מזין ללא עיבוד, התרבות Passaging של תאים שב"ס האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני

Summary

פרוטוקול הבאה מספקת הדרכה והתאמת האדם הנגרמת גזע pluripotent (שב"ס) תאים עד תרבות מזין בחינם באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני (KSR-FF). מותאם פעם, הוראות תחזוקה מתמדת ניתנים גם.

Abstract

הגילוי בשנת 2006 כי fibroblasts האדם העכבר יכול להיות reprogrammed כדי לייצר תאים iPS ^1-3 עם איכויות דומות להפליא בתאי גזע עובריים יצרה מקור חדש בעל ערך של תאים pluripotent עבור גילוי תרופות, טיפול בתא, ואת המחקר הבסיסי.

התקשורת GIBCO ו ריאגנטים להיות בחוד החנית של המחקר תא גזע pluripotent במשך שנים. נוק DMEM בתוספת החלפת נוק סרום הוא התקשורת המועדף על צמיחת תאים גזע עובריים ועכשיו iPS תרבית תאים ^3-9. מערכת זו תקן הזהב לתקשורת כעת ניתן להשתמש עבור תרבות חופשית מזין עם תוספת של SR קוקטייל נוק גורם הגדילה.

ES האדם מסורתית ותרבות iPS שיטות תא דורשים שימוש בעכבר או אדם מזין שכבות פיברובלסטים, או מזין ממוזג בינוני. שיטות אלה הם תרבות עתירי עבודה, קשה בקנה מידה וקשה לשמור על הירכיים תאים שלא עברו התמיינות בשל תנאים מוגדרים. Invitrogen פיתחה SR נוק צמיחה קוקטייל פקטור כדי לאפשר לך בקלות מעבר תרבויות הירכיים שלך לתא מזין חופשית תוך שמירה על השימוש שלך SR נוק.

Protocol

הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.

לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי.

הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות

הערה: ראה נספח לשימוש מנות CELLstart תרבות מצופה

1. One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ"ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ"ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון.
   
   הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים.
2. מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ"ל למנה 35 מ"מ, 1.5 מ"ל למנה 60 מ"מ).
3. חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C.
   
   הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות.
4. לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ - 1 שעה).

הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני

1. כדי להכין 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים.
   
   

   יסוד FGF	10 מיקרוגרם
   D-PBS	990 μL
   10% BSA	10 μL

   
   
   הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה.
2. כדי להכין 50 מ"ל של תמיסת מ"ג / מ"ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
   
   

   Dispase	100 מ"ג
   D-PBS	50 מ"ל

3. כדי להכין 100 מ"ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בינוני בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן.
   
   

   רכיב	במלאי ריכוז	הריכוז הסופי	נפח
   נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012)	-	1X	76.8 מ"ל
   GlutaMAX-I (קט 'מס' 35050-061)	200 מ"מ	2 מ"מ	1 מ"ל
   נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028)	-	20%	20 מ"ל
   נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01)	50X	1X	2 מ"ל
   bFGF (לא קט. PHG0024)	10 מיקרוגרם / מ"ל	20 ng / mL	200 μL

   אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע.
4. רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ"מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ"ל של מדיום KSR-FF להוסיף μL 182 מ"מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות עד שבוע.

התאמת iPSCs ל KSR-FF בינוני

1. לפני שמתחילים, טרום לאזן מאכלים Geltrex שלך מצופה לטמפרטורת החדר בשכונה.
2. תרבות iPSCs על תאים MEF מזין עד שהם ומחוברות 70-80%. נא עיין בהוראות עכבר עובריים פיברובלסטים GIBCO MEF עבור פרוטוקולים מבוססי תרבות.
3. טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש.
4. טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק 'for15 ° C אמבט מים. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש.
5. לשאוב את המדיום מן הכלים התרבות, להוסיף כמות מתאימה של פתרון Dispase. דגירה את הכלים על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
6. לשאוב את הפתרון Dispase מספינת כל תרבות לשטוף את מזין תאים MEF בעדינות עם D-PBS (2 עד 3 פעמים).
7. הוסף את הכמות המתאימה של המדיום בנוקאאוט להשלים SR לכלי כל תרבות. השתמש מגרד התא או פיפטה 5 מ"ל בעדינות כדי לגרד תאים מעל פני השטח של כלי התרבות.
   
   הערה: ראה נספח בפרוטוקולים הסתגלות חלופי להסתגל iPS קווי קשה התא,
8. אסוף את ההשעיה תא מצלחת כל תרבות לתוך 15 צינורות נפרדים חרוטי מ"ל. יש לשטוף את כל כלי תרבות עם כמות מתאימה של המדיום בנוקאאוט להשלים SR, ולהוסיף את D-PBS לשטוף בינוני לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל המכיל את ההשעיה התא. היזהר שלא לשבור את גושי תאים לתוך תאים בודדים
9. צנטריפוגה 15 צינורות חרוטי מ"ל ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה iPSCs.
10. לשאוב supernatant מן גלולה iPSC. Resuspend גלולה בסכום המתאים של המדיום KSR-FF על פי יחס הפיצול (טבלה 1). לא לשבור את גושי התאים לגודל קטן יותר, כי גושים קטנים לא לצרף גם אל פני השטח.
    
    הערה: אנו ממליצים על יחס של 1:02 לפצל את 3 הקטעים הראשונים לאחר iPSCs כבר passaged ישירות בינוני התרבות iPSC MEF עד בינוני KSR-FF. בדרך כלל, יחס לפצל 1:03-01:05 מתאים, אבל passaging בשעה 01:02 מבטיח את צפיפות גבוהה יותר של תאים הדרושים כאשר הסתגלות לתרבות מזין חופשי.
11. לפני ציפוי iPSCs על מנות Geltrex מצופה, לשאוב שיורית פתרון Geltrex מצלחת מראש מצופה, ולאט לאט להוסיף כמות מתאימה של השעיה התא לצלחת כל תרבות. הערה: אין לשטוף כלים לפני ציפוי.
12. הזז את צלחת תרבות הלוך ושוב מצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח של המנה. בעדינות במקום צלחת תרבות 37 ° C חממה עם אווירה humidified של CO 4-6% ₂ באוויר. החלף את המדיום בילה עם KSR-FF כל יום.

Passaging iPS תאים אנושיים באמצעות KSR-FF

13. שים לב iPSCs האדם גדל להשלים KSR-FF תחת מיקרוסקופ כדי לאשר כי התאים הם 70-80% ומחוברות ומוכן להיות subcultured. עיין באיור 1.
    
    הערה: אם המושבות נעשים צפופים מדי או גדול מדי, בידול מוגברת מתרחשת.
14. לגזור והסר מושבות iPSC הבדיל לפני passaging התרבות.
15. טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש.
16. טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק 'for15 ° C אמבט מים. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש.
17. לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS.
18. בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ"ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ"מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו.
19. דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
20. הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS.
21. בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל.
22. יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות "ריסוס את" כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ"ל.
23. צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
24. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו.
25. בעדינות קפיצי הצינור באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור.
26. בעדינות resuspend התאים מראש equilibrated KSR-FF בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגיות. אל triturate. הערה: זה הוא קריטי בשלב כדי resuspend בעדינות את התאים ללא שימוש בכוח כדי למנוע נזק.
27. העברת התאים אל צלחת מתוקים Geltrex מצופה 60 מ"מ ביחס הפיצול הרצוי ולעבור את המנה תרבות הלוך ושוב מצד לצד מספר פעמים כדי לפזר את התאים על פני השטח שלה.
28. מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה עם אווירה של humidified4-6% CO ₂ באוויר.
29. למחרת, בעדינות להחליף את מדיום בילה עם KSR-FF להסיר פסולת התא. החלף את המדיום בילה יום לאחר מכן. שים לב בתאי iPS יומי המעבר אותם לפי הצורך (בערך כל 4-5 ימים). Passaging מומלץ כאשר התאים מגיעים מפגש 70-80%. עבור cryopreservation תא השב"ס הפשרה, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת "Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני".

תוצאות צפויות

באיור 1. הניגוד שלב התמונה שלהלן מציגה iPSCs גדל על Geltrex מצופה מנות התרבות באמצעות נוקאאוט להשלים סרום מזין החלפה ללא בינוני. IPSCs התערוכה מורפולוגיה דומה ל hESCs, המאופיינת גרעינים גדולים הציטופלסמה דלים. (בהגדלה 40X)

רכיב	35mm דיש	60mm דיש	100mm דיש
השלם בנוקאאוט SR בינוני	2 מ"ל	4 מ"ל	10 מ"ל
Geltrex פתרון	1 מ"ל	1.5 מ"ל	4-5 מ"ל
Dispase	0.5 מ"ל	1 מ"ל	3-4 מ"ל
D-PBS עבור שטיפה	2 מ"ל	4 מ"ל	10 מ"ל

טבלה 1. מומלץ כרכים

אנא לחץ כאן כדי לראות את התוספתן .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I		Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement		KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		Cat. no. 21985-023
Dispase		Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes