zaman onlara yeni bir çift ile bir çift büyük makas ve forseps değiştirmek ve sırasıyla rahim izole.
8. Ipuçları ince forseps kullanılması kesinlikle dokuları incelemek için çok önemlidir. Biz bir taş ve makine yağı ile elle forseps ipuçları keskinleştirmek.
9. Biz embriyoların aşırı basıncı önlemek için forseps bir tarafında bir bıçak gibi kullanın.
10. WEC sistemi içindeki sıcaklık, tekrar tekrar kapıyı açarak düştüğünde, ışığı açmak için sistem içinde sıcaklıkta tutmaya devam ediyor.

8. Temsilcisi sonuçları

Şekil 1, rat embriyo ve kültürlü sıçan embriyolar diseksiyon prosedürleri gösterir.

Şekil 1 E12.5 rat embriyo Tüm embriyo kültürü. (A) konseptus gebe sıçan rahim disseke. (B) plasenta tarafında desidua kaldırılması. Reichert membranı (C) Kaldırma. (D) yolk kesesi açılması. (E) WEC başından sonra 6 saat süreyle şişe rat embriyo kültür. (F) sıçan 42 saat için embriyo kültür. d desidua; R Reichert Kullanıcı membran, p, plasenta, ys, yolk kesesi, e, embriyo.

	0 saat	12 saat	24 saat	36 saat	48 saat
E12.5 rat embriyo	% 95, 50 cc	95% 75 cc (10 saat)	% 95 100 cc	% 95 125 cc (34 saat)	% 95 150 cc

Tablo 1. Optimal oksijen durumu.

Tartışmalar

Kemirgen WEC başarısı için iki önemli adım vardır. İlk olarak, diseksiyon prosedür değil zarar embriyolar, özellikle kan damarları doğru olmalıdır. İkincisi, oksijen ve besin artık rahim izolasyon sonra plasenta yoluyla sağlanan çünkü prosedürü mümkün olduğunca çabuk olmalıdır. Bu büyük embriyoları için kritik öneme sahiptir. E12.5 sonra sıçan WEC durumda, biz 30 dakika içinde disseke embriyoların kültürü şişeleri içine aktarmanız gerekir.

Biz, h?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Tip	Şirket	Katalog Numarası	Yorum
WEC ayarlama
WEC sistemi (10-0310)	Araç	Ikemoto Rika	010-0310	Başka bir küçük modeli de mevcuttur.
Deliksiz Silikon fişi	Araç	Ikemoto Rika	010-032-08
Gaz karışımı silindir	Araç	Nikko Sanso	-	% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit içeren. Özel sipariş edin.
Gaz regülatör	Araç	Ono Seisakusho	WR-11
0.22 mikron filtre Millex GS	Araç	Millipore	SLGS033SS
Anestezi ve rahim izolasyonu
Büyük makas	Araç	Napox	B-7H
Forseps	Araç	Napox	A-3-2
Bertaraf Petri kabı (90 mm x 15 mm)	Araç	Iwaki	SH90-15	Derin tipi bulaşık diseksiyon için iyi.
İsofluranın	Reaktif	Abbott	B506	Anestezi için
Pentobarbital sodyum	Reaktif	Schering-Plough Hayvan Sağlığı	-	Anestezi için
Tyrode en tuzlu	Reaktif	-	-	Ref protokole göre. 2. 4 Kaydet ° C
Zamanlı gebe Sprague-Dawley sıçan	Hayvan	Charles Rivers Laboratuvarlar Japonya	-
Kültür ortamı hazırlanması
Kültür cam şişe	Araç	Ikemoto Rika	010-032-05
Bertaraf kültür şişesi	Araç	Ikemoto Rika	010-032-06
Silikon fiş ile delik	Araç	Ikemoto Rika	010-032-07
Alüminyum folyo	Araç	Herhangi bir şirket	-
Otoklav torbası	Araç	Hogy	HM-26	Kültürü şişeleri için
Otoklav torbası	Araç	Hogy	HM-14A	Silikon fişler
0.45 mikron filtre Millex HA	Araç	Millipore	SLHA033SS
50 ml konik tüp	Araç	Becton Dickinson	352070
100 ml beher	Araç	Iwaki	TE-32
Rat IC Serum	Reaktif	Charles Rivers Laboratuvarlar Japonya	-	Bakın: Sayın Kunihiko Morisaki TEL: +81- (0) 45-474-9336 Faks: +81- (0) 45-474-9340
D-Glukoz (+)	Reaktif	Wako	041-00595
Antibiyotik-antimyotic sıvı	Reaktif	Gibco	15240
Embriyoların diseksiyonu
Oftalmik düz makas	Araç	Napox	MB50-7	Rahim duvarına kesim için
Oftalmik kavisli makas	Araç	Napox	MB54-2	Yolk sac kesim için
Forseps # 5	Araç	Dinçlik	T6715
Forseps # 5F	Araç	Regine	T6819
Cam pipet	Araç	-	-	Pasteur pipeti kullanarak el ile yapılmıştır.
Otoklav torbası	Araç	Hogy	HM-4	Cam pipetler
Binoküler mikroskop	Araç	Leica	Mz7s
Işık	Araç	Leica	CLS 150XD
Petrol taş	Araç	Uchida Yoko	833-2000	Forseps keskinleşmesi için
Makine yağı	Araç	Uchida Yoko	835-0000	Forseps keskinleşmesi için