ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ

要約

細胞（CFC）アッセイをコロニー形成は、造血前駆細胞が半固形培地でコロニーを形成しているのin vitroアッセイである。コロニー形態、細胞形態、およびフローサイトメトリーの組み合わせは、異なる造血系統に沿って増殖し、分化する前駆細胞の能力を評価するために使用されます。

要約

ヒト造血幹細胞/前駆細胞は、通常、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ、造血及び白血病を研究するために使用されています。彼らは、リンパ球と骨髄系の系統に分化する能力を持っている。コロニー形成細胞（CFC）アッセイは、半固形培地でコロニーを形成する能力によって造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを研究するために使用されます。入力セルの固定の数によって形成されたコロニーの数と形態は差別化する前駆細胞の能力についての予備的な情報を提供して増殖する。細胞はフローサイトメトリーとギムザ染色スライドの形態学的評価を使用して、その数字と分化の状態を評価するために、個々のコロニーからまたはプレート全体から収穫することができる。このアッセイでは、骨髄がリンパではない差別化を評価するのに便利です。この文脈における用語骨髄性は、単球、顆粒球、赤血球を包含する、その広い意味で使用され、巨核球系統れている。

我々は、末梢血由来の初代ヒトCD34 +細胞の分化に癌遺伝子の効果を評価するために、このアッセイを使用している。この目的のために細胞を対照レトロウイルス構築物またはこの場合NUP98 - HOXA9で、関心の癌遺伝子の発現コンストラクトのどちらかで形質導入されています。我々は、関心とGFPマーカーの遺伝子を生成するバイシストロンmRNAを発現し、一般的に使用されるレトロウイルスベクター、MSCV - IRES - GFPを、採用しています。細胞は、レトロウイルス形質導入の前に二日間のサイトカインの存在下で増殖させることによって事前にアクティブ化されます。さらに2日後に、GFP +細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって単離され、コロニーは表面に現れるまでの14日間一般的に、サイトカインを添加したとインキュベートメチルセルロースを含む半固形培地と混合。コロニーの数と形態は文書化されています。次いで、細胞をプレートから除去し洗浄し、カウント、およびフローサイトメトリーおよび形態学的検査に供される。造血過程で発現する細胞表面マーカーに特異的な抗体とフローサイトメトリーでは、系統と成熟段階についての情報を提供します。ライト - ギムザ染色後、顕微鏡下で個々の細胞の形態学的研究は、系統と成熟に関してさらなる情報を提供しています。癌遺伝子で形質ものに制御空のベクターで形質導入された細胞の比較では、造血系への分化に対する癌遺伝子の影響を明らかにする。

プロトコル

1。試薬の調製

1. FMS -関連チロシンキナーゼ3（FLT - 3）配位子、マクロファージ/顆粒球コロニー刺激因子（GM - CSF）、幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（TPO）、インターロイキン（IL）-3の滅菌1000Xストック溶液を準備する、およびIL - 6は、製造元の指示に従って。製造元の指示に従っても、無菌レトロネクチンのストック溶液（1mg/ml）を準備する。小分けにこれらのストック溶液を分割し、凍結融解を避けるために、-20℃に保つ。
2. IMDMで2％FBSを準備します。
3. 20％FBS、2mMグルタミン、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン（PS）の最終濃度で完全IMDM培地を準備する。使用直前に以下のサイトカインを追加します。100 ng / mlのFLT - 3リガンド、20 ng / mlのGM - CSF、100 ng / mlのSCF、100 ng / mlのTPO、50 ng / mlのIL - 3、および100 ng / mlのIL - 6。
4. HBSSで1％BSA（フェノ​​ールレッドを含まないカルシウム＆マグネシウムフリー、）とD - PBS（カルシウム＆マグネシウムを含まない）で2％BSAを準備します。 4で0.22μmのシリンジフィルターや店舗を通過することによってソリューションを滅菌℃に
5. 4℃HBSSと店舗で0.02％EDTAを準備℃に
6. -80アリコートへの関心と店舗のDNAをエンコードGaLV - 偽型レトロウイルス℃を準備するこのプロシージャは、この記事の範囲外ですが、（1-3）別の場所で記述されます。

ギムザ染色のための

7. 使用直前に、清浄なガラスのボトルに1μmのフィルターペーパーを2回ライト/ギムザ染色液をフィルタ。
8. ジョルダーノ式 - 使用直前に、フィルタ処理されたライト/ギムザ染色液とリン酸緩衝液、pHが6.4の200mlの50mlを混合することにより、ライト/ギムザ緩衝液6.4を準備する。
9. 3.5 LH _{2 O}でKH ₂の27.3グラムPO ₄及びNa ₂ HPO ₄の4.62グラムを溶解してリン酸緩衝液、pHが6.0を準備
10. H _{2 O}で50％のメタノールを準備

2。 PROCEDURE

+細胞を融解し、CD34の事前ライセンス認証

1. 37℃で急速に凍結されたCD34 +細胞のバイアルを解凍° C優しく最後に小さな氷の結晶が残っているまで振って、50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液（1ml）を転送することによって。ゆっくりと室温1mlでバイアルから残りの細胞を洗い流します2％FBS / IMDM、ゆっくり渦巻くながら、50 mlチューブに滴下して加える。 3分間待つ。次に、ゆっくりと静かに混合しながら、2％FBS / IMDM 2 mlを加え、3分間待ちます。最終容量が32ミリリットルに達するまで、追加の間で静かに渦巻く、3分間隔で希釈した細胞懸濁液と同じボリュームであるFBS / IMDM 2％添加することで手順を繰り返します。
2. 室温で10分間、250 × gで遠心すると約0.5ミリリットルを残して上清を取り除く。
3. 20ミリリットル2％FBS / IMDMに懸濁し、室温で8分間、200 × gで遠心分離によってペレットを洗浄します。
4. 上清を除去し、約0.5 × 10 ⁶細胞/ mlで完全IMDM培地で細胞を停止する。マイクロチューブに細胞懸濁液10μlを取り、トリパンブルー溶液（0.4％）の同量で混ぜると血球計数器を用いて数える。
5. （1.3参照）サイトカインを添加した完全IMDM培地を追加することにより、0.1から0.15 × 10 ⁶細胞/ mlに細胞を希釈する
6. 文化2日間5％CO ₂の加湿37℃インキュベーターで細胞。

ウイルスによるレトロウイルス導入プレローディング

7. トランスダクションの当日に、準備する井戸の数を決定するためにプリロードウイルスを起動する前に細胞を数える。
8. 25μg/ mlのにレトロネクチンストック溶液を希釈し、24ウェル、無処理組織培養プレートの各ウェルに400μlを加える。プリコートの層流バイオセーフティフードに室温で2時間インキュベートする。
9. レトロネクチン溶液を除去し、各ウェルに、D - PBSで2％BSA 400μlを加える。室温で30分間インキュベートする。
10. ウイルスのストック溶液を融解し、氷上に置きます。 BSA溶液を除去、各ウェルにウイルス調製物の0.5mlを追加し、4℃で2200 × gで遠心℃で15分間。
11. 井戸からのウイルス溶液を除去し、2.10以上の三回で説明されているウイルスの負荷を繰り返します。
12. コー​​ルド0.5ミリリットルHBSS（+カルシウム＆マグネシウム）またはIMDMで各ウェルを洗浄します。
13. 室温で8分間、200 × gで遠心分離することによって、事前活性化CD34 +細胞を集めます。
14. サイトカインと完全IMDM培地に1.5 ml当たり0.1〜0.15 × 10 ^6個の細胞で細胞を再懸濁します。
15. 各ウェルに1.5 mlの細胞懸濁液を追加し、2日間5％CO ₂で加湿37℃インキュベーターでインキュベートする。

形質導入細胞の細胞分別回収

16. 優しくしかし徹底的に上記のウイルス負荷プレートに細胞を停止する円錐管に50μmのCellTricsセルフィルタを介してのとフィルター。 、マイクロチューブに細胞懸濁液10μlを取るトリパンブルー溶液を等量混合し、血球計算盤を用いて数える。冷0.02％EDTA / HBSS（フェノールレッドを含まないカルシウム＆マグネシウムを含まない）の0.8 mlを各ウェルをリンスし、50μmのCellTricsセルのフィルタを介して同じコレクションチューブに加える。
17. ° Cで4℃で8分間、200 xgで細胞を遠心し、4℃で8分間、200 × gで遠心分離することによって冷HBSS（フェノールレッドを含まないカルシウム＆マグネシウムを含まない）でペレットを洗浄℃を
18. 15 X 10 ⁶ / mlまたは細胞選別のための0.250ミリリットルの最小体積の濃度を1％BSA / HBSS（フェノールレッドを含まないカルシウム＆マグネシウムを含まない）でペレットを再懸濁します。暗所で氷上で細胞を維持する。ソートされた細胞を収集するために冷却した20％FBS / IMDM /グルタミン/ PS培地を含むチューブを準備します。ソートはMoFlo高速ソーター（Dako社、グロストラップ、デンマーク）を使用して医学のワシントン大学でアルヴィンJ ·サイトマンがんセンターの高速セルソーターのコアで実行されます。

CFCアッセイ

19. CFCのアッセイ培地を3 mlのアリコートの必要数を解凍。渦は、精力的に混在させるとチューブは、任意の気泡がセルを追加する前に表面に上昇して提示できるように、少なくとも5分放置する。
20. 各ソートサンプルの細胞濃度を取得するには、おおよその細胞懸濁液の量でソート機能により提供される細胞数を割ります。 3000取るコールド2％FBS / IMDMを含む滅菌マイクロチューブにソートされた細胞は、ウイルスを形質導入。最終懸濁液の体積は約0.3 mlとなるように2％FBS / IMDMの量を事前に調整する。
21. 、細胞を懸濁し、2 mM L -グルタミン、1％メチルセルロースで構成されてMethocult GF + H4435、、30％FBS、1％BSA、10 ^-4 M 2 -メルカプトエタノール、3 mlのアリコートに全体0.3mlの細胞懸濁液を移す50 ng / mlのSCF、20 ng / mlのGM - CSF、20 ng / mlのIL - 3、20 ng / mlのIL - 6、20 ng / mlのG - CSF、および3ユニット/ IMDMのMLエリスロポエチン。 1.3％メチルセルロースで構成されて人間のメチルセルロースエンリッチメディア（R＆Dシステムズ）、25％FBS、1％BSA、5 × 10 ^-5 M 2 -メルカプトエタノール、2mM L -グルタミン、50 ng / mlのSCF、20ngの/ IMDMのML GM - CSF、20 ng / mlのIL - 3、20 ng / mlのIL - 6、20 ng / mlのG - CSF、および3ユニット/ mlのエリスロポエチンを使用することもできます。
22. 完全に混合物の上昇を確認し、3〜4回落下して激しくボルテックスする。チューブは3分間静置してみましょう。
23. 3 mlのシリンジに16ゲージの平滑末端針を取り付けて、2.2 mlを策定する。大きな泡を描画しないでください。数回を押して、開始時にそれらを追放する。 2つの30 mmノン処理皿にそれぞれ1.1ミリリットルを押し出すと回転させて均一に混合して広がる。
24. 3ミリリットル滅菌水を含む水皿と一緒に100mmの板でプレートを複製置きます。 17日 - 14文化。
25. スコアリンググリッドが付いている培養皿で40倍の倍率で、倒立顕微鏡でその形態に応じてコロニーを特徴と得点。純粋な赤芽球、骨髄単球、および混合：私たちの分析の目的のために、コロニーを3つのカテゴリーに分類されます。さらに植民地の細分については、製造元の指示を参照してください。
26. 全体のCFCアッセイプレートは600 dpiでの定期的なスキャナを使用して拡大することなくスキャンが行われる、とコロニーの低消費電力（40倍）顕微鏡写真は、カラーカメラを搭載した倒立顕微鏡を使用して取得することができます。
27. 分化と増殖のさらなる分析のために、全体のCFCアッセイプレートからの細胞を室温2％FBS / IMDMの複数のボリュームに懸濁することにより回収される。で10分間4℃で300 xgで遠心分離後、細胞をカウントし、どちらかのフローサイトメトリー用抗体で染色またはギムザ染色のためのサイトスピン遠心機を使用してスライドに移し、2％FBS / IMDMに再懸濁する。

抗体染色とフローサイトメトリー

28. 4℃で8分間200 xgで遠心細胞HBSSで冷50％正常マウス血清における° Cを再懸濁します（フェノールレッドを含まないカルシウム＆マグネシウムを含まない）。
29. チューブ当たり80μlの（12 x 75 mmの丸底チューブ）で約5 × 10 ⁵細胞を配置し、氷上に置きます。抗体の混合物（NO -抗体のコントロールの約20μlの混合物または陰性コントロール液）と軽くチューブをタッピングして混合を追加。なく抗体または各蛍光色素のための抗CD45抗体によるキャリブレーションコントロールチューブを準備します。 20分間暗所でインキュベートで氷の上に置いてチューブ。軽く最初の10分後にチューブをタップして混ぜる。 20分のインキュベーション後、冷HBSSでチューブを記入し、4℃で8分間200 xgで遠心℃、冷0.5％パラホルムアルデヒド/ HBSSでペレットを再懸濁する。
    抗体の、以下の混合物は通常、私たちの分析に使用されています。 CD11b（フィコエリトリン結合クローンICRF44）/ CD33（allophy：骨髄分化のためのcocyanin -共役クローンWM53）/ CD45（フィコエリトリン- Cy7 - congjugatedクローンHI30）。 CD71（フィコエリトリン結合クローンM - A712）/ CD235a（アロフィコシアニン標識クローンGA - R2）/ CD45（フィコエリトリン- Cy7 - congjugatedクローンHI30）：赤血球分化のための。
30. フローサイトメトリーは、5色と二つのレーザー（BD Biosciences社）にアップグレードするとCellQuest（BD Biosciences）を用いて分析したFACScanフローサイトメーターで医学のワシントン大学でアルヴィンJ ·サイトマンがんセンターの高速セルソーターのコアで実行されるかFlowJO v7.2.4（木スター社、オレゴン州アッシュランド、米国）ソフトウェア。

ギムザ染色

31. CFCアッセイプレートから回収した約30,000細胞上記を0.3 mLの2％FBS / IMDM中に懸濁し、室温で10分間1,000 rpmでサイトスピン遠心機を使用してスライドに転送されます。
32. 次の順序で解決策を含むnine染色血管を設定します。
    1. 無水メタノール
    2. ライト/ギムザ原液
    3. ライト/ギムザ液、pH 6.4
    4. H ₂ Oの50％メタノール
    5. H ₂ O
    6. H ₂ O
    7. リン酸緩衝液（pH6.0）
    8. H ₂ O
    9. H ₂ O
33. スライドキャリアにスライドを配置し（＃1）を無水メタノールに浸し、2分間と過剰のメタノールをオフ汚点。
34. すぐに、5分間ライト/ギムザ原液のスライドキャリア（＃2）ディップ。
35. ライト/ギムザ液、pH 6.4（＃3）にキャリアを移し、10分間インキュベートする。
36. （＃4）50％メタノールで二回キャリアを浸し、H ₂ O（＃5）、H ₂ O（＃6）の別の10倍、10倍して、リン酸緩衝液、pH6.0で5回は、（＃7） 。
37. H ₂ O（＃8）にキャリアを移し、2分間インキュベートする。 H ₂ O（＃9）で洗浄を繰り返します。
38. スライドは、キャリアに完全に風乾する。各スライドを削除し、汚れを除去するためにメタノールを浸したキムワイプでスライドの後ろを拭いてください。 Cytoseal 60の低下と密封するためにカバーガラスを置きます。
39. 500細胞差分カウントはオリンパスBX51顕微鏡を使用して、各ギムザ染色スライドに対して実行されます。細胞は5つのカテゴリに分かれています：原始的な細胞は芽球と前骨髄球を含んでいる;成熟した骨髄細胞はバンド、セグメント化された好中球、単球、およびマクロファージを含む;中間赤血球系細胞では、中間hemoglobinizationで細胞を含んでいる;中間骨髄細胞が骨髄球とmetamyelocytesが含まれており、成熟した赤血球細胞が含まれていますフルhemoglobinizationを持つ細胞。顕微鏡写真は、60倍の石油を目的としたオリンパスDP71カメラで撮影されています。

3.0）駐在の結果：

1. 14から17日間の潜伏期間中の半固形培地上での入力細胞集団の一部が増殖し、分化、およびフォームのコロニー：CFCアッセイ 。この実験では、それはNUP98 - HOXA9癌遺伝子の発現が顕著な赤（赤芽球コロニー）（図1）（3）の形成を引き起こしたことは明らかである。
2. 抗体染色とフローサイトメトリー：CFCアッセイプレートから採取した細胞のフローサイトメトリーによるイムノフェノタイピングは、細胞集団の分化状態に関する情報を提供します。特定の分化マーカーに対する抗体を併用することにより、細胞の成熟の系統と程度を評価することができます。この場合、CD235aは、赤血球系細胞を識別するために使用された。図2Aに示すように、NUP98 - HOXA9は、CD235a +赤血球系細胞の割合の増加を引き起こしたが、これらの細胞によるCD235a発現の明るさは、赤血球の成熟の阻害を示す、コントロールに比べ減少した。図2Bに、骨髄細胞は、それらのCD33陽性の美徳によって識別されます。 NUP98 - HOXA9は、骨髄の成熟（3）の阻害と一致するCD11bの発現の明るさの低下、で、CD33 +細胞の数の減少を引き起こした。したがって、フローサイトメトリーの結果は、NUP98 - HOXA9の骨髄および赤血球成熟の両方の阻害と赤血球過形成を引き起こしたことを示している。
3. ギムザ染色：CFCアッセイプレートから採取した細胞の形態学的検査は、細胞集団の成熟の系統と度合いに関する情報を提供します。形態学的に得られた結論は、フローサイトメトリーの研究により得られたものと異なる場合があります、ため、これらのメソッドは、（3）互いに相補的である。実験は少なくとも3回繰り返され、そしてそれぞれの時間は、500細胞差分カウントは、上述したように細胞の5つのカテゴリーを区別するために実行されます。これらの細胞の例を図3に指摘されている。結果は、間に統計的に有意な違いは癌遺伝子形質導入のサンプルとコントロールがあるかどうかを決定するために集計分析されています。この場合、結果はNUP98 - HOXA9の数の全体的な増加を引き起こしたことを示した赤芽球過形成と赤芽球と骨髄性成熟（3）（図示せず）の両方の阻害と細胞のS、。

図の説明文

図1：人間のCFCの形態でNUP98 - HOXA9の効果。
初代ヒトCD34 +細胞は、レトロウイルスNUP98 - HOXA9の発現制御MSCV - IRES - GFPのベクトルまたはベクトルのどちらかで形質導入し、細胞をGFP陽性のために選別した。一千細胞は、CFCアッセイの2つの重複したプレートの各々に播種し、実験は3 4の独立回繰り返した。倍率（左）と代表的な赤血球コロニー（右）の低消費電力の顕微鏡写真のない代表的な板は（3）表示されます。

図2：フローサイトメトリーは、人間の主要なCD34 + NUP98 - HOXA9による細胞分化の混乱を示しています。
（A）赤血球分化のためのフローサイトメトリー：CFCのプレートからの細胞（図1を参照）CD45及びCD235aに対する抗体を回収し、染色した。 CFCのプレートからの細胞がCD45とCD33と収穫と染色：CD235a +ゲートは、細胞を骨髄系分化のための（B）フローサイトメトリーを制御するために相対的なCD235aの発現を示すためにヒストグラム（右パネル）上にプロットした。 CD33 +ゲートは（右パネル）の制御に比べてCD11b発現を示すためにヒストグラムをプロットした。各ゲート内に該当する細胞の割合は、（3）表示されます。

図3：細胞形態は、ベクトル制御と比較してNUP98 - HOXA9による差別化の混乱を示しています。
サイトスピンスミアをCFCプレートから調製し、ギムザで染色した。顕微鏡写真は、60倍の石油を目的とした代表的なフィールドから採取した。 B：爆発、MM：成熟した骨髄系、IM：中間骨髄系、ME：成熟した赤血球、IE：中間赤芽球（3）。

ディスカッション

CFCアッセイは、造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを決定し、癌遺伝子（4,5）の効果を研究するために広く使用されています。それは、コロニーは単一の前駆細胞の子孫を代表し、個別に、さらなる分析のために削除できるように、クローン検定というの液体培地より優れています。 CFCアッセイの制限は、より未熟な前駆細胞や造血幹細胞の検出のための適切ではないことがあるので、?...

資料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
IMDM		Life Technologies	12440
FBS		StemCell Technologies	06150
L-Glutamine		Life Technologies	25030
Penicillin/Streptomycin (PS)		Life Technologies	15140
FLT-3 ligand		Peprotech	300-19
GM-CSF		Peprotech	300-03
SCF		Peprotech	300-07
TPO		Peprotech	300-18
IL3		Peprotech	200-03
IL6		Peprotech	200-06
Bovine Serum Albumin		Sigma- Aldrich	A7030
EDTA		Fisher Scientific	BP118
Retronectin		Takara Bio Inc	T100A
HBSS		Life Technologies	14175
PBS		Life Technologies	14200
Trypan Blue solution (0.4%)		Sigma-Aldrich	T8154
Methocult GF+ H4435		StemCell Technologies	04445
Human Methylcellulose Enriched Media		R & D Systems	HSC005
Wright/ Giemsa stain		Harleco	64571
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula		Ricca Chemical Company	1450
Methanol		Fisher Scientific	A412-4
Cytoseal 60		Thermo Scientific	8310
Normal Mouse Serum		Rockland Immunochemicals	D208
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated		BD Biosciences	555388
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated		BD Biosciences	551378
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated		BD Biosciences	557748
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated		BD Biosciences	555537
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated		BD Biosciences	551336
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated		BD Biosciences	557748
24-well non-treated tissue culture plates		BD Biosciences	35-1147
30 mm non-treated dish		StemCell Technologies	27150
100 mm tissue culture dish		Fisher Scientific	08-757-12
Gridded scoring dishes		StemCell Technologies	27500
15 ml centrifuge tubes		BD Biosciences	35-2097
50 ml centrifuge tubes		BD Biosciences	35-2070
Syringes 3 ml		StemCell Technologies	28240
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle		StemCell Technologies	28110
50 μm CellTrics cell filter		Partec	04-004-2327
Hemocytometer		Fisher Scientific	0267110
TPX sample chambers		Thermo Scientific	A78710018
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
Shandon filter cards		Thermo Scientific	5991022
Shandon cytospin slide holder		Thermo Scientific	59920063
Shandon Complete Staining Assembly 100		Thermo Scientific	100
Kimwipes		Kimberly-Clark Corporation	34155
1 μm filter paper		VWR	28307-134
Inverted microscope		Nikon	Diaphot
Microscope camera		Nikon	DS-F11
Microscope		Olympus	BX51
Microscope camera		Olympus	DP71
Scanner		Microtek	Scanmaker 4
Vortex mixer		Fisher Scientific	12-812
Tissue culture incubator		Sanyo	MCO-18AIC
Cytospin		Shandon	Cytospin 2
Bench-top centrifuge		Eppendorf	5810-R
Water purification system		Barnstead	Nanopure-Diamond