مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

Summary

هذا البروتوكول وصف بسيط لاصق الشريط النهج القائم على أخذ عينات من البندورة وغيرها من المنتجات الطازجة السطوح ، تليها السريع كشف الخلية بأكملها السالمونيلا باستخدام مضان في الموقع التهجين (FISH).

Abstract

يصف هذا البروتوكول مقاربة بسيطة لاصق الشريط القائم على أخذ عينات من البندورة وغيرها من المنتجات الطازجة السطوح ، تليها على الشريط مضان التهجين في الموضع (FISH) للكشف عن ثقافة مستقلة السريع لSPP السالمونيلا. ويمكن أيضا أشرطة الخلية مشحونة وضعها وجها لأسفل على أجار انتقائية لالصلبة مرحلة تخصيب اليورانيوم قبل الكشف عنها. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التخصيب المنخفضة حجم السائل (السائل miniculture السطح) على سطح الشريط في غير انتقائي مرق ، تليها الأسماك وتحليلها عن طريق التدفق الخلوي. لتبدأ ، يتم إحضارها معقمة شريط لاصق على اتصال مع المنتجات الطازجة ، يتم تطبيق ضغط لطيف ، وإزالة الشريط ، واستخراج جسديا الميكروبات الموجودة على هذه السطوح. هي التي شنت الأشرطة اللاصقة جانب حتى على الشرائح المجهر والزجاج ، ويتم إصلاح الخلايا عينات مع 10 ٪ من الفورمالين (30 دقيقة) والمجففة الايثانول باستخدام سلسلة متدرجة (50 ، 80 ، و 95 ٪ ؛ 3 دقائق كل التركيز). ورصدت المقبل ، الخلية مشحونة مع الأشرطة العازلة التي تحتوي على السالمونيلا التي تستهدف تحقيق DNA الكوكتيل والمهجنة لمدة 15 -- 30 دقيقة عند درجة حرارة 55 مئوية ، يليه موجز شطف الغسيل في منطقة عازلة لإزالة التحقيق غير منضم. ملتصقة ، يتم counterstained ثم الأسماك المسماة الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي صبغ 4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) والنتائج يتم عرضها باستخدام المجهر مضان. الصلبة لمرحلة تخصيب اليورانيوم ، وتوضع الخلايا مشحونة الأشرطة وجها لأسفل على سطح آغار انتقائية مناسبة والمحتضنة للسماح للنمو في الموقع من microcolonies السالمونيلا ، تليها الأسماك والمجهري كما هو موضح أعلاه. miniculture عن سطح السائل ، يتم وضع الخلية اتهم الجانب الأشرطة اللاصقة وحتى يتم تطبيق غرفة نضح سيليكون بحيث الشريط وشكل شريحة المجهر الجزء السفلي من الغرفة الضيقة المياه التي في حجم صغير (≤ 500 ميكرولتر) من فول الصويا Trypticase يتم تقديم حساء (TSB). وأغلقت مداخل ومنافذ يتم تحضين الغرف في 35-37 درجة مئوية ، مما يسمح للنمو القائم على التضخيم من الشريط استخراج الميكروبات. التالية الحضانة ، وتفض مدخل الموانئ ، يتم فصل الخلايا ومختلطة مع عودة قوية وpipetting إيابا ، تحصد عن طريق الطرد المركزي والثابتة في 10 ٪ مخزنة محايدة الفورمالين. أخيرا ، يتم تهجين عينات وفحصها عبر التدفق الخلوي للكشف عن وجود السالمونيلا SPP. كما هو موضح هنا ، يمكن لنا "الشريط FISH" نهج تقديم عينات بسيطة وسريعة والكشف عن السالمونيلا على سطح الطماطم. وقد استخدمنا هذا النهج أيضا لأخذ العينات أنواع أخرى من الفواكه والخضروات الطازجة ، بما في ذلك السبانخ والفلفل جالابينو.

Protocol

1. أخذ العينات السطحية مع لاصق معقم

1. حدد الشريط لاستخدامها لأخذ العينات. الفطريات المتاحة تجاريا أو كون الشريط ومتماسكا ، و. الأشرطة أخذ العينات ومعقمة ومغلفة خصيصا لسهولة الاستخدام ومع ذلك ، فقد وجدنا أنه يمكن أيضا شفافة (واضحة بصريا) الشريط مكتب عامة يمكن استخدامها.
2. استخدام علامة دائمة لرسم المربعات ² 1 سم على الجانب غير لزجة من قطعة 10 سم من شريط لاصق (يمكن استخدام قالب ورقة). هذا سوف يكون بمثابة دليل للمشيرة البصرية التي استخدمت جزء من الشريط لأخذ عينات من سطح الغذاء أو البيئة.
3. تشكيل "جيم" على شكل حلقة من الشريط ، مع الجانب زجة يواجه السطح لأخذ عينات. للقيام بذلك ، اضغط نهايات لزجة مع الابهام والاصبع الوسطى والسبابة موقف ضد مربع رسمها على الظهر (غير لزجة الجانب) من الشريط (الشكل 1).
4. وضع الشريط على السطح لأخذ عينات واضغط بلطف ملحوظ في المنطقة ضد السطح. من دون الافراج عن حواف الشريط ، استخدم السبابة لضمان أن الجانب زجة من الشريط يأتي في اتصال كامل مع سطح العينة ، وتجنب الفقاعات.
5. حتى باستخدام الحركة ، وسحب ببطء بعيدا عن الشريط العينة ، واستخراج جسديا سطح محدد الميكروبات. ربط الشريط الخلية مشحونة ، جنبا لزجة تصل ، على شريحة ميكروسكوب زجاجية باستخدام الشريط عام مكتب شفافة. ضمان التوتر السليم / تمتد من الشريط بحيث يتم إنشاء مسطح ، غير متجعد السطح. وهذا سيساعد على تقليل المشاكل مع تشوه / الشباك من الشريط أثناء التسخين لاحقة خلال التهجين.

2. الصلبة والسائلة مرحلة التخصيب Miniculture بالمتر

1. يتم تنفيذ المرحلة الصلبة التخصيب عن طريق وضع الشريط وجها لأسفل على الزيلوز - يسين Tergitol - 4 (XLT - 4) لوحات أجار بحيث يتم وضع عينات الخلايا في اتصال مباشر مع سطح آغار. يتم وضع قالب جزء الاتصال / عينة من الشريط هو التمسك فضفاضة على السطح آغار واحدة من نهاية الشريط إلى الجدار الجانبي للطبق بيتري لتسهيل إزالة سهلة من الشريط من سطح آغار التالية تخصيب اليورانيوم.
2. هي مقلوب لوحات (لتجنب التكثيف) وحضنت في 35-37 درجة مئوية للسماح للنمو كاف من SPP السالمونيلا. وطول فترة الحضانة اللازمة لتخصيب الخلايا إلى مستوى يمكن اكتشافها تعتمد على مستويات التلوث الأولي السالمونيلا. وقد لاحظنا من ممتازة تشكيل microcolony قائح الأولية منخفضة بعد تخصيب ح 8.
3. بعد فترة التخصيب المطلوب ، افتح لوحة آغار. وسوف تحتفظ الشريط الابتذال في أثناء الحضانة. اضغط برفق الشريط ضد آغار باستخدام السبابة لضمان استرداد أقصى microcolonies شكلت في واجهة الشريط آغار. فهم الشريط من على حافة تعلق على جدار صحن بيتري وإزالته مع حركة بطيئة حتى. تحميل الشريط الخلية مشحونة ، جنبا لزجة تصل ، على شريحة المجهر كما هو موضح في القسم 1.5 أعلاه. انتقل إلى الخطوة "التثبيت والجفاف" أدناه.
4. miniculture عن سطح السائل ، وتبدأ إبزيم الشريط المستخدمة لأخذ العينات على شريحة المجهر كما هو موضح في القسم 1.5 أعلاه. المقبل ، تغطية جزء قالب الاتصال / عينة من الشريط مع غرفة سيليكون نضح غير معقمة (Coverwell ، غريس بيو مختبرات ، وشركة) ، وتشكيل غرفة مغلقة السفلي الذي يتألف من الشريط الخلية المشحونة ، التي تواجه صعودا. بحزم ، ولكن بلطف غرفة الصحافة في مكانها لضمان وجود ختم ماء.
5. استخدام هلام مرنة تحميل ماصة الحافة ، ونقل ≤ 500 مرق الصويا Trypticase ميكرولتر المتوسطة أو غيرها من تخصيب مناسبة من خلال أحد المنافذ مدخل الغرفة الصغيرة. ختم كل من الموانئ مع مكتب الشريط الشفاف لمنع التبخر واحتضان الشرائح في 35 -37 درجة مئوية حسب الحاجة لتخصيب كافية. على الرغم من ضرورة تنفيذ كافة العمليات وفقا للممارسات أخذ العينات والتعامل معها جيدة ، وليس مطلوبا من العقم الميناء ختم الشريط أو دوائر نضح خلال miniculture سطح السائل. ومزيج من السمك والتدفق الخلوي تمكن من تمييز واضح SPP السالمونيلا. من غير المستهدفة البكتيريا التي قد تكون موجودة ، وأكبر مساهمة غير المستهدفة النباتات من المتوقع أن تأتي من العينة نفسها. انتقل إلى الخطوة "التثبيت والجفاف" أدناه.

3. التثبيت والجفاف

1. لأخذ العينات السطحية أو المباشرة لتخصيب المرحلة الصلبة SPP من السالمونيلا. على XLT - 4 آغار ، نفذ على الشريط التثبيت خلية لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 25 مئوية بحلول مخزنة تغطي منطقة الاتصال مع 500 عينة محايد 10 ٪ ميكرولتر الفورمالين.
2. تجاهل تثبيتي في وعاء قابل للغلق (تحت غطاء الكيميائية للحد من التعرض لغضب / السامة بخار).
3. يذوى في سلسلة من الايثانول (50 ٪ و 80 ٪ و 95 ٪ و 300 ميكرولتر / 3 دقيقة كل التركيز). انتقل إلى الخطوة "التهجين" أدناه.
4. لتثبيت من 500 ميكرولتر السائلة سطح العينة minicultureق ، وتفض غرف التروية ، ويستخدم مرنة غيض ماصة هلام التحميل لاستخراج enrichate. يستخدم pipetting السريع صعودا وهبوطا للمساعدة على ضمان الإزالة الفعلية لأية خلايا الشريط متجهة المتبقية.
5. المقبل ، يتم نقل كامل حجم 500 miniculture ميكرولتر لأنبوب microcentrifuge ونسج أسفل في 2000 XG (5 دقائق). يتم تجاهل طاف ، هو vortexed الكرية بقوة من أجل 30-60 ثانية ، ثم معلق في حجم مساو من 10 ٪ محايدة مخزنة الفورمالين. يتم إصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
6. إزالة المقبل ، ومعلق مثبت العينة في خلية تخزين العازلة ، كما يلي. هو نسج العينة إلى أسفل في 2000 XG (5 دقائق و 25 درجة مئوية) يتم تجاهل طاف ، هو vortexed الكرية بقوة لمدة 30 -- 60 ق ، ومعلق في حجم مساو من 50 ٪ غير التشويه والتحريف الايثانول 50 ٪ الفوسفات مخزنة المالحة. ويمكن تخزين الخلايا ثابتة لأجل غير مسمى (عاما) في -20 درجة مئوية. ملاحظة : عندما يتم تغيير السوائل (على سبيل المثال ، عند إدخال العازلة تثبيتي أو مختلفة) ، فمن المهم أن resuspend بدقة (مع vortexing) وبيليه خلية في جزء ضئيل (~ 10-20 ميكرولتر) من "المنتهية ولايته" نظام السائل . وهذا سيساعد على منع تراكمها وضمان الحصول على تعليق حتى الخلايا الفردية. انتقل إلى الخطوة "التهجين" أدناه.

4. تهجين

1. إعداد التهجين / الغسيل العازلة باستخدام التجارية البيولوجيا الجزيئية الصف حلول لوحظ في جدول المواد. تركيزات النهائي المكون العازلة هي كلوريد الصوديوم 0.7 M ، 0.1 M TRIS [8.0 درجة الحموضة] ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل ، تتكون لحجم النهائي المطلوب مع الجزيئية الصف المياه وتصفيتها باستخدام حقنة 0.22 ميكرون أو تصفية الكأس. يستخدم المخزن نفسه ، من دون إضافة تحقيقات (أنظر أدناه) كمنطقة عازلة الغسيل. سخن التهجين وغسل المخازن إلى 55 درجة مئوية.
2. إضافة fluorescently المسمى Sal3 (Nordentoft وآخرون ، 1997 ؛. 5' - AAT TTC ACC CAC TAC GTG - 3 ") وسالم - 63 (Kutter وآخرون ، 2006 ؛. 5' - ACT GAC TCG TTC AGC TCC - 3" ) تحقيقات قليل النوكليوتيد (مواد الجدول) لتهجين محمى العازلة. ويستخدم تركيز التحقيق مجموعه 5 ^-1 ميكرولتر نانوغرام (على سبيل المثال 2.5 نانوغرام لكل ميكرولتر ^-1 التحقيق ؛ بيشة وبريم Stecher ، 2009a).
3. لمباشرة الى الشريط والعينات الصلبة تخصيب المرحلة ، تراكب الاتصال عينة قالب منطقة الشريط مع 300 ميكرولتر من التهجين العازلة التي تحتوي على مزيج التحقيق ويهجن الشريط محدد الخلايا في رطبة ، وغرفة الحضانة مغلقة تعيين إلى 55 درجة مئوية. إذا تم استخدام حاضنة الاتصال المباشر مثل الشرائح صك الخندق المائي (مواد الجدول) ، وتهجين العينات لمدة 15 دقيقة ويمكن معالجته> 20 الشرائح في وقت واحد. إذا تم استخدام الفرن الدوار التهجين الطراز مثل صك بامبينو (مواد الجدول) ، وتوضع الشرائح في 50 مل من أنابيب البولي بروبلين الطرد المركزي لتهجين ، شريحة واحدة في الأنبوب. لأن نقل الحرارة غير مباشرة ، يتم تهجين هذه العينات لفترات أطول (تصل إلى 30 دقيقة).
4. التالية التهجين ، يتم إزالة الشرائح ويتم تجاهل لجنة التحقيق التي تحتوي على العازلة التهجين تراكب. الشرائح ثم يتم إما لفترة وجيزة وتشطف بلطف مع محمى العازلة الغسيل pipetting حجم صغير من المخزن أكثر من شريحة إمالة (3 يشطف من 300 لكل ميكرولتر) ، أو غسلها رسميا (تصل إلى 30 دقيقة) مع أي من تراكب an العازلة أو غسل مسخن الغمر في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 50 مل تحتوي على مسخن العازلة الغسيل. في تجربتنا ، على الرغم من أن يغسل الرسمي سيوفر نتائج أفضل (أقل من التحقيق غير منضم الضباب) ، وشطف بسيطة كافية للكشف عن لبس فيه SPP السالمونيلا. المقبل ، والشرائح هي الهواء المجفف قبل ان ينتقل الى الخطوة "الكشف" أدناه.
5. يتم تنفيذ التهجين عينات من السائل miniculture أسفل السطح الغزل العينات (طازجة ثابتة أو الاحتفاظ بها في التخزين في المخزن -20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق في XG 2000 ، تليها vortexing قوية من بيليه وإعادة تعليق في 100 ميكرولتر العازلة التي تحتوي على التهجين محمى التحقيق كوكتيل. والمهجنة العينات عند درجة حرارة 55 مئوية لمدة 30 دقيقة على كتلة حرارة أو غيرها من محطة الحضانة المناسبة (مواد الجدول) ، تليها إضافة 500 ميكرولتر العازلة غسل مسخن. كما هو الحال مع عينات الشريط ملزمة ، قد تكون هذه العينات يغسل رسميا لمدة تصل إلى 30 دقيقة مع مزيد من الحضانة عند 55 درجة مئوية في هذا المخزن المؤقت يغسل ، مع vortexing متقطعة. بدلا من ذلك ، قد تكون العينات vortexed جيدا بعد إضافة 500 ميكرولتر العازلة غسل مسخن ، تليها مباشرة الحصاد للتحليل (أدناه).
6. في إطار التحضير للكشف عن SPP السالمونيلا. عبر التدفق الخلوي ، يتم نسج عينات السائل miniculture السطح إلى أسفل في 2000 x ج لمدة 5 دقائق ، يتم تجاهل وطاف معلق العينات في درجة حرارة الغرفة 300 ميكرولتر (~ 25 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني. إذا عينات تتطلب النقل إلى منشأة بعيدة ، أو إذا كان يتوقع حدوث تأخير في التهجين بين والتحليل ، قد تكون العينات المبردة أو عقد على الجليد قبل آناتحلل. بدلا من ذلك ، قد يتم نقل العينات الى خلية تخزين العازلة (50:50 خليط من برنامج تلفزيوني والإيثانول المطلق) والذي عقد في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع من دون خسائر ملموسة في التحقيق ، تمنح مضان (بيشة وبريم Stecher ، 2009b) .

5. كشف

1. على الشريط لكشف SPP السالمونيلا. عبر المجهر مضان ، وoverlayed مباشرة إلى الشريط أو صلبة مع عينات تخصيب المرحلة المتوسطة ميكرولتر 10 ~ H - 1200 Vectashield المتصاعدة التي تحتوي على ملون مباين النووية 4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) ، مزودة زلة تغطية ، ثم حضنت في الظلام لمدة 10 دقيقة.
2. يوضع زيت الغمر على زلة تغطية ، ويتم فحص العينات باستخدام هدفا النفط عالية التكبير (63x أو 100X). وسجل استخدام فلتر دابي لإحضار العينة إلى التركيز ، ثم يتم تبديل المجهر لمرشح المناسب (أخضر أو أحمر ، اعتمادا على صبغة تستخدم لتحقيقات في نهاية التسمية) والخلايا السالمونيلا بصريا وفقا لمضان بهم (أرقام 2 و 3).
3. من أجل الكشف عن عينات من السائل cytometric miniculture السطح ، فلا يجوز استخدام الأدوات المختلفة ، اعتمادا على توافر المحلية. في المختبر ، يتم نقل عينات PBS المتوقفة إلى 5 مل من أنابيب أخذ العينات الجولة أسفل دينار بحريني (فالكون) ودرست باستخدام عداد الكريات تدفق FACSCanto مع الإثارة في 647 نانومتر (مواد الجدول). لعينات اليورانيوم التي تحتوي على أعداد كبيرة من البكتيريا الكلي ، يتم استخدام "معدل التدفق المنخفض" الإعداد (10 دقيقة ميكرولتر ^-1) ويتم جمع 5،000-50،000 الأحداث. ويتم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo (الإصدار 8.8.6 ، شجرة نجمة ، وشركة ، آشلاند ، OR) أو غيرها من برامج التحليل مناسبة (الشكل 4 ، والألواح ألف وباء).

6. ممثل النتائج

الشكل 1. استخدام شريط لاصق لأخذ عينات من SPP السالمونيلا. من على سطح الأرض من الطماطم الملوثة صناعيا.

الشكل 2. واستخدمت نتائج نموذجية لمباشرة الى الشريط أخذ العينات والكشف عن السالمونيلا التيفية الفأرية أسماك ATCC 14028 من سطح الطماطم (100 هدف النفط X). الكوكتيل واثنين من ولاية تكساس التحقيق الأحمر المسمى تحقيقات (Sal3/Salm-63) لتسمية هذه الخلايا.

الشكل 3. من السالمونيلا التيفية الفأرية Microcolonies ATCC 14028 شكلت على سطح آغار يسين Tergitol - 4 (XLT - 4) الزيلوز سكر الخشب بعد 8 ساعات على الشريط التخصيب في 37 درجة مئوية وأخذت عينات أولية من اللقاح السطح من الطماطم الملوثة صناعيا. الصلبة مرحلة تخصيب اليورانيوم يزيد من عدد الخلايا المتاحة للكشف عن ويعزز أيضا الخلوية الرنا الريباسي المحتوى.

الشكل 4. استخدام شريط لاصق لأخذ عينات من س. enterica التيفية الفأرية ضرب مصلي من السطح من الطماطم الملوثة صناعيا ، تليها مباشرة عبر تحليل السمكية والتدفق الخلوي (لوحة أ) أو بعد 5 ح غير انتقائية سطح السائل تخصيب miniculture نضح في غرفة مليئة 500 ميكرولتر Trypticase مرق الصويا (لوحة B ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

قد أساليب بسيطة وسريعة للكشف عن مسببات الأمراض على السطوح تنتج مساعدة في تخفيف الأمراض المنقولة بالأغذية من خلال تقديم بيانات آنية وقابلة للتنفيذ. وقد استخدمت لاصق طرق أخذ العينات الشريط القائم في مجال الميكروبيولوجيا البيئية والطبية والغذائية منذ عام 1950 وإشراك ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used