Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.
İnsan hematopoietik kök / progenitör hücreleri genellikle kemik iliği, kordon kanı veya periferik kandan elde edilen ve hemopoeziste ve leukemogenesis incelemek için kullanılır. Bunlar lenfoid ve myeloid soyları ayırt etmek için kapasite var. Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini, yarı katı bir ortamda koloniler oluşturmak için yeteneklerini proliferasyon ve farklılaşma desen hematopoetik atalarıdır çalışma kullanılır. Sabit bir sayıda giriş hücrelerinin oluşturduğu kolonilerin sayısı ve morfolojisi ayırt etmek atalarıdır yeteneği hakkında ön bilgi vermek ve çoğalırlar. Hücreler bireysel koloniler veya bütün plaka numaraları ve akım sitometri ve Giemsa lekeli dia morfolojik değerlendirme kullanarak farklılaşma devletler daha da değerlendirmek için hasat edilebilir. Bu testte, ama lenfoid değil miyeloid farklılaşma değerlendirmek için yararlıdır. Bu bağlamda vadeli miyeloid granülositik, monositik, eritroid ve megakaryocytic soy kapsayacak şekilde daha geniş anlamda kullanılır.
Biz periferik kandan elde edilen birincil insan CD34 + hücre farklılaşması onkogenler etkilerini değerlendirmek için bu testte kullandık. Bu amaçla hücreler için NUP98-HOXA9 Bu durumda, kontrol retroviral inşa veya ilgi onkogen ifade bir yapı ile transduced. Biz, ilgi ve GFP işaretleyici gen üreten bir bicistronic mRNA ifade yaygın olarak kullanılan bir retroviral vektör, MSCV IRES-GFP, istihdam etmektedir. Hücreler sitokinlerin varlığında retroviral transdüksiyon öncesinde iki gün boyunca büyüyerek önceden aktive edilir. Bir iki gün sonra, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) GFP + hücreler izole edilir ve sitokinler ile desteklenmiş ve koloniler genellikle yüzey, 14 gün kadar inkübe metilselüloz içeren yarı katı orta ile karışık. Kolonilerin sayısı ve morfolojisi belgelenmiştir. Hücreler daha sonra plakalar kaldırılır yıkanmış sayılır ve akım sitometri ve morfolojik inceleme tabi. Flow sitometri hematopoez sırasında ifade edilen hücre yüzey belirteçleri için özel antikorlar ile soy ve olgunlaşma aşamasında hakkında bilgi sağlar. Wright-Giemsa boyama sonrası mikroskop altında tek tek hücrelerin morfolojik çalışmalar, soy ve olgunlaşma ile ilgili daha fazla bilgi sağlar. Hücrelerin karşılaştırılması bir onkogen hematopoetik farklılaşma onkogen etkileri açığa transduced bu boş vektör kontrolü ile transduced.
1. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI
Giemsa Boyama için
2. PROSEDÜRÜ
Çözülme ve pre-harekete geçirmek CD34 + hücreler
Virüs ön yükleme retroviral transdüksiyon
Hücre sıralama ve toplama hücreleri transduced
CFC testi
Antikor boyama ve flow sitometri
Giemsa boyama
3.0) TEMSİLCİSİ SONUÇLAR:
Şekil açıklamaları
Şekil 1: insan CFC morfolojisi NUP98-HOXA9 etkiler.
İlköğretim insan CD34 + hücre retrovirally kontrolü MSCV IRES-GFP vektör veya vektör NUP98-HOXA9 ifade transduced, ve hücreler, GFP pozitifliği için sıralanır. CFC tayini için iki yinelenen plakaların her birine bin hücre numaralı seribaşı ve deney 3 4 bağımsız kez tekrarlandı. Büyütme (solda) ve düşük güç temsilcisi eritroid kolonilerin (sağda) fotomikrografı olmadan Temsilcisi levhalar (3) gösterilmiştir.
Şekil 2: Flow sitometri NUP98-HOXA9 tarafından bozulması insan birincil CD34 + hücre farklılaşması gösterir.
(A) CD45 ve CD235a eritroid farklılaşması için akış sitometri: CFC plakalardan Hücreler (bkz. Şekil 1) antikorları ile hasat ve boyandı. (B) CD235a + kapı kontrol hücrelerine göre CD235a ifade göstermek için histogram (sağ panel) çizilen oldu miyeloid farklılaşma Flow sitometri: CFC plakalardan hücreler CD45 ve CD33 ile hasat ve boyandı. CD33 + kapı kontrole göre (sağ panel) CD11b ifade göstermek için bir histogram üzerinde çizilen oldu. Her bir geçidin giren hücrelerinin yüzdeleri gösterilmiştir (3).
Şekil 3: Hücre morfolojisi HOXA9 NUP98-farklılaşma bozulması vektör kontrol ile karşılaştırıldığında gösterir.
Sitospin smear CFC plakalardan hazırlanan ve Giemsa ile boyandı. Fotomikrografı 60x petrol hedefi ile temsili alanlar alınmıştır. B: patlama; MM: olgun miyeloid, IM: orta miyeloid, ME: olgun eritroid, IE: Ara eritroid (3).
CFC tahlil hematopoetik atalarıdır çoğalmasını ve farklılaşmasını modellerini belirlemek ve onkogenler (4, 5) etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu koloniler tek bir progenitör soyu temsil eden ve ileri analiz için ayrı ayrı kaldırılabilir klonal bir tahlil, sıvı kültürler üzerinde bir avantaja sahiptir. Bu tür hücreler kullanılarak tespit edilir, uzun vadeli bir kültür başlatan hücre (LTC-IC) assay (6, 7). CFC testinin sınırlama, daha olgunlaşmamış atalarıdı...
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
SCF | Peprotech | 300-07 | ||
TPO | Peprotech | 300-18 | ||
IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
PBS | Life Technologies | 14200 | ||
Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
Microscope | Olympus | BX51 | ||
Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır