تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان

Summary

مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة هو فحص في المختبر الذي الأسلاف لدم شكل مستعمرات في وسط شبه صلبة. وتستخدم مجموعة من التشكل مستعمرة ، مورفولوجيا الخلايا ، والتدفق الخلوي لتقييم قدرة الأسلاف لتتكاثر والتفريق على طول الأنساب مختلفة للدم.

Abstract

وعادة ما يتم الحصول على الإنسان الجذعية المكونة للدم / السلف الخلايا من نخاع العظام ، دم الحبل السري ، أو الدم المحيطي وتستخدم لدراسة وleukemogenesis تكون الدم. لديهم القدرة على التمايز إلى الأنساب اللمفاوية والدم النخاعي. يستخدم مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة لدراسة انتشار والتفريق بين نمط الأسلاف للدم من خلال قدرتها على شكل مستعمرات في المتوسط ​​نصف صلبة. عدد والتشكل في المستعمرات التي تشكلها على عدد ثابت من الخلايا الإدخال توفير المعلومات الأولية حول قدرة الأسلاف للتمييز وتتكاثر. يمكن حصاده من مستعمرات الخلايا الفردية أو من لوحة كاملة لمواصلة تقييم أعدادهم والدول تمايز باستخدام التدفق الخلوي والتقييم من مورفولوجية بالغيمزا الملطخة الشرائح. هذا الاختبار هو مفيد لتقييم التمايز النخاعي اللمفاوية ولكن لا. يستخدم مصطلح النخاعي في هذا السياق بمفهومها الواسع ليشمل الأنساب المحببات ، الوحيدات ، محمر ، والنواءات.

وقد استخدمنا هذا الاختبار لتقييم آثار المسرطنة على تمايز الخلايا الأولية + CD34 الإنسان المستمدة من الدم المحيطي. لهذا الغرض هي الخلايا transduced مع بناء التحكم إما فيروسات أو بناء التعبير عن الجين الورمي من الفائدة ، في هذه الحالة ، NUP98 HOXA9. نحن نوظف متجه استخداما فيروسات ، MSCV - IRES - GFP ، أن يعبر عن مرنا bicistronic الجينات التي تنتج من الاهتمام وعلامة GFP. هي خلايا ما قبل تفعيلها من خلال تزايد في وجود السيتوكينات لمدة يومين قبل تنبيغ فيروسات. بعد يومين آخرين ، يتم عزل الخلايا GFP + الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) ومختلطة مع methylcellulose المتوسطة التي تحتوي على نصف صلبة تستكمل مع السيتوكينات وحضنت المستعمرات حتى تظهر على السطح ، وعادة 14 يوما. يتم توثيق عدد والتشكل من المستعمرات. ثم تتم إزالة الخلايا من لوحات ، وغسلها ، عدها ، وتعرض للفحص التدفق الخلوي والمورفولوجية. التدفق الخلوي مع الاجسام المضادة المحددة لعلامات سطح الخلية التي أعرب عنها أثناء تكون الدم يوفر معلومات حول نسب ومرحلة النضج. الدراسات المورفولوجية الخلايا الفردية تحت المجهر بعد رايت تلوين غيمزا تقديم مزيد من المعلومات فيما يتعلق الانساب والنضج. transduced مقارنة مع خلايا مكافحة ناقلات الفارغة لتلك transduced مع الجين الورمي يكشف عن الآثار المترتبة على الجين الورمي على تمايز للدم.

Protocol

1. إعداد الكواشف

1. إعداد الحلول العقيمة الأسهم 1000x من وزراء الخارجية ذات الصلة كيناز التيروزين 3 (FLT - 3) يجند ، محببة / بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM - CSF) ، الخلية الجذعية عامل (SCF) ، ثرومبوبويتين (TPO) ، انترلوكين (IL) -3 وIL - 6 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحضير محلول معقم الأسهم Retronectin (1mg/ml) أيضا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تقسيم هذه الحلول في aliquots الأسهم الصغيرة والاحتفاظ في -20 درجة مئوية لتفادي تكرار تجميد ذوبان الجليد.
2. إعداد FBS 2 ٪ في IMDM.
3. إعداد الكامل المتوسطة IMDM بتركيزات النهائي FBS 20 ٪ ، 2 الجلوتامين مم ، 100 وحدة / مل البنسلين / الستبرتوميسين (PS). إضافة السيتوكينات التالية فقط قبل الاستخدام : 100 نانوغرام / مل FLT - 3 يجند ، 20 نانوغرام / مل GM - CSF ، و 100 نانوغرام / مل SCF ، 100 نانوغرام / مل TPO ، 50 نانوغرام / مل IL - 3 ، و 100 نانوغرام / مل IL - 6.
4. إعداد جيش صرب البوسنة 1 ٪ في HBSS (كاليفورنيا والمغنيسيوم الحرة ، دون أحمر الفينول) و 2 ٪ في جيش صرب البوسنة D - PBS (الكالسيوم والمغنيسيوم الحرة). تعقيم الحلول التي تمر عبر مرشحات 0.22 ميكرون حقنة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
5. إعداد EDTA 0.02 ٪ في HBSS وتخزينها في 4 درجات مئوية.
6. إعداد غلفاني - pseudotyped الارتجاعي ترميز الحمض النووي لمصلحة وتخزينها في aliquots في -80 درجة مئوية. هذا الإجراء هو خارج نطاق هذه المقالة ، ولكن يوصف في مكان آخر (1-3).

لتلوين غيمزا

7. قبل استخدام تصفية الحل رايت / بالغيمزا صمة مرتين من خلال ورقات 1 ميكرون تصفية في زجاجة نظيفة.
8. على الفور قبل استخدامه ، وإعداد رايت / بالغيمزا العازلة درجة الحموضة 6.4 ، عن طريق خلط 50 مل من محلول رايت / بالغيمزا تصفية وصمة عار و 200 مل من محلول العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.4 -- جيوردانو الصيغة.
9. إعداد الفوسفات حل العازلة ، 6.0 درجة الحموضة عن طريق إذابة 27.3 غرام من KH ₂ ص ₄ و 4.62 غرام من نا ₂ هبو ₄ في 3.5 O. ₂ LH
10. تحضير الميثانول بنسبة 50 ٪ في H ₂ O.

2. PROCEDURE

وقبل ذوبان تنشيط الخلايا CD34 +

1. أذاب قارورة من الخلايا المجمدة + CD34 بسرعة عند 37 درجة مئوية بحلول يهز بلطف حتى يتم ترك الماضي الكريستال الجليد الصغيرة ونقل التعليق الخلية (1 مل) إلى أنبوب مخروطي 50 مل. الشطف بلطف الخلايا المتبقية من القارورة مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة 2 ٪ FBS / IMDM وإضافته إلى أنبوب 50 مل قطرة الحكيم بينما يحوم بلطف. الانتظار لمدة 3 دقائق. المقبل ، إضافة ببطء 2 مل من 2 ٪ FBS / IMDM ، في حين أن الاختلاط بلطف ، والانتظار لمدة 3 دقائق. كرر الإجراء بإضافة 2 ٪ FBS / IMDM هذا هو نفس حجم الخلية تعليق المخفف على فترات 3 دقائق ، في دوامات بلطف بين الإضافات ، حتى تصل إلى الحجم النهائي 32 مل.
2. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة طاف تاركين وراءهم نحو 0.5 مل.
3. غسل بيليه من خلال تعليق في 20 FBS 2 ٪ مل / IMDM والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. إزالة طاف ووقف الخلايا في المتوسط ​​IMDM الكامل في حوالي 0.5 X ⁶ 10 الخلايا / مل. يستغرق 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى المزيج ، microtube مع نفس الحجم من محلول أزرق التريبان (0.4 ٪) وباستخدام عدد عدادة الكريات.
5. تمييع الخلايا إلى خلايا ،1-،15 ⁶ X 10 / مل بإضافة كاملة المتوسطة IMDM تستكمل مع السيتوكينات (انظر 1.3)
6. ثقافة الخلايا في الحاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO ₂ ل 2 يوما.

فيروسات تنبيغ بواسطة فيروس قبل التحميل

7. يوم تنبيغ ، عد خلايا الفيروس قبل بدء تحميلها مسبقا لتحديد عدد الآبار التي سيتم إعدادها.
8. تمييع الحل Retronectin الأسهم إلى 25 ميكروغرام / مل و 400 إضافة إلى كل ميكرولتر جيدا لمدة 24 غير المعالجة بشكل جيد نسيج لوحة الثقافة. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في مجال السلامة الأحيائية هود الصفحي التدفق إلى معطف المسبق.
9. إزالة الحل Retronectin وإضافة 400 ميكرولتر من 2 ٪ في جيش صرب البوسنة D - PBS إلى كل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
10. تحسن الأسهم حلول الفيروس والحفاظ على الجليد. إزالة حل جيش صرب البوسنة ، إضافة 0.5 مل من إعداد الفيروس الى كل جيدا ، والطرد المركزي في XG 2200 عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
11. إزالة الفيروس من حل الآبار وكرر تحميل الفيروس وصفها في ثلاث مرات 2.10.
12. شطف جيدا مع كل الباردة HBSS مل 0.5 (+ الكالسيوم والمغنيسيوم) أو IMDM.
13. جمع قبل تنشيط خلايا + CD34 بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
14. Resuspend الخلايا في الخلايا ،1-،15 س ⁶ 10 بنسبة 1.5 مل في المتوسط ​​IMDM كاملة مع السيتوكينات.
15. إضافة 1.5 مل تعليق على كل خلية بشكل جيد واحتضان في حاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO ₂ ل 2 يوما.

transduced الفرز وجمع خلية من الخلايا

16. ولكن بلطف تعليق بدقة الخلايا في أعلى لوحة فيروس محملةق والتصفية من خلال تصفية 50 ميكرومتر CellTrics الخلية في أنبوب مخروطي الشكل. يستغرق 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى المزيج ، microtube مع حجم مساو من محلول أزرق التريبان والعد باستخدام عدادة الكريات. شطف جيدا مع كل 0.8 مل من EDTA 0.02 ٪ الباردة / HBSS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول) وإضافة إلى أنبوب جمع نفسه من خلال تصفية 50 ميكرومتر CellTrics الخلية.
17. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية ، ويغسل مع بيليه HBSS الباردة (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول) عن طريق الطرد المركزي في 200 XG لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
18. Resuspend الكرية 1 ٪ في جيش صرب البوسنة / HBSS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول) إلى تركيز 15 X 10 مل / ⁶ أو حد أدنى لحجم 0.250 مل لفرز الخلايا. تبقي الخلايا على الجليد في الظلام. يعد أنبوب الباردة التي تحتوي على 20 ٪ FBS / IMDM / الجلوتامين / PS المتوسطة لجمع الخلايا التي تم فرزها. يتم إجراء الفرز في سرعة عالية كور فارز خلية من ألفين J. Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب باستخدام عالية السرعة MoFlo فارز (داكو ، جلوستروب ، الدانمارك).

CFC مقايسة

19. ذوبان الجليد على العدد المطلوب من 3 مل من وسائل الاعلام aliquots مقايسة CFC. دوامة بقوة لخلط والسماح للأنابيب الوقوف على الأقل 5 دقائق لتدع أي فقاعات الحالية لتطفو على السطح قبل إضافة الخلايا.
20. للحصول على تركيز كل عينة الخلية لفرز وتقسيم عدد الخلايا التي يقدمها مرفق الفرز حسب حجم الخلية تعليق تقريبية. تأخذ الفيروسات transduced 3000 ، فرز الخلايا في microtube العقيمة التي تحتوي على 2 ٪ الباردة FBS / IMDM. قبل ضبط مستوى 2 ٪ FBS / IMDM ذلك أن حجم التعليق النهائي سيكون ما يقرب من 0.3 مل.
21. تعليق الخلايا ونقل كامل الخلية 0.3 مل تعليق على قسامة 3 مل من GF Methocult + H4435 ، الذي يتألف من methylcellulose 1 ٪ ، 30 ٪ FBS ، BSA 1 ٪ ، 10 ^-4 M - 2 المركابتويثانول ، 2 مم L - الجلوتامين ، 50 نانوغرام / مل SCF ، 20 نانوغرام / مل GM - CSF 20 نانوغرام / مل IL - 3 و 20 نانوغرام / مل IL - 6 و 20 نانوغرام / مل G - CSF ، و 3 وحدة / مل في إرثروبويتين IMDM. ، الإنسان Methylcellulose اليورانيوم وسائل الإعلام (R & D الأنظمة) التي تتكون من methylcellulose 1.3 ٪ ، FBS 25 ٪ ، 1 ٪ BSA ، 5 × 10 ^-5 م 2 - المركابتويثانول ، 2 مم L - الجلوتامين ، و 50 نانوغرام / مل SCF ، 20 نانوغرام / مل GM - CSF ، و 20 نانوغرام / مل IL - 3 و 20 نانوغرام / مل IL - 6 ، يمكن أن يكون 20 نانوغرام / مل G - CSF ، والوحدات 3 / إرثروبويتين مل في IMDM تستخدم أيضا.
22. دوامة بقوة لجعل الخليط تماما صعود وسقوط 3-4 مرات. ترك الأنبوب لا تزال قائمة لمدة 3 دقائق.
23. إرفاق قياس 16 حادة في نهاية الإبرة إلى حقنة 3 مل ورسم بنسبة 2.2 مل. لا تضع فقاعات كبيرة ؛ طردهم في بداية طريق دفع بها بضع مرات. طرد 1.1 مل كل منهما 30 في صحن غير المعالجة ملم وانتشرت الخليط بالتساوي من قبل الدورية.
24. مكان مكررة لوحات في لوحة 100 ملم مع طبق الماء الذي يحتوي على 3 مل من الماء المعقم. الثقافة لمدة 14 -- 17 يوم.
25. توصيف ويسجل وفقا للمستعمرات التشكل مع مجهر مقلوب في التكبير 40X في صحن الثقافة ملحوظ مع شبكة التهديف. لأغراض الفحص لدينا ، وتصنف مستعمرات في 3 فئات : نقية محمر ، حيدي ، ومختلطة. انظر تعليمات الشركة الصانعة لsubclassification مستعمرة أخرى.
26. قد يكون تفحص فحص كامل لوحة CFC بدون تكبير استخدام الماسح الضوئي المنتظم في 600 نقطة في البوصة ، والطاقة المنخفضة (40X) يمكن أن تؤخذ photomicrographs المستعمرات باستخدام مجهر مقلوب مزودة بكاميرا ملونة.
27. لمزيد من التحليل للتمايز والانتشار ، ويتم استردادها من الخلايا لوحة CFC فحص كامل من خلال تعليق في عدة مجلدات من درجة حرارة الغرفة 2 ٪ FBS / IMDM. بعد الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية ، ومعلق الخلايا في 2 ٪ FBS / IMDM ، عدها ، وإما مع الأضداد الملون لالتدفق الخلوي أو نقلها إلى الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي لتلطيخ Cytospin بالغيمزا.

تلوين الأجسام المضادة والتدفق الخلوي

28. خلايا جهاز الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية في البرد وresuspend 50 ٪ مصل الفأر العادي في HBSS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية دون الحمراء الفينول).
29. مكان ما يقرب من 5 × 10 ⁵ خلايا في 80 ميكرولتر في أنبوب (12 X 75 مم الجولة القاع أنابيب) والحفاظ على الجليد. إضافة مزيج الأجسام المضادة (حوالي 20 ميكرولتر خليط أو سلبية حل لمراقبة أي ضوابط الضد) ومزيج من خلال استغلال طفيفة الأنابيب. إعداد أنابيب تحكم المعايرة مع عدم وجود أجسام مضادة أو مع الأضداد المضادة للCD45 لكل ملون تألقي. أنابيب مكان على الجليد في الظلام ، واحتضان لمدة 20 دقيقة. مزيج من خلال استغلال أنابيب طفيفة بعد 10 دقيقة الأولى. بعد دقائق و 20 حضانة ، وملء أنابيب مع HBSS الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية. Resuspend الكرية في البرد بارافورمالدهيد 0.5 ٪ / HBSS.
    وعادة ما تستخدم في المخاليط التالية من الأجسام المضادة لتحليلنا. للتمايز النخاعي : CD11b (فيكوإيريترين - مترافق استنساخ ICRF44) / CD33 (allophycocyanin - مترافق استنساخ WM53) / CD45 (فيكوإيريترين - Cy7 - congjugated استنساخ HI30). محمر للتمايز : CD71 (فيكوإيريترين - M - مترافق استنساخ A712) / CD235a (allophycocyanin - مترافق استنساخ GA - R2) / CD45 (فيكوإيريترين - Cy7 - congjugated استنساخ HI30).
30. يتم تنفيذ التدفق الخلوي في صميم سرعة عالية فارز خلية من ألفين J. Siteman مركز السرطان في جامعة واشنطن في كلية الطب على تدفق عداد الكريات FACScan بالترقية إلى 5 ألوان واثنين من الليزر دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، وتحليلها باستخدام CellQuest دينار بحريني (العلوم البيولوجية) أو FlowJO v7.2.4 (شجرة نجمة ، وشركة ، آشلاند ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبرمجيات.

تلوين غيمزا

31. ووصف ما يقرب من 30000 الخلايا المستخرجة من لوحات مقايسة CFC أعلاه هي معلقة في 0.3 مل 2 ٪ FBS / IMDM ونقل إلى إحدى الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة Cytospin لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
32. إعداد السفن التي تحتوي على تلطيخ nine الحلول في الترتيب التالي.
    1. المطلقة الميثانول
    2. رايت / بالغيمزا الأسهم الحل
    3. رايت / بالغيمزا العازلة ، ودرجة الحموضة 6.4
    4. 50 ٪ ميثانول في H ₂ O
    5. H ₂ O
    6. H ₂ O
    7. العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.0
    8. H ₂ O
    9. H ₂ O
33. الشرائح في مكان حاملة الشريحة وتراجع في الميثانول المطلقة (# 1) لمدة 2 دقيقة وصمة عار قبالة الميثانول الزائدة.
34. على الفور ، وتراجع الناقل الشريحة في حل الأسهم رايت / بالغيمزا (# 2) لمدة 5 دقائق.
35. نقل الناقل الى رايت / بالغيمزا العازلة ، ودرجة الحموضة 6.4 (# 3) ، واحتضان لمدة 10 دقيقة.
36. تراجع الناقل مرتين في الميثانول بنسبة 50 ٪ (# 4) ، و 10 مرات في H ₂ O (# 5) ، وآخر مرة في 10 H ₂ O (# 6) ، ومن ثم 5 مرات في العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 6.0 (# 7) .
37. نقل الناقل في H ₂ O (# 8) ، واحتضان لمدة 2 دقيقة. تكرار الغسيل في H ₂ O (رقم 9).
38. السماح للشرائح في الهواء الجاف تماما في الناقل. إزالة كل شريحة ويمسح الجزء الخلفي من الشريحة مع الميثانول غارقة Kimwipes لإزالة البقع. وضع قطرة من Cytoseal 60 والزجاج غطاء لالختم.
39. يتم تنفيذ عدد الفرق 500 خلية لكل شريحة بالغيمزا الملطخة باستخدام المجهر BX51 أوليمبوس. وتنقسم الخلايا في خمس فئات هي : خلايا بدائية تشمل التفجيرات وpromyelocytes ؛ خلايا الدم النخاعي والمتوسطة وتشمل myelocytes metamyelocytes ؛ خلايا الدم النخاعي ناضجة تشمل العصابات ، العدلات مجزأة ، وحيدات ، والضامة ؛ المتوسطة وتشمل الخلايا خلايا محمر مع hemoglobinization المتوسطة ، وتشمل خلايا ناضجة محمر الخلايا مع hemoglobinization الكامل. تؤخذ Photomicrographs مع كاميرا اوليمبوس DP71 مع هدف النفط 60x.

3.0) نتائج ممثلة :

1. CFC مقايسة : بعض مدخلات السكان الخلية سوف تتكاثر ، والتفريق ، والمستعمرات على شكل شبه صلبة متوسطة خلال فترة الحضانة 14-17 يوما. في هذه التجربة ، فإنه من الواضح أن التعبير عن الجين الورمي NUP98 - HOXA9 تسببت في تشكيل حمراء بارزة (محمر المستعمرات) (الشكل 1) (3).
2. يلطخ الأضداد والتدفق الخلوي : immunophenotyping تدفق cytometric من الخلايا التي تم جمعها من لوحات مقايسة CFC يوفر معلومات عن حالة التمايز من السكان الخلية. بواسطة الاستخدام المشترك للأجسام مضادة ضد بعض علامات التمايز ، يمكن تقييم نسب ودرجة نضوج الخلايا. في هذه الحالة كان يستخدم لتحديد الخلايا CD235a محمر. تسبب NUP98 - HOXA9 كما هو مبين في الشكل 2A ، بزيادة في نسبة الخلايا CD235a محمر + ، لكنه قلل من سطوع CD235a التعبير عن هذه الخلايا بالمقارنة مع الضوابط ، مشيرا إلى كبح نضوج محمر. 2B في الشكل ، يتم تحديد خلايا الدم النخاعي بحكم بالفيروس CD33 بهم. تسبب NUP98 - HOXA9 انخفاضا في عدد الخلايا + CD33 ، مع انخفاض في درجة وضوح التعبير CD11b ، بما يتفق مع كبح نضوج النخاعي (3). وبالتالي على النتائج التي تظهر التدفق الخلوي NUP98 - HOXA9 تسبب في تضخم محمر مع كبح نضوج كلا النخاعي ومحمر.
3. تلوين غيمزا : دراسة مورفولوجية من الخلايا التي تم جمعها من لوحات مقايسة CFC معلومات عن الانساب ودرجة النضج من السكان الخلية. قد تم الحصول عليها شكليا الاستنتاجات تختلف عن تلك التي حصلنا عليها من الدراسات تدفق cytometric ، وبالتالي هذه الأساليب هي مكملة لبعضها البعض (3). يتم تكرار التجربة على الأقل 3 مرات ، وفي كل مرة يتم تنفيذ عدد الفرق 500 خلية للتمييز 5 فئات من الخلايا كما هو موضح أعلاه. وأوضح الأمثلة على هذه الخلايا في الشكل 3. يتم جدولتها على النتائج وتحليلها من أجل تحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين الجين الورمي - transduced عينة ومراقبة. في هذه الحالة ، أظهرت النتائج أن NUP98 - HOXA9 تسبب زيادة إجمالية في عددليالي من الخلايا ، مع تضخم محمر وتثبيط كل من محمر ونضوج النخاعي (3) (لا تظهر).

الشكل LEGENDS

الشكل 1 : آثار HOXA9 - NUP98 على التشكل CFC الإنسان.
وretrovirally الأولية الإنسان CD34 + الخلايا transduced إما مع سيطرة MSCV - IRES - GFP ناقلات أو ناقلات معربا عن NUP98 - HOXA9 ، وكان فرز الخلايا بالفيروس GFP. وكانت المصنفة الف الخلايا في كل من لوحين مكررة للمقايسة CFC وتكررت التجربة 3 4 مرات مستقلة. وتظهر لوحات تمثيلية بدون تكبير (يسار) وphotomicrographs منخفضة الطاقة من المستعمرات محمر ممثل (الحق) (3).

الشكل 2 : يبين التدفق الخلوي الابتدائي تعطيل CD34 + تمايز الخلايا البشرية التي HOXA9 - NUP98.
(أ) التدفق الخلوي للتمايز محمر : تم حصادها من لوحات خلايا CFC (انظر الشكل 1) والأجسام المضادة لملطخة CD45 وCD235a. وكان CD235a + تآمر على بوابة (اللوحة اليمنى) الرسم البياني لإظهار التعبير عن CD235a النسبي للخلايا التحكم (B) للتمايز الخلوي تدفق الدم النخاعي : تم حصادها من لوحات خلايا CFC وملطخة CD45 CD33 و. وكان CD33 + تآمر على بوابة الرسم البياني لإظهار التعبير CD11b مقارنة للتحكم (اللوحة اليمنى). وتظهر النسب المئوية للخلايا التي تدخل كل باب (3).

الشكل 3 : مورفولوجيا الخلايا اضطراب يظهر التمايز التي HOXA9 - NUP98 مقارنة مكافحة النواقل.
وأعدت لوحات من مسحات Cytospin CFC وملطخة بالغيمزا. وقد اتخذت Photomicrographs من الحقول مع ممثل هدفا النفط 60x. باء : الانفجار ؛ MM : النخاعي ناضجة ، IM : الوسيطة النخاعي ، ME : محمر ناضجة ، أي : وسيطة محمر (3).

Discussion

وقد استخدم على نطاق واسع CFC مقايسة لتحديد أنماط انتشار والتفريق بين الأسلاف والمكونة للدم لدراسة آثار المسرطنة (4 ، 5). لها ميزة على الثقافات السائل من كونه مقايسة نسيلي ، ان هذه المستعمرات تمثل سلالة من سلف واحد ويمكن إزالتها بشكل فردي لمزيد من التحليل. الحد من مقايسة C...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IMDM	Life Technologies	12440
FBS	Stem Cell Technologies	06150
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin/Streptomycin (PS)	Life Technologies	15140
FLT-3 ligand	PeproTech Inc	300-19
GM-CSF	PeproTech Inc	300-03
SCF	PeproTech Inc	300-07
TPO	PeproTech Inc	300-18
IL3	PeproTech Inc	200-03
IL6	PeproTech Inc	200-06
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
EDTA	Fisher Scientific	BP118
Retronectin	Takara Bio Inc	T100A
HBSS	Life Technologies	14175
PBS	Life Technologies	14200
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Methocult GF+ H4435	Stem Cell Technologies	04445
Human Methylcellulose Enriched Media	R&D Systems	HSC005
Wright/ Giemsa stain	Harleco	64571
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula	Ricca Chemical Company	1450
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Cytoseal 60	Thermo Fisher Scientific, Inc.	8310
Normal Mouse Serum	Rockland Immunochemicals	D208
Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated	BD Biosciences	555388
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated	BD Biosciences	551378
Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated	BD Biosciences	557748
Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated	BD Biosciences	555537
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated	BD Biosciences	551336
Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated	BD Biosciences	557748
24-well non-treated tissue culture plates	BD Biosciences	35-1147
30 mm non-treated dish	Stem Cell Technologies	27150
100 mm tissue culture dish	Fisher Scientific	08-757-12
Gridded scoring dishes	Stem Cell Technologies	27500
15 ml centrifuge tubes	BD Biosciences	35-2097
50 ml centrifuge tubes	BD Biosciences	35-2070
Syringes 3 ml	Stem Cell Technologies	28240
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle	Stem Cell Technologies	28110
50 μm CellTrics cell filter	Partec	04-004-2327
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
TPX sample chambers	Thermo Fisher Scientific, Inc.	A78710018
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Shandon filter cards	Thermo Fisher Scientific, Inc.	5991022
Shandon cytospin slide holder	Thermo Fisher Scientific, Inc.	59920063
Shandon Complete Staining Assembly 100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	100
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34155
1 μm filter paper	VWR international	28307-134
Inverted microscope	Nikon Instruments	Diaphot
Microscope camera	Nikon Instruments	DS-F11
Microscope	Olympus Corporation	BX51
Microscope camera	Olympus Corporation	DP71
Scanner	Microtek	Scanmaker 4
Vortex mixer	Fisher Scientific	12-812
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC
Cytospin	Shandon, Inc.	Cytospin 2
Bench-top centrifuge	Eppendorf	5810-R
Water purification system	Barnstead	Nanopure-Diamond