İnsan IPS Hücreler Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak Besleyici Adaptasyon, Kültür ve Pasajlanması

Özet

Aşağıdaki protokolü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta (KSR-FF) kullanarak besleyici ücretsiz kültür, insan kaynaklı Pluripotent Kök (IPS) Hücreler uyarlanması için talimat sağlar. Bir kez, adapte sürekli bakım için talimatlar ayrıca verilmiştir.

Özet

2006 yılında, insan ve fare fibroblastlar dikkat çekici embriyonik kök hücrelere benzer nitelikleri ^ile 1-3 iPS hücreleri üretmek yeniden olabilir keşif pluripotent hücrelerin hücre tedavisi, ilaç keşfi ve temel araştırmalar için değerli bir yeni kaynak yaratmıştır .

Gibco medya ve reaktifler yıllardır pluripotent kök hücre araştırmaları ön planda olmuştur. DMEM Nakavt Nakavt Serum Değiştirme ile desteklenmiş, embriyonik kök hücre büyümesi ve şimdi iPS hücre ^kültürü 3-9 için tercih edilen medya . Bu altın standart medya sistemi artık Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyli ilavesi ile besleyici ücretsiz kültür kullanılabilir.

Geleneksel insan ES ve iPS hücre kültürü yöntemleri, fare veya insan fibroblast besleyici katmanları veya besleyici klimalı ortamı gerektirir. Bu kültür yöntemleri ölçekli, emek-yoğun, sert ve tanımlanmamış durumlar nedeniyle farklılaşmamış kalça hücreleri korumak için zordur. Invitrogen Nakavt SR hala korurken, besleyici-ücretsiz geçiş kalça hücre kültürlerinde kolaylıkla izin Nakavt SR Büyüme Faktörü Kokteyl geliştirdi.

Protokol

Not: steril kültür koşullarını korumak için, bu protokol tüm prosedürlerin steril laboratuar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilen ve laminer akış kaputu altında yürütülmelidir.

Başlamadan önce, herhangi bir ortam, 37 dengelenmiş olduğundan emin ° C ve uygun gazladı.

Geltrex kaplı Kültür Yemekleri hazırlanması

Not: CELLstart kaplı kültür kaplarına kullanımı için Ek

1. Çözülme Geltrex yavaş yavaş 2-8 (1 mL) ° C tüp ve Knockout D-MEM/F-12 99 ml 1:100 onu sulandırmak. Çözüm hafifçe karıştırın.
   
   Not: Bazı iPS hücre hatları, optimum büyüme için farklı bir Geltrex seyreltme gerekebilir. Alternatif dilüsyonları için eke bakınız.
2. Her kültürün çanak tüm yüzeyi Geltrex çözüm (35 mm yemek için 1 ml, 60 mm yemek için 1.5 ml) ile kaplayın.
3. Kurumasını önlemek ve 37 yemekleri az 1 saat inkübe Parafilm ° C ile her tabak sızıntısını önleyiniz
   
   Not: Bu noktada, 1 aya kadar 4 ° C'de Geltrex kaplı kültür kaplarına saklayabilir. Geltrex kurumasını önlemek için her tabak Parafilm Seal.
4. Kullanmadan önce, bir laminer akış kaputu Geltrex kaplı yemekler aktarmak ve onları oda sıcaklığında (yaklaşık 1 saat) gelmesini sağlar.

Komple nakavt SR Besleyici Ücretsiz Orta hazırlanması

1. 10 mcg / ml Temel FGF çözüm, 1 ml hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. -20 ° C'de kısım çözüm ve mağaza, 6 aya kadar.
   
   

   Temel FGF	10 mikrogram
   D-PBS	990 mcL
   10% BSA	10 mcL

   
   
   Not: BSA aynı konsantrasyonda HSA veya Knockout SR ile ikame edilebilir.
2. 50 ml 2 mg / ml Dispase çözüm hazırlamak için, aseptik aşağıda listelenen bileşenleri karıştırın. Filtre 4 çözüm ve mağaza ° C 2 haftaya kadar sterilize.
   
   

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 ml

3. 100 ml tam nakavt SR Besleyici-Free (KSR-FF) orta aseptik aşağıdaki tabloda listelenen bileşenleri bir araya hazırlamak için.
   
   

   Bileşen	Stok Konsantrasyon	Final Konsantrasyon	Hacim
   Nakavt DMEM/F12 (Kat. No. 12.660-012)	-	1X	76.8 ml
   GlutaMAX-I (Kat. No: 35.050-061)	200 mm	2 mM	1 ml
   Nakavt SR (Kat. no: 10.828-028)	-	% 20	20 ml
   Nakavt SR-GFC (Kat. no. A10580-01)	50X	1X	2 mL
   bFGF (Kat.. PHG0024)	10 mcg / mL	20 ng / ml	200 mcL

   Bir haftaya kadar 2-8 ° C'de KSR-FF orta saklayabilir.
4. Sıcaklık ve gazlar için tam orta pre-değişikti hemen önce, aseptik 0.1 mM son konsantrasyon için gerekli 2 merkaptoetanol hacmi (55 mM stok konsantrasyonu) ekleyin. Örneğin, 100 ml KSR-FF orta hazırlamak için 182 mcL 2-mercaptoethanol (1:550 dilüsyon) Alternatif olarak 55 mM, 2-mercaptoethanol 1X tamamlanan orta ve 2-8 ° C'de saklanan olabilir bir hafta kadar.

KSR-FF Orta iPSCs uyarlanması

1. Başlamadan önce, kaput Geltrex kaplı yemekleri oda sıcaklığında ön dengelenmesi.
2. Kültür MEF besleyici hücreler iPSCs% 70-80 konfluent kadar. MEF tabanlı kültür protokoller için Gibco Fare Embriyonik Fibroblast el kitabı bakın.
3. 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız.
4. 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız.
5. Kültür yemekleri orta aspire ve uygun miktarda bir Dispase çözüm ekleyin. Bulaşıkları 3-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
6. Her kültürün gemi Dispase çözüm aspire ve D-PBS (2 ila 3 kat) MEF besleyici hücrelerin nazikçe yıkayın.
7. Her kültür gemi için uygun bir miktar tam nakavt SR orta ekleyin. Kapalı hücreleri kültür gemi yüzeyine hafifçe kazımak için bir hücre kazıyıcı ya da 5 ml pipet kullanın.
   
   Not: sabit iPS uyum hücre hatları için alternatif uyum protokoller için eke bakınız,
8. Her kültürün çanak hücre süspansiyonu ayrı 15 ml konik tüpler içine toplayın. Her bir kültür damarı tam nakavt SR orta uygun bir miktarı ile temizleyin, durulayın ve D-PBS hücre süspansiyonu içeren 15 ml konik tüpler içine orta durulama ekleyin. Tek hücre içine hücre kümeleri kırmak için değil dikkatli olun
9. 15 ml konik tüpler iPSCs pelet 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin.
10. IPSC pelet süpernatant aspire. KSR-FF orta split oranı (Tablo 1) göre uygun bir miktarda pelletini tekrar. Küçük öbekler yüzeye iyi binmemelidir, çünkü küçük bir boyutu, hücre kümeleri kırmak değil.
    
    Not: Biz ilk 3 pasajlar iPSCs iPSC MEF Kültür Orta KSR-FF orta direkt geçişli olmuştur sonra 1:2 bölünmüş bir oranı öneririz. Normalde, 01:03 ve 01:05 arasında bir bölünme oranı uygun olan, ancak 01:02 az Pasajlanması besleyici ücretsiz bir kültürün içine adapte gerekli hücrelerinin yüksek yoğunluklu sağlar.
11. Geltrex kaplı yemekleri iPSCs kaplama, önce ön kaplı çanak artık Geltrex çözümü aspirat ve yavaş yavaş her kültür çanak için uygun bir miktarda hücre süspansiyonu ekleyin. Not: kaplama önce yemekleri durulama yok.
12. Çanağı yüzeyi boyunca hücreler dağıtmak için birkaç kez ileri geri ve yan kültür çanak hareket ettirin. Hafifçe nemlendirilmiş bir atmosfer hava 4 ila% 6 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör kültür tabağına yerleştirin. KSR-FF ile harcanan orta her gün değiştirin.

KSR-FF kullanarak Pasajlanması insan iPS hücreleri

13. Mikroskop altında hücrelerin% 70-80 konfluent ve pasajlandı olmaya hazır olduğunu doğrulamak için tam KSR-FF büyüyen insan iPSCs uyun. Şekil 1 bakın.
    
    Not: koloniler çok yoğun veya çok büyük hale gelirse, artan farklılaşması oluşur.
14. Kes ve kültür Pasajlanması önce herhangi bir farklılaşmış iPSC koloniler kaldırmak.
15. 37 ° C su banyosunda Dispase Öncesi sıcak gerekli hacim. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız.
16. 37 ° C su banyosunda for15 dakika KSR-FF gerekli hacmi Pre-dengelenmesi. Gerekli miktarlar hakkında ayrıntılı bilgi için aşağıdaki Tablo 1'e bakınız.
17. Bir pipet kullanarak kültür damarı harcanan orta aspire ve hücrelerin D-PBS ile iki kez yıkayın.
18. Yavaşça kültür damarı (örneğin, 60 mm kültür çanak başına Dispase çözüm 1 ml) önceden ısıtılmış Dispase çözüm ekleyin. Tüm hücre yüzeyinde kat Swirl kültür damarı.
19. Kültür damarı 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
20. Inkübatör geminin çıkarın, Dispase çözüm aspirat ve D-PBS ile hücrelerin nazikçe yıkayın.
21. Hücrelerin, hücre kazıyıcı kullanarak kültürü çanak yüzeyinden hafifçe kazıyın ve 15 mL steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak.
22. Nazikçe müstakil olmayan herhangi bir hücre "püskürtme", KSR-FF ile iki kez kültür çanak durulayın Havuz, 15 mL tüp hücreleri orta durulayın.
23. Tüp, oda sıcaklığında pelet hücreleri 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin .
24. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatantı aspirat ve atın.
25. Yavaşça tüp tüp alttan tamamen hücre pelletini çıkarmak için hafifçe vurun.
26. 5ml serolojik bir pipet kullanarak ön dengelenmiş KSR-FF hücreler yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin. Çiğnemek değil. Not: hafifçe zarar vermemek için kuvvet kullanmadan hücreleri tekrar süspansiyon adım kritik.
27. Istenen bölünmüş oranında taze bir 60 mm Geltrex kaplı çanak hücreleri transferi ve yüzeyi boyunca hücreler dağıtmak için birkaç kez ileri geri ve yan kültür çanak taşımak.
28. Nemlendirilmiş bir atmosferi ile 37 ° C inkübatör kültür tabağına yerleştirin% 4 ila 6 hava CO _2.
29. Ertesi gün hafifçe hücre enkaz kaldırmak için harcanan orta KSR-FF ile değiştirin. Bundan sonra günlük harcanan orta değiştirin. IPS hücreleri günlük olarak (yaklaşık olarak her 4-5 gün) geçişi dikkate alınmalıdır. Pasajlanması hücrelerin% 70-80 izdiham ulaştığınızda tavsiye edilir. IPS hücre dondurulması ve eritme için, "Komple nakavt Serum Yedek Besleyici-Alerjik Orta kullanarak dondurularak ve İnsan iPS Hücreler kurtarma" başlıklı protokol bakın.

Beklenen Sonuçlar

Şekil 1. Aşağıdaki faz kontrast görüntü tam nakavt Serum Yedek Besleyici Ücretsiz orta kullanarak Geltrex kaplı kültür kaplarına yetişen iPSCs gösterir. IPSCs, büyük bir çekirdek ve kıt sitoplazma ile karakterize hESC, morfolojisi benzer sergiler. (40x büyütme)

Bileşen	35mm Bulaşık	60mm Bulaşık	100mm Bulaşık
Komple nakavt SR orta	2 mL	4 mL	10 ml
Geltrex Çözüm	1 ml	1,5 mL	4-5 ml
Dispase	0,5 mL	1 ml	3-4 ml
Durulama için D-PBS	2 mL	4 mL	10 ml

Tablo 1. Önerilen Hacimleri

Ek görmek için buraya tıklayınız .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes