完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

要約

以下のプロトコルは、完全なノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地（KSR - FF）を使用して、フィーダーフリー文化に人間の人工多能性幹（iPS）細胞を適応させるための命令が用意されています。適応一度、継続的に維持するための手順も記載されています。

要約

ヒトとマウスの線維芽細胞は、胚性幹細胞に非常に似て資質と^1月3日 iPS細胞を生成するために再プログラムできることを2006年の発見は、創薬、細胞治療、および基礎研究のための多能性細胞の貴重な新しいソースを作成しました。

GIBCOの培地および試薬は、年間の多能性幹細胞研究の最前線にされている。 DMEMはノックアウト血清代替物を添加したノックアウトは胚性幹細胞の成長と現在のiPS細胞培養^3-9最適なメディアです。この金の標準的なメディアシステムは、現在、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを追加してフィーダーを含まない培養に使用することができます。

従来のヒトESやiPS細胞の培養法はマウスやヒトの線維芽細胞フィーダー層の使用、またはフィーダ-馴化培地を必要とする。これらの培養法は、スケールにハード、労働集約的であり、それが原因で未定義の条件に未分化腰の細胞を維持することは困難である。インビトロジェンはまだノックアウトSRの使用を維持しながら、フィーダーフリーへの移行、お尻の細胞培養を容易にできるようにノックアウトSRの成長因子のカクテルを開発しました。

プロトコル

注：無菌培養条件を維持するためには、このプロトコルの手順のすべては、無菌室の安全基準を用いて実施し、層流フードの下に行われている。

開始する前に、すべてのメディアは℃、適切にガス処刑37に平衡であることを確認してください。

Geltrexコーティングした培養皿の準備

注意：CELLstartコート培養皿を使用するための付録を参照してください

1. 2〜8雪解けGeltrexの一管（1mL）をゆっくり° CとノックアウトD-MEM/F-12の99 mLので1:100にそれを希釈する。穏やかに解決策を混ぜる。
   
   注：一部のiPS細胞株は、最適な成長のための異なるGeltrexの希釈が必要な場合があります。代替希釈については、付録を参照してください。
2. Geltrex溶液（35 - mmディッシュに1 mLを、60 mmディッシュでは1.5 mL）でそれぞれ培養皿の表面全体をカバーしています。
3. 乾燥を防ぎ、37℃で1時間のための皿をインキュベートするためにパラフィルムで各皿をシール℃に
   
   注：最大1ヶ月間この時点では、4℃でGeltrexコーティングした培養皿が格納されることがあります。乾燥からGeltrexを防ぐためパラフィルムで各皿をシール。
4. 使用する前に、層流フードへGeltrex -コートディッシュを転送し、それらが室温（約1時間）に平衡化することができます。

完全ノックアウトSRフィーダーを含まない培地を準備

1. 10μg/ mLの基本的なFGFの溶液1 mLを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 -20℃で分注しソリューションと店舗までの6ヶ月間。
   
   

   塩基性FGF	10μgの
   D - PBS	990μL
   10％BSA	10μL

   
   
   注：BSAは、同じ濃度でHSAまたはノックアウトSRで置換することができます。
2. 2 mg / mLのディスパーゼの溶液50mlを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 4の解と店舗℃で2週間までを滅菌フィルタします。
   
   

   ディスパーゼ	100mgの
   D - PBS	50 mLの

3. 完全なノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地は無菌的に以下の表に示すコンポーネントを組み合わせて100 mlを調製する。
   
   

   コンポーネント	ストック濃度	最終濃度	ボリューム
   ノックアウトDMEM/F12（カタログ番号。12660〜012）	-	1X	76.8 mLの
   グルタミン- I（製品番号35050〜061）	200mMの	2mMの	1 mLの
   ノックアウトSR（カタログ番号。10828〜028）	-	20パーセント	20 mLの
   ノックアウトSR - GFC（カタログ番号。A10580 - 01）	50X	1X	2 mLの
   bFGFの（カタログ番号。PHG0024）	10μg/ mLの	20 ng / mLの	200μL

   最大1週間までには2-8 ° CでKSR - FF媒体を格納することがあります。
4. 温度とガスに完全培地を事前に平衡化する直前に、無菌的に0.1mMの最終濃度は2 - メルカプトエタノールの必要量（55 mMストック濃度）を追加します。例えば、KSR - FFの培地100mlを準備することは2 - メルカプトエタノール（1:550希釈）あるいは55mmの182μLを追加、2 - メルカプトエタノールは、のために1X完了培地に添加し、2〜8℃で保存することができる最大1週間まで。

KSR - FFミディアムに性IPSCを適応

1. 起動する前に、フードの室温におGeltrexコートディッシュをあらかじめ平衡化します。
2. MEFフィーダー細胞上の文化は性IPSC彼ら70〜80％コンフルエントになるまで。 MEFベースの文化のプロトコルのためGIBCOマウス胎児線維芽細胞のハンドブックを参照してください。
3. 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。
4. 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。
5. 培養皿から培地を吸引し、ディスパーゼソリューションの適切な量を追加します。 3〜5分間37℃で料理をインキュベートする。
6. 各培養容器からディスパーゼソリューションを吸引し、D - PBS（2〜3倍）で穏やかにMEFフィーダー細胞を洗い流してください。
7. それぞれの培養容器に完全ノックアウトSR媒体の適切な量を追加。静かに培養容器の表面から細胞をこすり取る際には、セルスクレイパーまたは5 mLのピペットを使用してください。
   
   注：iPS細胞ラインに適応するのは難しいため、代替適応プロトコルについては、付録Aを参照して、
8. 別の15 mLコニカルチューブに各培養皿から細胞懸濁液を収集する。完全なノックアウトSR媒体の適切な量と各培養容器をすすぎ、およびD - PBSで細胞懸濁液を含む15 mLコニカルチューブに培地をすすぎに追加します。単一の細胞に細胞塊を壊さないように注意が必要です
9. ペレット性IPSC〜5分間、200 xgで15 mLコニカルチューブを遠心する。
10. IPSCペレットから上清を吸引除去する。スプリット比（表1）によるとKSR - FF媒体の適切な量のペレットを再懸濁する。小さな塊が表面にうまく接続していないので、小さいサイズにし、細胞塊を分割しないでください。
    
    注：性IPSCはIPSC MEFの培養培地からKSR - FFの培地に直接継代された後、我々はまず、3継代のための1:2の分割比をお勧めします。通常は、1:3および1:5の間でスプリット比は適切ですが、1:2の継代は、フィーダーフリー文化に適応する際に必要な細胞の高密度を実現します。
11. Geltrexコートディッシュ上性IPSCをめっきする前に、事前にコートしたディッシュから残留Geltrexソリューションを吸引し、ゆっくりと各培養皿に細胞懸濁液の適切な量を追加します。注：メッキの前に皿を洗っていない。
12. 皿の表面を横切って細胞を分散させるために側に数回に前後に培養皿を移動し、サイド。ゆっくりと空気中の4〜6％CO ₂の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーターで培養皿を置きます。 KSR - FFによる使用済み培地を毎日交換してください。

KSR - FFを用いてヒトiPS細胞を継代

13. 細胞は70〜80％コンフルエントと継代培養する準備ができていることを確認するために顕微鏡下で完全なKSR - FFに成長している人間性IPSCを守ってください。図1を参照してください。
    
    注：コロニーがあまりにも密すぎたり大きくなり場合、増加分化が発生する。
14. 切り出しと文化を継代する前にあらゆる差別IPSCコロニーを削除します。
15. 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。
16. 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。
17. ピペットを用いて培養容器から使用済み培地を吸引し、そしてD - PBSで細胞を2回すすいでください。
18. ゆっくりと培養容器（例えば、60 mmの培養皿あたりのディスパーゼ溶液1 mL）に予め温めておいたディスパーゼのソリューションを追加します。コー​​ト全体の細胞表面をにスワール培養容器を。
19. 3分間37℃で培養容器をインキュベートする。
20. インキュベーターから容器を削除、ディスパーゼソリューションを吸引し、そして穏やかに、D - PBSで細胞を洗浄する。
21. 優しくセルスクレイパーを用いて培養皿の表面から細胞をこすり、および滅菌15mlの遠心チューブに細胞を移す。
22. 静かに切り離されていない任意のセルを"オフ噴霧"、KSR - FFで二回培養皿をすすぎます。プールは、15mlのチューブで細胞と培地を洗い流してください。
23. ペレットに室温で5分間、細胞を200 xgでチューブを遠心分離します。
24. 慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、それを捨てる。
25. ゆっくりと完全にチューブの底から細胞ペレットを取り除くために、チューブをフリック。
26. 静かに5mLの血清学的ピペットを用いて予め平衡KSR - FFで細胞を懸濁します。粉薬しないでください。注：それは静かに損傷を避けるために、力を使わずに細胞を再懸濁するステップで非常に重要です。
27. 目的のスプリット比で新鮮な60 mmのGeltrex -コートしたディッシュに細胞を移し、その表面を横切って細胞を分散させる側にし、サイド前後に数回の培養皿を移動する。
28. の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーターで培養皿を置きます4から6パーセントの空気中のCO _2。
29. 次の日、穏やかに細胞破片を除去するためにKSR - FFで使用済み培地を交換してください。その後毎日の使用済み培地を交換してください。 （およそ4-5日）、必要に応じてそれらを毎日通過iPS細胞を守ってください。継代は細胞が70-80％のコンフルエントに達したときに推奨されます。 iPS細胞の凍結保存および解凍の場合は、"完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingと回復"という我々のプロトコルを参照してください。

予想される結果

図1下の位相コントラスト画像は、完全にノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地を使用してGeltrexコーティングした培養皿上に成長性IPSCを示しています。性IPSCは、大規模な核とわずかな細胞質を特徴とヒトES細胞への形態似て示す。 （40倍拡大）

コンポーネント	35mmのディッシュ	60ミリメートルディッシュ	100mmディッシュ
完全にノックアウトSR培地	2 mLの	4 mLの	10mLの
Geltrexソリューション	1 mLの	1.5 mLの	4〜5 mLの
ディスパーゼ	0.5mLの	1 mLの	3〜4 mLの
すすぎのためのD - PBS	2 mLの	4 mLの	10mLの

表1。推奨されるボリューム

付録を見るにはここをクリックしてください 。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes