Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Method Article
Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est un dosage in vitro dans les progéniteurs hématopoïétiques, qui forment des colonies dans un milieu semi-solide. Une combinaison de la morphologie des colonies, la morphologie cellulaire et la cytométrie de flux sont utilisés pour évaluer la capacité des progéniteurs à proliférer et se différencier ainsi les différentes lignées hématopoïétiques.
Humaines hématopoïétiques cellules souches / progénitrices sont généralement obtenus à partir de la moelle osseuse, sang du cordon ou du sang périphérique et sont utilisées pour étudier l'hématopoïèse et la leucémogenèse. Ils ont la capacité de se différencier en lignées lymphoïdes et myéloïdes. Les cellules formant colonie (CFC) de dosage est utilisé pour étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs tendance hématopoïétique par leur capacité à former des colonies dans un milieu semi-solide. Le nombre et la morphologie des colonies formées par un nombre fixe de cellules d'entrée fournir des informations préliminaires sur la capacité des progéniteurs de différencier et de proliférer. Les cellules peuvent être récoltées à partir des colonies individuelles ou de la plaque entière pour mieux évaluer leur nombre et les états de différenciation par cytométrie en flux et l'évaluation morphologique de Giemsa lames colorées. Ce test est utile pour évaluer la différenciation myéloïde mais pas lymphoïdes. Le myéloïde terme dans ce contexte est utilisé dans son sens large pour englober lignées granulocytaire, monocytaire, érythroïdes et mégacaryocytaires.
Nous avons utilisé ce test pour évaluer les effets des oncogènes sur la différenciation des primaires humaines dérivées de cellules CD34 + du sang périphérique. Pour cette fin sont les cellules transduites avec le contrôle de construire soit rétroviraux ou une construction exprimant l'oncogène d'intérêt, dans ce cas-NUP98 HOXA9. Nous employons un vecteur rétroviral couramment utilisés, MSCV-IRES-GFP, qui exprime un ARNm bicistronique qui produit le gène d'intérêt et un marqueur de la GFP. Les cellules sont pré-activés par de plus en plus la présence de cytokines pendant deux jours avant transduction rétrovirale. Après deux jours, les cellules GFP + sont isolés par tri cellulaire par fluorescence (FACS) et mélangé avec un milieu semi-solide contenant méthylcellulose complétées par des cytokines et incubés jusqu'au colonies apparaissent à la surface, généralement 14 jours. Le nombre et la morphologie des colonies sont documentés. Les cellules sont ensuite retirés des plaques, lavés, comptés, et soumis à la cytométrie en flux et l'examen morphologique. La cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques à la surface cellulaire des marqueurs exprimés au cours de l'hématopoïèse fournit des informations sur la lignée et le stade de maturation. Des études morphologiques des cellules individuelles au microscope après coloration de Wright-Giemsa fournir des informations supplémentaires à l'égard de la lignée et la maturation. Comparaison des cellules transduites avec le vecteur contrôle vide à ceux transduites avec un oncogène révèle les effets de l'oncogène sur la différenciation hématopoïétique.
1. PREPARATION DES REACTIFS
Pour la coloration de Giemsa
2. PROCÉDURE
La décongélation et la pré-activation des cellules CD34 +
Transduction rétrovirale par le virus de pré-chargement
Le tri de cellules et la collecte de cellules transduites
CFC de dosage
Coloration des anticorps et de cytométrie en flux
La coloration de Giemsa
3.0) des résultats représentatifs:
Les légendes des figures
Figure 1: Les effets de la NUP98-HOXA9 sur la morphologie humaine CFC.
Primaires humaines CD34 + ont été transduites avec un retrovirus soit un contrôle MSCV-IRES-GFP vecteur ou vecteur exprimant NUP98-HOXA9, et les cellules ont été triés pour la positivité GFP. Un millier de cellules ont été ensemencées dans chacune des deux plaques en double pour dosage de CFC et de l'expérience a été répétée trois fois quatre indépendants. Représentant plaques sans grossissement (à gauche) et microphotographies de faible puissance du représentant colonies érythroïdes (à droite) sont représentés (3).
Figure 2: La cytométrie en flux montre perturbation des humains CD34 + primaires différenciation cellulaire par NUP98-HOXA9.
(A) par cytométrie en flux pour la différenciation érythroïde: Cellules des plaques de CFC (voir Figure 1) ont été récoltées et colorées avec des anticorps à CD45 et CD235a. Le CD235a + porte était tracée sur un histogramme (à droite) pour montrer l'expression de CD235a par rapport aux cellules de contrôle (B) par cytométrie en flux pour la différenciation myéloïde: Cellules des plaques de CFC ont été récoltées et colorées avec CD45 et CD33. Le CD33 + porte a été tracée sur un histogramme pour montrer l'expression CD11b par rapport au contrôle (panneau de droite). Les pourcentages de cellules relevant de chaque porte sont représentées (3).
Figure 3: La morphologie cellulaire montre la perturbation de la différenciation par NUP98-HOXA9 par rapport à la lutte antivectorielle.
Frottis ont été préparés à partir Cytospin plaques CFC et colorées au Giemsa. Photomicrographies ont été prélevés dans des champs représentatifs avec un objectif 60x du pétrole. B: explosion; MM: myéloïdes matures, IM: myéloïde intermédiaires, ME: matures érythroïdes, IE: intermédiaire érythroïdes (3).
Le dosage de CFC a été largement utilisée pour déterminer la prolifération et la différenciation des modèles de progéniteurs hématopoïétiques et d'étudier les effets des oncogènes (4, 5). Il a l'avantage sur les cultures de liquide d'être un test clonal, telles que les colonies constituent la descendance d'un ancêtre unique et peut être retiré individuellement pour une analyse ultérieure. La limitation du dosage de CFC est qu'elle n'est pas adéquate pour la détection de progé...
Name | Company | Catalog Number | Comments |
IMDM | Life Technologies | 12440 | |
FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
FLT-3 ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
HBSS | Life Technologies | 14175 | |
PBS | Life Technologies | 14200 | |
Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
Human Methylcellulose Enriched Media | R&D Systems | HSC005 | |
Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | |
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | |
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | |
Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | |
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | |
Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | |
30 mm non-treated dish | Stem Cell Technologies | 27150 | |
100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
Gridded scoring dishes | Stem Cell Technologies | 27500 | |
15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | |
50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | |
Syringes 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | Stem Cell Technologies | 28110 | |
50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
TPX sample chambers | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Shandon filter cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
Shandon cytospin slide holder | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
1 μm filter paper | VWR international | 28307-134 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Diaphot | |
Microscope camera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Microscope camera | Olympus Corporation | DP71 | |
Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon