Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

Resumo

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Resumo

A descoberta em 2006 que fibroblastos humanos e mouse poderia ser reprogramado para gerar células iPS ^1-3 com qualidades muito semelhantes às células-tronco embrionárias criou uma valiosa fonte de novas células pluripotentes para descoberta de medicamentos, terapia celular, e pesquisa básica.

Media GIBCO e reagentes têm estado na vanguarda da pesquisa com células-tronco pluripotentes por anos. Knockout DMEM suplementado com Knockout Serum substituição é a mídia de sua escolha para o crescimento de células-tronco embrionárias e, agora, de cultura de células iPS ^3-9. Este padrão ouro sistema de mídia agora pode ser usado para alimentação livre de cultura com a adição de Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento.

ES humana e métodos tradicionais de cultura de células iPS requerem o uso de mouse ou camadas de alimentação humana de fibroblastos, ou alimentador condicionado médio. Estes métodos cultura são de trabalho intensivo, difícil de escala e é difícil manter quadris células indiferenciadas, devido às condições indefinido. Invitrogen desenvolveu Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento para permitir que você facilmente a transição do seu celular para culturas quadris alimentador livre, mantendo o uso do SR Knockout.

Protocolo

Nota: Para manter as condições de cultura estéril, todos os procedimentos neste protocolo são realizadas utilizando práticas de laboratório estéril e conduzidos sob uma capela de fluxo laminar.

Antes de começar, certifique-se que qualquer mídia é equilibrado a 37 ° C e adequadamente gaseados.

Preparar pratos Geltrex revestido Cultura

Nota: ver anexo para o uso de placas de cultura de CELLstart revestido

1. Tubo de descongelar um dos Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 ° C e diluir 1:100 em 99 mL de Knockout D-MEM/F-12. Misturar a solução suavemente.
   
   Nota: Algumas linhagens de células iPS podem requerer uma diluição Geltrex diferentes para o crescimento ideal. Veja o apêndice para diluições de alternativa.
2. Cobrir toda a superfície de cada placa de cultura com a solução Geltrex (1 mL para um prato de 35 mm, 1,5 mL para um prato de 60 mm).
3. Seal cada prato com Parafilm para evitar a secagem e incubar os pratos para 1 hora a 37 ° C.
   
   Nota: Neste ponto, você pode armazenar os pratos Geltrex revestido cultura a 4 ° C por até 1 mês. Seal cada prato com Parafilm para impedir a Geltrex sequem.
4. Antes de usar, transferir os pratos Geltrex revestido a uma capela de fluxo laminar e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (cerca de 1 hora).

Preparando Alimentador-Free SR Completa KnockOut Médio

1. Para preparar 1 mL de 10 mcg / ml solução FGF Basic, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C por até 6 meses.
   
   

   FGF básico	10 mg
   D-PBS	990 mL
   10% BSA	10 L

   
   
   Nota: BSA pode ser substituído com HSA ou SR Knockout na mesma concentração.
2. Para preparar 50 mL de solução 2 Dispase mg / mL, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C por até duas semanas.
   
   

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 mL

3. Para preparar 100 mL de SR KnockOut completa Alimentador-Free (KSR-FF) médio assepticamente combinar os componentes listados na tabela abaixo.
   
   

   Componente	Concentração de ações	Concentração Final	Volume
   Knockout DMEM/F12 (Cat. n º. 12.660-012)	-	1X	76,8 mL
   Glutamax-I (Cat. No. 35050-061)	200 mM	2 mM	1 mL
   KnockOut SR (sem Cat.. 10.828-028)	-	20%	20 mL
   KnockOut SR-GFC (sem Cat.. A10580-01)	50X	1X	2 mL
   bFGF (sem Cat.. PHG0024)	10 mcg / mL	20 ng / mL	200 mL

   Você pode armazenar o meio KSR-FF a 2-8 ° C por até uma semana.
4. Pouco antes de pré-equilibrar o meio completo à temperatura e gases, adicionar assepticamente o volume necessário de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentração de ações) para uma concentração de 0,1 mM final. Por exemplo, para preparar 100 mL da KSR-FF médio mL adicionar 182 de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 diluição) Alternativamente, o 2-mercaptoetanol podem ser adicionadas ao meio 1X preenchido e armazenado a 2-8 ° C para até uma semana.

Adaptação iPSCs a KSR-FF Médio

1. Antes de começar, pré-equilibrar os seus pratos Geltrex revestidas até a temperatura ambiente no bairro.
2. Cultura da iPSCs em células alimentadoras MEF até que sejam confluentes 70-80%. Por favor, consulte o manual Fibroblasto GIBCO embrionárias de camundongos para protocolos baseados em MEF cultura.
3. Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários.
4. Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários.
5. Aspirar o meio dos pratos, cultura e adicionar uma quantidade adequada de solução Dispase. Incubar os pratos a 37 ° C por 3-5 minutos.
6. Aspirar a solução de cada navio Dispase cultura e lavar as células alimentador MEF suavemente com D-PBS (2 a 3 vezes).
7. Adicionar uma quantidade adequada de meio completo KnockOut SR a cada navio de cultura. Use um raspador de célula ou uma pipeta de 5 mL para raspar suavemente as células da superfície da embarcação cultura.
   
   Nota: veja o apêndice para protocolos alternativos para adaptação difícil de se adaptar as linhas de células iPS,
8. Recolher a suspensão de células de cada placa de cultura em diferentes tubos de 15 mL cônico. Lave cada navio cultura com uma quantidade adequada de meio completo KnockOut SR, e adicione a D-PBS lavar médio para o 15 mL tubos cônicos contendo a suspensão celular. Seja cauteloso para não quebrar os aglomerados de células em uma única célula
9. Centrifugar a 15 mL em tubos cônicos 200 xg por 5 minutos para sedimentar as iPSCs.
10. Aspirar o sobrenadante do pellet iPSC. Ressuspender o sedimento em uma quantidade adequada de KSR-FF médio de acordo com a taxa de divisão (Tabela 1). Não quebre os aglomerados de células para um tamanho menor, porque os aglomerados mais pequenos não dão bem para a superfície.
    
    Nota: Recomenda-se uma taxa de divisão de 1:2 para os primeiros três passagens após o iPSCs foram várias passagens diretamente do Meio de Cultura iPSC MEF para KSR-FF médio. Normalmente, a razão de separação 01:03 - 01:05 é apropriado, mas passaging em 01:02 garante a maior densidade de células necessárias ao adaptar em uma cultura de alimentação livre.
11. Antes de chapeamento do iPSCs em pratos Geltrex revestido, aspirar solução Geltrex residual do prato pré-revestidos, e lentamente adicionar uma quantidade adequada de suspensão de células de cada placa de cultura. Nota: não lavar os pratos antes de chapeamento.
12. Mover a placa de cultura e para trás e para os lados várias vezes para dispersar as células em toda a superfície do prato. Delicadamente, coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera húmida de 4 a 6% CO ₂ no ar. Substituir o médio gasto com KSR-FF a cada dia.

Passaging células iPS usando KSR-FF

13. Observar o iPSCs humana crescendo em completa KSR-FF sob o microscópio para confirmar que as células são 70-80% confluentes e pronto para ser repicadas. Consulte a Figura 1.
    
    Nota: Se colônias tornam-se muito denso ou muito grande, maior diferenciação ocorre.
14. Cortar e remover qualquer colônias diferenciada iPSC antes passaging a cultura.
15. Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários.
16. Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários.
17. Aspirar o meio de gastos do navio cultura usando uma pipeta, e lavar as células duas vezes com D-PBS.
18. Delicadamente adicionar pré-aquecido Dispase solução para o navio de cultura (por exemplo, 1 mL de solução Dispase por 60 mm placa de cultura). Redemoinho do navio cultura para revestir a superfície da célula inteira.
19. Incubar a embarcação cultura a 37 ° C por 3 minutos.
20. Remover o navio da incubadora, aspire a solução Dispase e lavar cuidadosamente as células com D-PBS.
21. Raspe as células da superfície da placa de cultura com uma espátula de células, e transferência das células para um tubo de centrifugação estéril 15ml.
22. Lavar o prato de cultura duas vezes com KSR-FF, gentilmente "pulverização off" as células que não tenham destacado. Piscina do enxágüe meio com as células no tubo de 15mL.
23. Centrifugar o tubo a 200 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para agregar as células.
24. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e descartá-lo.
25. Agite suavemente o tubo para expulsar totalmente o pellet celular a partir do fundo do tubo.
26. Delicadamente ressuspender as células pré-equilibradas KSR-FF com uma pipeta de 5mL sorológicos. Não triturar. Nota: é fundamental na etapa delicadamente ressuspender as células sem usar a força para evitar danos.
27. Transferência das células para um novo prato de 60 mm Geltrex revestido na razão de separação desejada e mova a placa de cultura e para trás e para os lados várias vezes para dispersar as células em sua superfície.
28. Coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera húmida de4 a 6% CO ₂ no ar.
29. No dia seguinte, colocar suavemente o médio gasto com KSR-FF para remover restos celulares. Substituir o médio passou todos os dias depois. Observe as células iPS diárias e passagem-los conforme necessário (aproximadamente a cada 4-5 dias). Passaging é recomendada quando as células atingem confluência de 70-80%. Para criopreservação de células iPS e descongelamento, consulte nosso protocolo intitulado "criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando Completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro Medium".

Resultados esperados

Figura 1. A imagem abaixo mostra contraste de fase iPSCs cultivadas em pratos Geltrex revestido cultura usando completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum médio. O iPSCs apresentam morfologia semelhante ao hESCs, caracterizado por núcleos grandes e citoplasma escasso. (40x)

Componente	Dish 35 milímetros	Dish 60 milímetros	Dish 100 milímetros
Completa KnockOut SR médio	2 mL	4 mL	10 mL
Geltrex Solution	1 mL	1,5 mL	4-5 mL
Dispase	0,5 mL	1 mL	ML 3-4
D-PBS para lavagem	2 mL	4 mL	10 mL

Tabela 1. Volumes recomendado

Por favor, clique aqui para ver o apêndice .

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes