Колония Формирование Cell (CFC) Пробирной по правам гемопоэтических клеток

Резюме

Колониеобразующих клетки (CFC) анализа является в пробирке тест, в котором кроветворные предшественники образовывать колонии в полутвердой среде. Сочетание колонии морфологии, морфологии клеток, и проточной цитометрии используются для оценки способности к пролиферации предшественников и дифференцировать по различным гемопоэтических линий.

Аннотация

Человек гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток, как правило, полученные из костного мозга, пуповинной крови, или периферической крови и используются для изучения кроветворения и возникновение и развитие лейкоза. Они обладают способностью дифференцироваться в лимфоидной и миелоидной линий. Колониеобразующих клетки (CFC) анализ используется для изучения пролиферации и дифференцировки гемопоэтических шаблон прародителей по их способности образовывать колонии в полутвердой среде. Количество и морфология колоний образована фиксированное число входных клетки обеспечивают предварительную информацию о способности прародителей дифференцировать и размножаться. Клетки могут быть собраны из отдельных колоний или целую тарелку для дальнейшей оценки их численности и дифференциация состояний с помощью проточной цитометрии и морфологической оценки Гимза окрашенных слайдов. Этот анализ используется для оценки миелоидной но не лимфоидной дифференцировки. Термин миелоидной в данном контексте используется в более широком смысле, чтобы охватить гранулоцитарного, моноцитов, эритроидных и megakaryocytic линий.

Мы использовали этот анализ для оценки влияния онкогенов на дифференциацию первичных человеческих CD34 + клетки, полученные из периферической крови. Для этого клетки трансдуцированных либо контроль ретровирусных построить или построить выражения онкоген интерес, в данном случае NUP98-HOXA9. У нас работают обычно используется ретровирусных вектор, MSCV-IRES-GFP, который выражает bicistronic мРНК, которая производит ген интереса и маркера GFP. Клетки предварительно активируется росту в присутствии цитокинов в течение двух дней до ретровирусной трансдукции. Еще через два дня, GFP + клеток изолированы флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) и в смеси с метил-содержащих полутвердых среде, дополненной цитокинов и инкубировали до колонии появляются на поверхности, как правило, 14 дней. Количество и морфология колоний документируются. Затем клетки удаляются из пластин, промывают, подсчитываются и подвергали проточной цитометрии и морфологические исследования. Проточная цитометрия с антителами, специфичными к поверхности клеток маркеры, высказанных в ходе кроветворения предоставляет информацию о линии и созревания. Морфологические исследования отдельных клеток под микроскопом после Райта-Гимза окрашивания предоставить дополнительную информацию в отношении происхождения и созревания. Сравнение клеток трансдуцированных с управлением пустой вектор тем трансдуцированных с онкоген показывает последствия онкоген на гемопоэтических дифференциации.

протокол

1. Подготовка реагентов

1. Подготовка стерильные растворы 1000x ФМС связанных тирозинкиназы 3 (FLT-3) лиганда, гранулоцитов / макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (ТПО), интерлейкин (IL) -3 и ИЛ-6 в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка стерильного раствора фондовом Retronectin (1mg/ml), также в соответствии с инструкциями производителя. Разделите эти растворы на небольшие порции и храните при температуре -20 ° С, чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания.
2. Подготовка 2% ЭТС в IMDM.
3. Подготовить всю среду IMDM с конечной концентрации 20% FBS, 2 мМ глютамина, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина (PS). Добавьте следующие цитокины непосредственно перед употреблением: 100 нг / мл FLT-3 лиганд, 20 нг / мл GM-CSF, 100 нг / мл SCF, 100 нг / мл ТПО, 50 нг / мл IL-3, и 100 нг / мл IL-6.
4. Подготовка 1% BSA в HBSS (Са и Mg-бесплатно, без фенола красного) и 2% БСА в D-PBS (Са и Mg-бесплатно). Стерилизовать решения, проходя через фильтры 0,22 мкм шприц и хранить при 4 ° C.
5. Подготовка 0,02% ЭДТА в HBSS и хранить при температуре 4 ° C.
6. Подготовка Galv-pseudotyped ретровируса кодирования ДНК интерес и хранить в аликвоты при -80 ° C. Эта процедура выходит за рамки данной статьи, но это описано в другом месте (1-3).

Для окрашивания Гимза

7. Просто перед употреблением, фильтр Райт / Гимза решение в два раза до 1 мкм фильтровальную бумагу в чистую стеклянную бутылку.
8. Непосредственно перед использованием, подготовить Райт / Гимза буфера рН 6,4, путем смешивания 50 мл фильтруется Райт / Гимза раствора и 200 мл фосфатного буферного раствора, рН 6,4 - Джордано формуле.
9. Подготовка фосфатного буферного раствора, рН 6,0, растворяя 27,3 г KH ₂ PO ₄ и 4,62 г Na ₂ HPO ₄ в 3,5 LH ₂ O.
10. Подготовка 50% метанола в H ₂ O.

2. ПОРЯДОК

Размораживание и предварительно активацию клеток CD34 +

1. Оттепель флакон замороженных CD34 + клетки быстро при 37 ° С, осторожно встряхивая, пока последний небольшой кристалл льда остается и передачи клеточной суспензии (1 мл) в 50 мл коническую трубку. Аккуратно смойте оставшиеся клетки из флакона с 1 мл комнатной температуре 2% ЭТС / IMDM и добавить его по каплям к 50 мл трубки в то время как закрученной мягко. Подождите 3 минуты. Затем медленно добавьте 2 мл 2% ЭТС / IMDM, при перемешивании осторожно, и ждать в течение 3 минут. Повторите эту процедуру путем добавления 2% ЭТС / IMDM то есть тот же объем, разбавленный суспензии клеток в 3 минутные интервалы, циркулируя мягко между дополнениями, пока конечный объем достигает 32 мл.
2. Центрифуга при 250 мкг в течение 10 минут при комнатной температуре и удалить супернатант оставив около 0,5 мл.
3. Вымойте гранул, приостановив в 20 мл 2% ЭТС / IMDM и центрифугирования при 200 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре.
4. Удалить супернатант и приостановить клетки в полной среде IMDM примерно 0,5 х 10 ⁶ клеток / мл. Возьмите 10 мкл суспензии клеток в микропробирки, смешать с таким же объем раствора Трипановый синий (0,4%) и подсчета использованием гемоцитометра.
5. Развести клетки 0,1-0,15 х 10 ⁶ клеток / мл, добавляя полной среде IMDM дополнен цитокинов (см. п. 1.3)
6. Культуры клеток в увлажненных 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 2 дней.

Ретровирусные трансдукции вирусом предварительной загрузки

7. В день трансдукции, граф клетки перед началом вирус предварительной загрузки, чтобы определить количество скважин должен быть подготовлен.
8. Развести Retronectin маточного раствора до 25 мкг / мл и добавляют 400 мкл в каждую лунку 24-луночных необработанной пластины для культуры ткани. Инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре в ламинарный поток биобезопасности капотом предварительного пальто.
9. Удалить Retronectin решение и добавить 400 мкл 2% БСА в D-PBS в каждую лунку. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
10. Оттепель решения вирус акции и держать на льду. Удалить решение BSA, добавить 0,5 мл вируса подготовки в каждую лунку, и центрифуге при 2200 мкг при 4 ° С в течение 15 минут.
11. Удалить вирус решение из колодцев и повторить вирусной нагрузки описаны в 2.10 еще три раза.
12. Промыть каждую лунку с холодным 0,5 мл HBSS (+ Са и Mg) или IMDM.
13. Сбор предварительно активированной CD34 + клеток путем центрифугирования при 200 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре.
14. Ресуспендируют клеток на 0,1-0,15 х 10 ^{6 клеток} на 1,5 мл в полной среде IMDM с цитокинами.
15. Добавить 1,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать в увлажненной 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 2 дней.

Сортировка клеток и коллекция трансдуцированных клетки

16. Аккуратно, но тщательно приостановить клетки над вирусом нагруженных пластинов и фильтруют через 50 мкм CellTrics ячейки фильтра в конической трубе. Возьмите 10 мкл суспензии клеток в микропробирки, смешать с равным объемом раствора Трипановый синий и считать использование гемоцитометра. Промыть каждую лунку с 0,8 мл холодной 0,02% ЭДТА / HBSS (Са и Mg-бесплатно без фенола красного) и добавить к той же трубкой коллекции через 50 мкм фильтр ячейки CellTrics.
17. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 8 минут при температуре 4 ° С, и мыть гранул с холодным HBSS (Са и Mg-бесплатно без фенола красного) путем центрифугирования при 200 мкг в течение 8 минут при 4 ° C.
18. Ресуспендируют гранул в 1% BSA / HBSS (Са и Mg-бесплатно без фенола красного) до концентрации 15 х 10 ⁶ / мл и минимальным объемом 0,250 мл для сортировки клеток. Держите клеток на лед в темное время суток. Подготовка трубку с холодным 20% FBS / IMDM / глютамин / PS среда для сбора отсортированных клеток. Сортировка производится на высокоскоростной сотовый Сортировщик Ядро Элвин Дж. Siteman Cancer Center в Вашингтоне школы медицины университета использованием MoFlo высокоскоростной сортировщик (Dako, Glostrup, Дания).

ХФУ анализа

19. Оттепель необходимом количестве 3 мл аликвот СМИ ХФУ анализа. Vortex энергично перемешать и пусть трубы стоят не менее 5 минут, чтобы любые пузыри настоящее подняться на поверхность перед добавлением клеток.
20. Для получения концентрации клеток для каждого образца сортируются, разделите число клеток осуществляется сортировка объекта по приблизительный объем клеточной суспензии. Возьмите 3000 вирусов трансдуцированных, отсортированных клеток в стерильных микропробирку содержащие холодной 2% ЭТС / IMDM. Предварительно регулировки громкости на 2% ЭТС / IMDM таким образом, чтобы конечный объем подвески составит около 0,3 мл.
21. Приостановить клетки и передачу всей 0,3 мл клеточной суспензии с 3 мл аликвоту Methocult GF + H4435, которая состоит из 1% метилцеллюлозы, 30% ЭТС, 1% BSA, 10 ^-4 М 2-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина, 50 нг / мл SCF, 20 нг / мл GM-CSF, 20 нг / мл IL-3, 20 нг / мл IL-6, 20 нг / мл G-CSF, и 3 ед / мл эритропоэтина в IMDM. Человек Метилцеллюлоза Обогащенный Media (R & D Systems), которая состоит из 1,3% метилцеллюлозы, 25% ЭТС, 1% BSA, 5 х 10 ^-5 М 2-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина, 50 нг / мл SCF, 20 нг / мл GM-CSF, 20 нг / мл IL-3, 20 нг / мл IL-6, 20 нг / мл G-CSF, и 3 ед / мл эритропоэтина в IMDM также может быть использован.
22. Vortex энергично, чтобы сделать смесь рост полностью и осенью 3-4 раза. Пусть труба стоит на месте в течение 3 мин.
23. Прикрепить 16 калибра тупой конец иглы для шприц 3 мл и составляет 2,2 мл. Не составляет большого пузырьков; изгнать их в начале путем выталкивания пару раз. Выталкивайте 1,1 мл каждая на две 30-мм необработанных блюдо и разложите смесь равномерно вращается.
24. Место дублировать плиты в 100 мм пластины вместе с водой блюдо, содержащий 3 мл стерильной воды. Культура для 14 - 17 дней.
25. Охарактеризовать и счет колоний в соответствии с их морфологии с инвертированным микроскопом при 40-кратном увеличении в культуре блюдо, отмеченные забив сетки. Для целей нашего анализа, колонии делятся на 3 категории: чисто эритроидных, миеломоноцитарный и смешанные. См. инструкции производителя для дальнейшего деление на подклассы колонии.
26. Всей пластинки анализа ХФУ могут быть отсканированы без увеличения с помощью обычного сканера на 600 точек на дюйм, и низкое энергопотребление (40x) микрофотографии колонии могут приниматься с использованием инвертированного микроскопа оснащен цветной камерой.
27. Для дальнейшего анализа дифференциации и пролиферации клеток из всей пластинки анализа ХФУ восстанавливаются путем приостановления в нескольких томах комнатной температуре 2% ЭТС / IMDM. После центрифугирования при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С, клетки ресуспендировали в 2% ЭТС / IMDM, пересчитал, и либо окрашенные антитела для проточной цитометрии или переведены на слайдах использованием цитоспина центрифуга для окрашивания Гимза.

Окрашивание антител и проточной цитометрии

28. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 8 минут при температуре 4 ° С и ресуспендируют в холодной 50% нормальной сывороткой мыши в HBSS (Са и Mg-бесплатно без фенола красного).
29. Поместите приблизительно 5 х 10 ^{5 клеток} в 80 мкл на трубке (12 х 75 мм с круглым дном трубы) и держать на льду. Добавить смесь антител (примерно 20 мкл смеси или отрицательное решение для управления не-антитело контроля) и перемешать, слегка нажав труб. Подготовка труб контроль калибровки без каких-либо антител или с анти-CD45 антител для каждого флуорохромом. Место труб на льду в темноте и инкубировать в течение 20 минут. Смешать, слегка нажав труб после первых 10 мин. После 20 мин инкубации, заполнить трубы с холодной HBSS и центрифуги при 200 мкг в течение 8 мин при 4 ° C. Ресуспендируют гранул в холодной 0,5% параформальдегид / HBSS.
    Следующие смеси антител обычно используются для нашего анализа. Для миелоидной дифференциации: CD11b (фикоэритрин-сопряженных клон ICRF44) / CD33 (allophycocyanin-сопряженных клон WM53) / CD45 (фикоэритрин-Cy7-congjugated клон HI30). Для дифференциации эритроидных: CD71 (фикоэритрин-сопряженных клон M-A712) / CD235a (allophycocyanin-сопряженных клон GA-R2) / CD45 (фикоэритрин-Cy7-congjugated клон HI30).
30. Проточная цитометрия осуществляется на высокоскоростной сотовый Сортировщик Ядро Элвин Дж. Siteman Cancer Center в Вашингтоне школы медицины университета на FACScan цитометр потока повышен до 5 цветов и два лазера (BD Biosciences) и анализировали с помощью CellQuest (BD Biosciences) или FlowJO v7.2.4 (Tree Star, Inc, Ashland, Орегон, США), программное обеспечение.

Гимза окрашивания

31. Около 30 тысяч клетки оправился от пластин ХФУ анализа, описанного выше, взвешенные в 0,3 мл 2% ЭТС / IMDM и переданы в слайд с помощью центрифуги цитоспина при 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре.
32. Настройка девять окрашивание сосудов с решениями в следующем порядке.
    1. Абсолютная Метанол
    2. Райт / Гимза маточного раствора
    3. Райт / Гимза буфере, рН 6,4
    4. 50% метанола в H ₂ O
    5. H ₂ O
    6. H ₂ O
    7. Фосфатного буфера, рН 6,0
    8. H ₂ O
    9. H ₂ O
33. Место слайдов в слайд перевозчика и окунуться в абсолютном метаноле (# 1) в течение 2 мин и промокните лишнюю метанола.
34. Сразу же, окуните слайд перевозчика в Райт / Гимза маточного раствора (# 2) в течение 5 мин.
35. Передача перевозчиком в Райт / Гимза буфере, рН 6,4 (№ 3) и инкубировать в течение 10 мин.
36. Dip перевозчика два раза в 50% метанола (# 4), 10 раз в H ₂ O (# 5), еще 10 раз в H ₂ O (# 6), а затем 5 раз в фосфатном буфере, рН 6,0 (# 7) .
37. Передача перевозчиком в H ₂ O (# 8) и выдержать в течение 2 мин. Повторите мыться в H ₂ O (# 9).
38. Разрешить слайды высохнуть полностью на перевозчика. Удалить каждого слайда и протрите заднюю слайд с метанолом пропитанной Kimwipes для удаления пятен. Место капли Cytoseal 60 и покровного стекла, чтобы запечатать.
39. 500-клеточной дифференциальный подсчет выполняется для каждого Гимза окрашенных слайд с помощью микроскопа Olympus BX51. Клетки делятся на пять категорий: примитивные клетки включают взрывы и промиелоциты; промежуточных клеток миелоидного включают миелоциты и метамиелоциты; зрелых клеток миелоидного включают группы, сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и макрофагов, промежуточные эритроидных клеток включают клетки с промежуточным hemoglobinization, и зрелые клетки эритроидного включают клетки с полным hemoglobinization. Микрофотографии взяты с камерой Olympus DP71 с 60x цель нефти.

3,0) репрезентативные результаты:

1. ХФУ анализа: некоторые из клеточной популяции вход будет расти, дифференцируются и образуют колонии на полутвердые среды в течение 14-17-дневного инкубационного периода. В этом эксперименте, то очевидно, что выражение NUP98-HOXA9 онкоген вызывает образование видные красные (эритроидных колоний) (рис. 1) (3).
2. Окрашивание антител и проточной цитометрии: проточной цитометрии иммунофенотипирования клеток собраны из пластин ХФУ анализа предоставляет информацию о дифференциации состояние клеточной популяции. К комбинированным использованием антител против определенных маркеров дифференциации, линии и степени созревания клеток могут быть оценены. В этом случае CD235a была использована для выявления эритроидных клеток. Как показано на рисунке 2А, ​​NUP98-HOXA9 привело к увеличению доли CD235a + эритроидных клеток, но и яркость выражения CD235a этими клетками была снижена по сравнению с контрольной, что указывает на ингибирование созревания эритроидных. На Рисунке 2Б, миелоидных клеток выявляются в силу своей положительности CD33. NUP98-HOXA9 вызвано уменьшением числа CD33 + клеток, с уменьшением яркости выражения CD11b, в соответствии с торможением созревания миелоидных (3). Таким образом, результаты проточной цитометрии показывают, что NUP98-HOXA9 вызвано гиперплазией эритроидного с угнетением и миелоидного и эритроидного созревания.
3. Гимза Пятно: Морфологические исследования клеток, собранных из пластин ХФУ анализа предоставляет информацию о линии и степени созревания клеточной популяции. Выводы, полученные морфологически могут отличаться от результатов, полученных с помощью проточной цитометрии исследований, и, следовательно, эти методы дополняют друг друга (3). Эксперимент повторяется по крайней мере 3 раза, и каждый раз 500-клеточной дифференциальный подсчет производится выделить 5 категорий клеток, как описано выше. Примеры эти клетки указал на рисунке 3. Результаты сведены в таблицу и проанализированы с целью определить, является ли Есть статистически значимых различий между онкоген-трансдуцированных образца и контроля. В этом случае, результаты показали, что NUP98-HOXA9 вызвало общее увеличение числаы клеток, с гиперплазией эритроидного и торможения обеих эритроидных и миелоидных созревания (3) (не показаны).

Рисункам

Рисунок 1: последствия NUP98-HOXA9 по морфологии человека CFC.
Первичные человеческие CD34 + клетки retrovirally трансдуцированных либо контроль MSCV-IRES-GFP вектор или вектор выражения NUP98-HOXA9, и клетки были отсортированы положительности GFP. Тысяча клетки высевали в каждую из двух одинаковых пластин для CFC анализа и эксперимент был повторен 3 4 независимых раза. Представитель пластины без увеличения (слева) и низкой микрофотографии власти представительной эритроидных колоний (справа) показаны (3).

Рисунок 2: Проточная цитометрия показывает нарушение человеческих первичной CD34 + клеток дифференциации по NUP98-HOXA9.
(А) Проточная цитометрия для дифференциации эритроидных: Клетки из CFC пластины (см. рисунок 1) были собраны и окрашивали антителами к CD45 и CD235a. CD235a + ворот была построена на гистограммы (справа), чтобы показать выражение CD235a по сравнению с контрольными клетками (В) Проточная цитометрия для миелоидной дифференциации: Клетки из CFC пластины собирают и окрашивают CD45 и CD33. CD33 + ворот была построена на гистограмме, чтобы показать CD11b выражении по сравнению с контролем (правая панель). Процент клеток, входящих в каждых ворот показаны (3).

Рисунок 3: Сотовый морфологии показывает, нарушение дифференциации по NUP98-HOXA9 по сравнению с переносчиками болезней.
Цитоспина мазках были приготовлены из CFC пластины и окрашивали Гимза. Микрофотографии были взяты из представителей полей с 60x цель нефти. B: взрыв, М. М.: зрелые миелоидные, И. М.: промежуточные миелоидного, ME: зрелые эритроидных, И. Е.: промежуточные эритроидных (3).

Обсуждение

Анализ ХФУ широко используется для определения пролиферации и дифференцировки гемопоэтических моделей прародителей и изучать эффекты онкогенов (4, 5). Его преимущество над жидким культуры бытия клонального анализа, например, что колонии представляют собой потомство одной предшествен...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
IMDM		Life Technologies	12440
FBS		StemCell Technologies	06150
L-Glutamine		Life Technologies	25030
Penicillin/Streptomycin (PS)		Life Technologies	15140
FLT-3 ligand		Peprotech	300-19
GM-CSF		Peprotech	300-03
SCF		Peprotech	300-07
TPO		Peprotech	300-18
IL3		Peprotech	200-03
IL6		Peprotech	200-06
Bovine Serum Albumin		Sigma- Aldrich	A7030
EDTA		Fisher Scientific	BP118
Retronectin		Takara Bio Inc	T100A
HBSS		Life Technologies	14175
PBS		Life Technologies	14200
Trypan Blue solution (0.4%)		Sigma-Aldrich	T8154
Methocult GF+ H4435		StemCell Technologies	04445
Human Methylcellulose Enriched Media		R & D Systems	HSC005
Wright/ Giemsa stain		Harleco	64571
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula		Ricca Chemical Company	1450
Methanol		Fisher Scientific	A412-4
Cytoseal 60		Thermo Scientific	8310
Normal Mouse Serum		Rockland Immunochemicals	D208
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated		BD Biosciences	555388
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated		BD Biosciences	551378
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated		BD Biosciences	557748
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated		BD Biosciences	555537
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated		BD Biosciences	551336
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated		BD Biosciences	557748
24-well non-treated tissue culture plates		BD Biosciences	35-1147
30 mm non-treated dish		StemCell Technologies	27150
100 mm tissue culture dish		Fisher Scientific	08-757-12
Gridded scoring dishes		StemCell Technologies	27500
15 ml centrifuge tubes		BD Biosciences	35-2097
50 ml centrifuge tubes		BD Biosciences	35-2070
Syringes 3 ml		StemCell Technologies	28240
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle		StemCell Technologies	28110
50 μm CellTrics cell filter		Partec	04-004-2327
Hemocytometer		Fisher Scientific	0267110
TPX sample chambers		Thermo Scientific	A78710018
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
Shandon filter cards		Thermo Scientific	5991022
Shandon cytospin slide holder		Thermo Scientific	59920063
Shandon Complete Staining Assembly 100		Thermo Scientific	100
Kimwipes		Kimberly-Clark Corporation	34155
1 μm filter paper		VWR	28307-134
Inverted microscope		Nikon	Diaphot
Microscope camera		Nikon	DS-F11
Microscope		Olympus	BX51
Microscope camera		Olympus	DP71
Scanner		Microtek	Scanmaker 4
Vortex mixer		Fisher Scientific	12-812
Tissue culture incubator		Sanyo	MCO-18AIC
Cytospin		Shandon	Cytospin 2
Bench-top centrifuge		Eppendorf	5810-R
Water purification system		Barnstead	Nanopure-Diamond