免费接驳适应，文化和传代使用完整的基因敲除血清替代馈线中的人类iPS细胞

摘要

以下协议提供馈线自由的文化，使用完整的基因敲除血清替代馈线培养基（KSR - FF）为适应人类诱导多能干细胞（iPS）细胞的指令。一旦适应，也提供了不断维护的说明。

摘要

在2006年的发现，人类和小鼠成纤维细胞可以重新编程，以产生iPS细胞与胚胎干细胞非常相似^的特质1-3创造了一个有价值的新来源，为药物开发，细胞治疗和基础研究的多能干细胞。

GIBCO公司媒体和试剂已在多年的多能干细胞研究的前沿。淘汰赛的DMEM淘汰赛血清替代补充是胚胎干细胞的生长和现在的iPS细胞培养^3-9的首选媒体。这个黄金标准的媒体系统现在可以用于馈线自由的文化，除了与基因敲除的SR生长因子鸡尾酒。

传统的人类ES和iPS细胞培养的方法需要使用鼠标或人类成纤维细胞饲养层，或馈线条件培养基。这些文化的方法是劳动密集型，规模是难以维持臀部细胞的未分化由于未定义的条件。 Invitrogen公司开发了淘汰赛的SR生长因子鸡尾酒，让您可以轻松地转型你的臀部细胞培养馈线，同时仍保持了您的使用基因敲除的SR。

研究方案

注意：要保持无菌培养条件下，所有在本议定书的程序进行使用无菌实验室做法，并在层流罩下进行。

开始之前，确保任何媒体平衡至37 ° C和适当的毒气。

准备Geltrex涂层的培养皿

注意：使用CELLstart涂层的培养皿见附录

1. 解冻之一Geltrex（1毫升）慢慢在2-8℃管和1:100，稀释在99毫升淘汰赛D-MEM/F-12。轻轻混合解决方案。
   
   注：有些iPS细胞系可能需要不同Geltrex的最佳生长的稀释。替代稀释见附录。
2. 每个培养皿的整个表面覆盖Geltrex溶液（1毫升为35毫米的菜，为60毫米的菜1.5毫升）。
3. 密封每盘用封口膜，以防止干燥和1小时的菜在37 ° C。
   
   注意：此时你可能会储存在4 ° C的Geltrex涂层的培养皿中，长达1个月。每个菜用封口膜密封，以防止干燥Geltrex。
4. 之前使用，转让Geltrex涂层菜的层流罩，并允许他们平衡至室温（约1小时）。

准备完整的基因敲除SR馈线中

1. 为了准备1毫升10微克/毫升的基本的FGF解决方案，在无菌条件下混合下面列出的组件。分装的解决方案，并在-20 ° C存储长达6个月。
   
   

   基本的FGF	10微克
   D - PBS	990微升
   10％的BSA	10微升

   
   
   注：可与牛血清白蛋白HSA或在相同浓度的基因敲除的SR取代。
2. 为了准备50毫升2毫克/毫升Dispase解决方案，在无菌条件下混合下面列出的组件。过滤消毒的解决方案，并储存在4 ° C至2周。
   
   

   Dispase	100毫克
   D - PBS	50毫升

3. 要准备100毫升完整的基因敲除SR馈线免费（KSR - FF）培养基无菌结合下表中列出的组件。
   
   

   组件	股权集中度	终浓度	卷
   淘汰赛的DMEM/F12（部件没有。12660-012）	-	1X	76.8毫升
   GlutaMAX - I（货号35050-061）	200毫米	2毫米	1毫升
   基因敲除SR（货号。10828-028）	-	20％	20毫升
   淘汰赛SR - GFC（部件没有。A10580 - 01）	50X	1X	2毫升
   碱性成纤维细胞生长因子（部件。PHG0024）	10微克/毫升	20毫微克/毫升	200微升

   您可能会储存在2-8℃KSR - FF介质长达一个星期。
4. 就在预平衡温度和气体的完全培养基，在无菌条件下加入终浓度为0.1毫米2巯基乙醇所需的量（55毫米股票浓度）。例如，要准备100毫升KSR - FF培养基中添加55毫米，182μL，2 - 巯基乙醇（1:550稀释），另外，2 - 巯基乙醇可添加到1X完成中型，储存在2-8℃一个星期。

使iPSCs的KSR - FF中等

1. 开始前，预先平衡你的Geltrex涂菜室温在引擎盖。
2. 文化在MEF饲养层细胞的iPS细胞，直到他们70％-80％融合。请参阅Gibco公司小鼠胚胎成纤维细胞MEF的文化协议手册。
3. 预温的Dispase所需的音量在37℃水浴。所需的卷的详细信息，请参阅下面的表1。
4. 在37℃水浴for15分钟中预平衡KSR - FF所需的量。所需的卷的详细信息，请参阅下面的表1。
5. 吸从培养皿中，并添加适量Dispase解决方案。在37 ° C孵育3-5分钟的菜肴。
6. 从每一种文化船吸Dispase解决方案，并洗掉用D - PBS（2至3倍）的MEF饲养层细胞轻轻。
7. 添加适量的完整的基因敲除SR载体，以每个培养容器。使用细胞刮刀或5毫升吸管轻轻刮去细胞培养容器的表面。
   
   注：参见附录很难适应的iPS细胞系的替代性适应协议，
8. 从每个培养皿中收集到单独的15 mL锥形管的细胞悬液。冲洗每个培养容器，一个完整的基因敲除SR介质适量添加的D - PBS漂洗中期到15 mL锥形管含有细胞悬液。要谨慎，不要分解成单个细胞的细胞团块
9. 离心5分钟沉淀iPSCs的200 XG 15 ml锥形管。
10. 吸上清IPSC的颗粒。 KSR - FF媒介分流比（见表1）适量的重悬沉淀。不要打破细胞团块尺寸更小，因为较小的团块，表面不重视。
    
    请注意：我们建议的第3通道的一个分流比为1:2，iPSCs的IPSC的MEF培养液传代，从直接向KSR - FF培养基。通常情况下，分流比为1:3和1:5之间是适当的，但在1:2传代，确保成馈线的文化适应时需要较高的细胞密度。
11. 电镀Geltrex涂菜的iPS细胞在此之前，吸出剩余的Geltrex解决方案，从预涂的菜，和每个培养皿中慢慢加入适量的细胞悬液。注意：不要冲洗菜之前电镀。
12. 将培养皿中来回方方多次驱散整个表面的菜细胞。轻轻地放置在37℃孵化器的培养皿中，用4至6％，空气_中的CO 2饱和湿度。更换花KSR - FF中每天。

传代人类iPS细胞使用KSR - FF

13. 观察确认70-80％汇合，准备传代细胞在显微镜下完成KSR - FF增长的人类iPS细胞。请参考图1。
    
    注：如果殖民地成为太密或过大，出现分化加剧。
14. 切出来，删除任何区别的IPSC殖民地前传代的文化。
15. 预温的Dispase所需的音量在37℃水浴。所需的卷的详细信息，请参阅下面的表1。
16. 在37℃水浴for15分钟中预平衡KSR - FF所需的量。所需的卷的详细信息，请参阅下面的表1。
17. 从文化的船只使用吸管吸用过的介质，并与D - PBS冲洗细胞两次。
18. 轻轻预热Dispase解决方案添加到培养容器（例如，1毫升每60毫米培养皿Dispase解决方案）。摇动培养容器的整个细胞表面涂层。
19. 3分钟，在37℃孵育培养容器。
20. 从孵化器中取出容器，吸Dispase解决方案，并轻轻的D - PBS洗涤细胞。
21. 轻轻刮去使用细胞刮刀的文化菜表面的细胞，细胞转移到无菌的15ml离心管。
22. KSR - FF冲洗培养皿两次，轻轻的“喷涂”不沾边的任何细胞。池冲洗15ML管细胞的媒介。
23. 在200 XG离心管在室温下5分钟沉淀细胞。
24. 小心吸出，而不会干扰细胞沉淀上清，将它丢弃。
25. 轻轻一抖管完全逐出试管底部的细胞沉淀。
26. 使用5毫升的血清吸管轻轻重悬在预平衡KSR - FF的细胞。不要磨碎。注意：它是在关键的一步，轻轻重悬细胞，而不使用武力，以避免损坏。
27. 细胞转移到一个新的60毫米Geltrex涂层所需的分割比率菜和移动培养皿中来回方方多次分散在其表面的细胞。
28. 与加湿的气氛中，培养皿放置在37℃孵化器4％至6％，空气中_一氧化碳 2 。
29. 第二天，轻轻取代KSR - FF用过的介质，去除细胞碎片。此后更换介质的花费每天。每日观察iPS细胞，通过他们的需要（约每4-5天）。当细胞达到70％至80％汇合的传代是建议。对于iPS细胞的冷冻保存和解冻，参考我们的协议名为“Cryopreserving和人类iPS细胞恢复使用完整的基因敲除血清替代馈线免费中等”。

预期结果

图1下面的图片显示相衬Geltrex涂层的文化，使用完整的基因敲除血清替代馈线免费中等菜种植iPSCs的。 iPSCs的展出形态类似人类胚胎干细胞，细胞核大和缺乏细胞质。 （40X放大倍率）

组件	35毫米菜	60毫米菜	100毫米菜
完整的基因敲除简中​​等	2毫升	4毫升	10毫升
Geltrex解决方案	1毫升	1.5毫升	4-5毫升
Dispase	0.5毫升	1毫升	3-4毫升
D - PBS漂洗	2毫升	4毫升	10毫升

表1。推荐卷

请点击此处，见附录 。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes