التغذية الخالية من التكيف والثقافة والركض للخلايا البشرية باستخدام IPS الطاعم كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال المصل متوسطة

Summary

بروتوكول التالية توفر التعليم للتكيف الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) إلى الخلايا المغذية الثقافة الحرة باستخدام وحدة تغذية كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال مصل المتوسطة (KSR - FF). تكييفها مرة واحدة ، كما يتم توفير إرشادات لصيانة مستمرة.

Abstract

وقد خلق هذا الاكتشاف في 2006 بأن من الممكن إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان والفأر على توليد خلايا الجذع ^1-3 بصفات متشابهة بشكل ملحوظ على الخلايا الجذعية الجنينية مصدرا قيما جديدة من الخلايا المحفزة لاكتشاف المخدرات ، والعلاج الخلوي ، والبحوث الأساسية.

وقد GIBCO سائل الإعلام والكواشف في طليعة أبحاث الخلايا الجذعية المحفزة لسنوات. خروج المغلوب DMEM تستكمل مع تبديل خروج المغلوب المصل هو وسائل الإعلام المفضلة لنمو الخلايا الجذعية الجنينية والثقافة الآن خلية الجذع ^3-9. ويمكن الآن هذا الذهب معيار نظام وسائل الاعلام أن تستخدم لتغذية ثقافة حرة مع إضافة ريال خروج المغلوب عامل النمو كوكتيل.

ES الإنسان التقليدية وأساليب زراعة الخلايا المحفزة تتطلب استخدام الفأرة أو تغذية طبقات الخلايا الليفية الإنسان ، أو تغذية مكيفة المتوسط. هذه الأساليب هي ثقافة كثيفة العمالة ، من الصعب على نطاق وأنه من الصعب الحفاظ على الوركين خلايا غير متمايزة نظرا للظروف غير معروف. وقد وضعت Invitrogen خروج المغلوب عامل نمو كوكتيل ريال ليسمح لك بسهولة الانتقال الثقافات صومعتك الوركين لتغذية الحرة مع الحفاظ على استخدامك للريال خروج المغلوب.

Protocol

ملاحظة : للحفاظ على ثقافة ظروف معقمة ، وتتم كافة الإجراءات في هذا البروتوكول على استخدام الممارسات المختبرية التي أجريت معقمة وتحت غطاء تدفق الصفحي.

قبل البدء ، تأكد من أن أية وسيلة إعلامية غير المتوازنة إلى 37 درجة مئوية ، وبالغاز بشكل مناسب.

إعداد أطباق الثقافة Geltrex المغلفة

ملاحظة : انظر الملحق لاستخدام الأطباق CELLstart الثقافة المغلفة

1. ذوبان الجليد أنبوب واحد من Geltrex (1 مل) ببطء في 2-8 درجة مئوية ، وتمييع 1:100 في 99 مل من خروج المغلوب D-MEM/F-12. مزيج الحل بلطف.
   
   ملاحظة : بعض خطوط الخلايا المحفزة قد يتطلب التخفيف Geltrex مختلفة لتحقيق النمو الأمثل. انظر التذييل لالتخفيفات البديلة.
2. تغطي السطح كله من كل صحن الثقافة مع الحل Geltrex (1 مل عن طبق 35 ملم ، 1.5 مل عن طبق من عيار 60 ملم).
3. ختم كل طبق مع Parafilm لمنع جفاف واحتضان الأطباق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   
   ملاحظة : عند هذه النقطة قد تكون لتخزين الأطباق الثقافة Geltrex المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. ختم كل طبق مع Parafilm لمنع Geltrex من الجفاف.
4. قبل استخدام ونقل الأطباق Geltrex المغلفة إلى غطاء تدفق الصفحي ، والسماح لهم لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 1 ساعة).

إعداد وحدة تغذية متكاملة خالية من ريال خروج المغلوب متوسطة

1. لإعداد 1 مل من 10 ميكروغرام / مل حل جمعية جيل المستقبل الأساسية ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
   
   

   جمعية جيل المستقبل الأساسية	10 ميكروغرام
   D - PBS	990 ميكرولتر
   جيش صرب البوسنة 10 ٪	10 ميكرولتر

   
   
   ملاحظة : يمكن أن تكون بديلا BSA HSA مع ريال أو خروج المغلوب في نفس التركيز.
2. للتحضير 50 ​​مل من 2 الحل Dispase ملغ / مل ، مزيج جو معقم و مطهر المكونات المذكورة أدناه. فلتر تعقيم وتخزين الحل في 4 درجات مئوية لتصل الى 2 أسابيع.
   
   

   Dispase	100 ملغ
   D - PBS	50 مل

3. لتحضير 100 مل ريال خروج المغلوب كاملة خالية من الطاعم (KSR - FF) الجمع بين المتوسطة جو معقم و مطهر العناصر المدرجة في الجدول أدناه.
   
   

   مكون	الأسهم تركيز	التركيز النهائي	حجم
   خروج المغلوب DMEM/F12 (الفئة رقم 12660-012)	--	1X	76.8 مل
   GlutaMAX - I (الفئة رقم 35050-061)	200 ملي	2 ملم	1 مل
   خروج المغلوب ريال (لا Cat.. 10828-028)	--	20 ٪	20 مل
   خروج المغلوب SR - GFC (الفئة رقم A10580 - 01)	50X	1X	2 مل
   bFGF (الفئة رقم PHG0024)	10 ميكروغرام / مل	20 نانوغرام / مل	200 ميكرولتر

   قد قمت بتخزين المتوسطة KSR - FF في درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-8 أسبوع واحد.
4. قبل لحظات ما قبل equilibrating المتوسط ​​كاملة لدرجة الحرارة والغازات ، إضافة جو معقم و مطهر حجم المطلوب من 2 المركابتويثانول (55 ملي تركيز الأسهم) لتركيز نهائي 0.1 ملم. على سبيل المثال ، لتحضير 100 مل من KSR - FF المتوسطة إضافة ميكرولتر 182 من 55 مم 2 المركابتويثانول (1:550 تمييع) بدلا من ذلك ، قد تضاف 2 المركابتويثانول لإكمال المتوسطة 1X وتخزينها في درجة مئوية ل08/02 تصل إلى أسبوع واحد.

تكييف iPSCs إلى KSR - FF متوسطة

1. قبل البدء ، قبل يوازن الخاص أطباق Geltrex المغلفة لدرجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة.
2. ثقافة iPSCs على الخلايا المغذية MEF حتى أنهم متموجة 70-80 ٪. يرجى الرجوع إلى دليل ماوس GIBCO الليفية الجنينية لبروتوكولات الثقافة MEF مقرا لها.
3. قبل الدافئة حجم المطلوب من Dispase في حمام ماء C ° 37. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة.
4. قبل يوازن حجم المطلوب من KSR - FF في 37 دقيقة for15 ° C حمام الماء. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة.
5. نضح المتوسط ​​من أطباق والثقافة ، وإضافة مبلغ مناسب من حل Dispase. احتضان الأطباق على 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
6. نضح الحل Dispase من كل سفينة الثقافة ويغسل الخلايا المغذية MEF بلطف مع مد برنامج تلفزيوني (2 إلى 3 مرات).
7. إضافة مبلغ مناسب من اكتمال خروج المغلوب المتوسطة ريال لكل سفينة الثقافة. استخدام مكشطة خلية أو ماصة 5 مل لكشط بلطف خلايا قبالة سطح السفينة الثقافة.
   
   ملاحظة : انظر الملحق لبروتوكولات بديلة للتكيف الثابت خطوط الخلايا المحفزة للتكيف ،
8. جمع تعليق خلية من كل صحن الثقافة في أنابيب مخروطية 15 مل منفصلة. شطف كل سفينة الثقافة مع مبلغ مناسب من اكتمال خروج المغلوب المتوسطة ريال ، وإضافة D - PBS شطف المتوسطة في أنابيب مخروطية 15 مل تحتوي على التعليق الخلية. الحرص على عدم كسر كتل الخلايا في الخلايا وحيدة
9. أجهزة الطرد المركزي ال 15 مل في أنابيب مخروطية 200 x ج لمدة 5 دقائق لiPSCs الكرية.
10. ونضح من طاف بيليه iPSC. Resuspend الكرية في مبلغ مناسب من KSR - FF المتوسطة وفقا لنسبة الانقسام (الجدول 1). لا كسر كتل الخلية إلى حجم أصغر ، وذلك لأن أصغر كتل لا نعلق البئر إلى السطح.
    
    ملاحظة : نوصي نسبة 01:02 لتقسيم المقاطع 3 الأولى بعد أن تم passaged iPSCs مباشرة من الثقافة iPSC متوسطة MEF إلى KSR - FF المتوسط. عادة ، وهي نسبة تقسيم 1:03 حتي 1:05 من المناسب ، ولكن الركض في 01:02 يضمن أعلى كثافة الخلايا عند الحاجة إلى التكيف مع الثقافة المغذية خالية.
11. قبل الطلاء وiPSCs على أطباق Geltrex المغلفة ، ونضح المتبقية Geltrex حل من الطبق قبل مغلف بالمطاط ، وإضافة ببطء مبلغ مناسب للتعليق على كل خلية طبق الثقافة. ملاحظة : لا شطف الأطباق قبل الطلاء.
12. تحريك الطبق الثقافة ذهابا وإيابا ، وجنبا إلى جنب عدة مرات لتفريق الخلايا عبر سطح الطبق. بلطف مكان الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع ترطيب جو من ثاني أكسيد الكربون ٪ ₀₄ حتي 06 فبراير في الهواء. استبدال المتوسطة الذي يقضيه مع KSR - FF كل يوم.

الركض الإنسان المحفزة باستخدام خلايا KSR - FF

13. مراقبة iPSCs البشرية المتزايدة في إكمال KSR - FF تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي 70-80 ٪ متكدسة وجاهزة للsubcultured. الرجوع إلى الشكل 1.
    
    ملاحظة : إذا أصبحت مستعمرات كثيفة جدا أو كبيرة جدا ، وازدياد التمايز يحدث.
14. قطع وإزالة أية مستعمرات متباينة iPSC قبل الركض والثقافة.
15. قبل الدافئة حجم المطلوب من Dispase في حمام ماء C ° 37. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة.
16. قبل يوازن حجم المطلوب من KSR - FF في 37 دقيقة for15 ° C حمام الماء. الرجوع الى الجدول 1 أدناه للاطلاع على تفاصيل وحدات التخزين المطلوبة.
17. نضح المتوسط ​​أمضى من السفينة الثقافة باستخدام ماصة ، وشطف الخلايا مرتين مع مد برنامج تلفزيوني.
18. إضافة بلطف قبل تحسنت Dispase حل للسفينة الثقافة (على سبيل المثال ، 1 مل من محلول Dispase في صحن الثقافة من عيار 60 ملم). دوامة السفينة الثقافة معطف سطح الخلية بأكملها.
19. احتضان سفينة الثقافة على 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
20. إزالة السفينة من الحاضنة ، نضح الحل Dispase ، ويغسل بلطف الخلايا مع مد برنامج تلفزيوني.
21. كشط بلطف خلايا قبالة سطح الطبق الثقافة باستخدام مكشطة الخلية ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15mL العقيمة.
22. شطف الأطباق الثقافة مرتين مع KSR - FF ، بلطف "رش قبالة" أي الخلايا التي لم منفصلة. تجمع شطف المتوسطة مع الخلايا في الأنبوب 15mL.
23. أنبوب الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه.
24. نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية وتخلص منه.
25. نفض الغبار بلطف أنبوب لإخراج تماما بيليه الخلية من أسفل الأنبوب.
26. resuspend بلطف الخلايا في مرحلة ما قبل معايرتها KSR - FF باستخدام ماصة 5mL المصلية. لا يسحن. ملاحظة : من المهم جدا في خطوة لresuspend بلطف الخلايا من دون استخدام القوة لتجنب الضرر.
27. نقل الخلايا إلى صحن Geltrex الطازجة المغلفة من عيار 60 ملم على نسبة الانقسام والتحرك المطلوب الطبق الثقافة ذهابا وإيابا ، وجنبا إلى جنب عدة مرات لتفريق الخلايا عبر سطحه.
28. مكان الطبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع ترطيب جو منثاني أكسيد الكربون 4-6 ٪ ₂ في الهواء.
29. في اليوم التالي ، استبدل بلطف المتوسطة الذي يقضيه مع KSR - FF لإزالة الحطام الخلية. استبدال المتوسطة ينفق يوميا بعد ذلك. مراقبة خلايا الجذع والمرور عليهم يوميا حسب الحاجة (تقريبا كل 4-5 أيام). ينصح الركض عندما تصل خلايا التقاء 70-80 ٪. عن الحفظ بالتبريد الخلية الجذع وذوبان الجليد ، لدينا تشير إلى بروتوكول بعنوان "Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من استخدام الإنسان الكامل تغذية خالية من خروج المغلوب استبدال مصل المتوسطة".

النتائج المتوقعة

الشكل 1. صورة النقيض من المرحلة أدناه iPSCs نمت على أطباق ثقافة Geltrex المغلفة به الطاعم كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال المصل المتوسط. ويحمل iPSCs مماثلة لhESCs التشكل ، التي تتميز نواة كبيرة والسيتوبلازم شحيحة. (التكبير 40X)

مكون	35mm الطبق	60mm الطبق	100mm صحن
استكمال خروج المغلوب ريال المتوسطة	2 مل	4 مل	10 مل
Geltrex الحل	1 مل	1.5 مل	4-5 مليلتر
Dispase	0.5 مل	1 مل	3-4 مليلتر
D - PBS للشطف	2 مل	4 مل	10 مل

الجدول 1. أوصت مجلدات

الرجاء انقر هنا للاطلاع على التذييل .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes