접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

요약

이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을 설명합니다 살모넬라균 형광을 사용하여 현장에서 하이브리드화 (물고기).

초록

이 프로토콜은 살모넬라균 종의 급속한 문화 독립적인 감지를위한 현장 하이브리드화 (물고기)에서 테이프 형광 다음 토마토와 다른 신선한 농산물 표면의 접착 테이프 기반의 샘플링을위한 간단한 방법을 설명합니다. 셀 - 충전 테이프도 검색하기 전에 고체 상 농축을위한 선택적 한천에 얼굴을 아래로 둘 수 있습니다. 또는 낮은 볼륨 액체 enrichments (액체 표면 miniculture)는 유동세포계측법를 통해 물고기와 분석에 의해 다음이 아닌 선택 국물에있는 테이프의 표면에 수행할 수 있습니다. 시작하려면, 살균 접착 테이프는 신선한 농산물과 접촉을 가지고있다, 부드러운 압력이 적용되고 테이프는 실제로 이러한 표면에 존재하는 미생물을 추출, 제거됩니다. 테이프 유리 현미경 슬라이드에 쓰는 쪽까지를 탑재하고 샘플 세포는 포르말린 (30 분)과 탈수 10 % 등급 에탄올 시리즈 (50, 80, 및 95 %, 3 분 각 농도)를 이용하여 고정합니다. 다음 셀 충전 테이프는 살모넬라균 타겟 DNA 프로브 칵테일을 포함하는 버퍼 발견하고 15 hybridized 아르 - 55시 30 분 ° C, 언바운드 프로브를 제거하는 세척 버퍼 린스 간단한 다음. 자기편, 물고기 표시된 전지는 다음 형광 현미경을 사용하여 볼 수있는 DNA 염색 4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 및 결과 counterstained 있습니다. 고체 상 농축 들어, 셀 충전 테이프는 적절한 선택 한천 표면에 얼굴을 아래로 배치하고 위에 설명된대로 피시 앤드 현미경 다음 살모넬라균의 microcolonies의 현장 성장에 수 incubated 수 있습니다. 액체 표면 miniculture 들어, 셀 충전 테이프 끈끈한 측면을 배치하고 실리콘 재관류 챔버 적용되도록 테이프 및 현미경 슬라이드 양식 물이 꽉 챔버로의 하단 Trypticase 콩의 작은 볼륨 (≤ 500 μL) 국물 (TSB)가 도입됩니다. 입구 포트는 봉인되고 회의소는 35 incubated 있습니다 - 37 ° C, 테이프 추출한 미생물의 성장 기반 확대를 수 있도록합니다. 부화 후, 입구 포트 unsealed 있으며, 세포 분리 및 혼합 활발한 뒤로와 앞으로 pipetting, 원심 분리를 통해 수확와 10 %에서 해결된 중성 포르말린 버퍼. 마지막으로 샘플은 hybridized과 살모넬라균 종의 존재를 나타내기 위해 유동세포계측법를 통해 심사하고 있습니다. 여기에 설명한 바와 같이, 우리의 "테이프 - 물고기"접근 방식은 토마토 표면에 간단하고 빠른 샘플링과 살모넬라균의 검출을 제공할 수 있습니다. 또한 시금치와 잘라페노 후추를 포함한 신선한 농산물의 다른 유형을 샘플링이 접근 방식을 사용하고 있습니다.

프로토콜

1. 무균 접착제 테이프로 표면 샘플링

1. 샘플링에 사용하는 테이프를 선택합니다. 상용 곰팡이 - 테이프 또는 콘 - 전술 - 이건 샘플링 테이프 사용의 용이성에 대한 살균 및 특수 포장됩니다. 그러나, 우리는 투명 (광학 취소) 일반 사무실 테이프도 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.
2. 접착 테이프 10cm의 조각 (종이 템플릿을 사용할 수 있습니다)의 비 끈적끈적한 측면에 1cm ^두 사각형을 그릴 수있는 영구 마커를 사용합니다. 이것은 테이프의 부분은 음식이나 환경 표면을 샘플하는 데 사용되었습니다 어떤 지적을위한 시각적인 가이드 역할을합니다.
3. 샘플로 표면을 향하게 쓰는 측면과 "C"모양의 테이프 루프를 형성합니다. 이렇게하려면 뒤로 (비 끈적 쪽) 테이프 (그림 1)에 그려진 사각형에 대한 엄지와 가운데 손가락 및 위치 검지로 쓰는 끝을 잡고.
4. 샘플로 표면에 테이프를 놓고 부드럽게 표면에 대한 표시 영역을 누르십시오. 테이프의 가장자리를 발표하지 않고, 테이프의 끈적한 면이 거품을 피하기 위해, 샘플 표면 전체 접촉할 수 있도록 검지 손가락을 사용합니다.
5. 도 동작을 사용하면, 천천히 신체 표면 바운드 미생물을 추출, 멀리 샘플에서 테이프를 가져옵니다. 일반 투명 사무실 테이프를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에, 셀 충전 테이프, 스티커 측면을 고정. 평면이 아닌 중늙은이 표면이 생성되도록 테이프의 적절한 긴장 / 스트레칭을 보장합니다. 이것은 변형 / 하이브리드화하는 동안 이후의 가열하는 동안 테이프의 컬링 문제를 최소화하는 데 도움이됩니다.

2. 솔리드 - 위상 강화 및 액체 표면 Miniculture

1. 고체 상 농축은 샘플 셀이 한천 표면과 직접 접촉에 배치되도록 자일로 오스 - 라이신 - Tergitol 4 (XLT - 4) 한천 접시에 얼굴을 아래로 테이프를 배치하여 수행됩니다. 테이프 템플릿 / 샘플 접촉 부분은 한천 표면과 테이프의 한쪽 끝을 함께 플러시가 느슨하게 농축 다음 한천 표면에서 테이프의 쉬운 제거를 촉진하기 위해 페트리 접시의 측면 벽을 준수합니다 배치됩니다.
2. 번호판 거꾸로 (결로를 방지하기 위해)와 35 incubated 있습니다 - 37 ° C 살모넬라균 종의 충분한 성장을 허용합니다. 감지 수준으로 세포를 풍요롭게하는 데 필요한 잠복기의 길이는 초기 살모넬라균 오염 수준에 따라 달라집니다. 우리는 8 H 농축 후 낮은 초기 inocula에서 우수한 microcolony 형성을 관찰했습니다.
3. 원하는 강화 기간 후, 한천 플레이트를 엽니다. 테이프는 부화 기간 동안의 tackiness를 유지합니다. 부드럽게 테이프 한천 인터페이스에서 형성된 microcolonies 최대 회복을 보장하기 위해 검지 손가락을 사용하여 한천에 대한 테이프를 누르십시오. 페트리 접시의 벽에 붙어있는 가장자리의 테이프를 파악하고 느린, 심지어 운동으로 제거합니다. 위의 섹션 1.5에서 설명한대로 현미경 슬라이드에 세포 - 충전 테이프, 최대 스티커 측면을 탑재합니다. 아래의 "고정 및 탈수"단계로 진행합니다.
4. 액체 표면 miniculture 들어, 위의 섹션 1.5에서 설명한 것처럼 현미경 슬라이드에 샘플링에 사용되는 테이프를 고정하여 시작합니다. 다음 아래쪽 위쪽을 향하도록 셀 충전 테이프로 구성되어 있습니다 밀폐된 챔버를 형성되지 않은 멸균 실리콘 재관류 챔버 (Coverwell, 그레이스 바이오 연구소, 주식 회사)와 테이프의 템플릿 / 샘플 접촉 부분을 커버. 단호하게, 그러나 부드럽게 방수 도장을 보장하기 위해 장소로 챔버를 누르십시오.
5. 피펫 팁, 전송 ≤ 500 μL Trypticase의 간장 스프 또는 챔버의 작은 입구 포트 중 하나를 통해 다른 적합한 농축 매체를 로딩 유연한 젤을 사용합니다. 35 -37에서 증발하고 품어 슬라이드를 방지하기 위해 투명 사무실 테이프로 두 포트를 봉쇄 ° C 충분한 강화를 위해 필요. 모든 작업이 좋은 샘플링 및 처리 관행에 따라 수행되어야하지만, 포트 밀폐 테이프 또는 재관류 챔버스의 불임은 액체 표면 miniculture 동안 필요하지 않습니다. 피시 앤드 유동세포계측법의 조합은 살모넬라균 종 명백한 차별을 활성화합니다. 샘플 자체에서 온 것으로 기대하지 않는 대상 식물의 가장 큰 공헌과 함께, 현재 수 이외의 대상 박테리아. 아래의 "고정 및 탈수"단계로 진행합니다.

3. 고정 및 탈수

1. 직접 표면 샘플링이나 살모넬라균 종의 견고한 위상 강화를 위해. XLT - 4 한천에 25 30 분 동안 테이프 세포 고정을 수행하면 ° 500 μL 10% 중립과 샘플 연락처 영역을 다루는으로 C는 포르말린 버퍼.
2. sea​​lable 컨테이너 (유해 / 자극적 증기에 노출을 최소화하기 위해 화학 후드 아래)로 정착액을 폐기하십시오.
3. 에탄올 시리즈 (; 300 μL / 3 분 각 농도 50 %, 80 % 95%)에 탈수. 아래의 "하이브 리다이 제이션"단계로 진행합니다.
4. 500 μL 액체 표면 miniculture 샘플의 고정을위한S, 재관류의 여왕님 unsealed 있으며, 유연한 젤 로딩 피펫 팁은 enrichate를 추출하는 데 사용됩니다. 아래 신속하고 pipetting는 모든 나머지 테이프 바운드 세포의 효과적인 제거를 확인하는 데 사용됩니다.
5. 다음 전체 500 μL miniculture 볼륨이 microcentrifuge 튜브로 전송 2,000 XG (5 분)에서 다운 소용됩니다. 뜨는은 삭제됩니다, 펠렛은 다음 10 %의 동일한 볼륨에 resuspended, 30-60 s에 대한 적극적 vortexed입니다 중성 포르말린 버퍼. 세포 ° C. 25시 30 분 수정되었습니다
6. 다음, 정착액 제거 및 샘플이 세포 저장소 버퍼 resuspended이며, 다음과 같은. 60 S, 50 % 이외의 변성 에탄올 50 %의 동일한 볼륨에 resuspended 인산염 - - 샘플은 2000 XG (5 분, 25 ° C) 뜨는가 삭제됩니다, 펠렛가 30 적극적으로 vortexed합니다에서 다운 늘인입니다 염분 버퍼. 고정 전지는 -20 ° C.에서 (년) 무기한으로 저장할 수 있습니다 참고 : 액체가 (예를 들어, 정착액 또는 다른 버퍼를 도입하는 경우) 변경 때마다, 그것은 철저하게 (vortexing 포함) 최소 부분에있는 세포 펠릿 (~ 10-20 μL) resuspend하는 것이 중요하다 "나가는"액체 시스템을 . 이것은 clumping을 방지하고 개별 세포도 suspensions 취득되었는지 확인하는 데 도움이됩니다. 아래의 "하이브 리다이 제이션"단계로 진행합니다.

4. 이종 교잡

1. 상업 분자 생물학 수준의 솔루션 자료 표에 명시된 바와를 사용하여 하이브리드화 / 세탁 버퍼를 준비합니다. 최종 버퍼 구성 요소 농도가 0.7 M NaCl 있으며, 0.1 M 트리스 [산도 8.0], MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산염은 0.22 μm의 주사기 또는 컵 필터를 사용하여 분자 수준의 물 여과와 최종 원하는 볼륨으로 구성되어 10. 프로브 (아래 참조)의 추가없이 동일한 버퍼는 세척 버퍼로 사용됩니다. 앞서 열을 가하다의 하이브리드화 및 55 버퍼를 세척 ° C.
2. 찬란 - 레이블 추가 Sal3 (Nordentoft 외, 1997;. 5' - AAT CAC TTC TAC ACC GTG - 3 ')와 삼 - 63 (Kutter 외, 2006;. 5' - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3' preheated 하이브 리다이 제이션 버퍼) oligonucleotide 프로브 (자료 표). 5 NG μL ^-1 총 프로브 농도는 (; 비샤 및 브렘 - Stecher, 2009a 2.5 NG μL ^-1 각각의 프로브를 예 :)이 사용됩니다.
3. 직접 투 - 테이프 견고한 위상 강화 샘플 들어, 프로브 칵테일을 포함 하이브리드화 버퍼 300 μL와 테이프의 템플릿 샘플 접촉 영역을 중첩하고 55 ° C.으로 설정 습기, 밀폐된 배양 챔버에서 테이프 바운드 세포 잡종 슬라이드 모앗 악기 (자료 표)와 같은 직접 연락 인큐베이터를 사용하는 경우, 샘플은 15 분 hybridized하고> 20 슬라이드 동시에 처리할 수 있습니다. 같은 밤비노 악기 (자료 표)로 로타리 스타일 하이브 리다이 제이션 오븐이 사용하는 경우, 슬라이드가 하이브리드화 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브, 튜브 당 하나의 슬라이드에 배치됩니다. 열전달 직접 아니기 때문에, 이러한 샘플은 더 이상 기간 (최대 30 분)에 대한 hybridized입니다.
4. 하이브리드화 다음, 슬라이드를 제거하고 프로브 함유 하이브리드화 버퍼 오버레이가 삭제됩니다. 슬라이드 preheated 세척 버퍼 오버레이 또는 하나와 다음 (최대 30 분) 중 잠시 부드럽게 기울어져 슬라이드 (300 μL 각 3 rinses)을 통해 버퍼의 작은 볼륨을 pipetting하여 preheated 세척 버퍼 씻어서, 또는 공식적으로 씻어 아르 preheated 세척 버퍼를 포함하는 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브의 침수. 우리의 경험에서, 공식적인 세척이 향상된 결과 (언바운드 프로브에서 적은 헤이즈) 제공하지만, 간단한 헹굼은 살모넬라균 종의 모호하지 탐지에 적합합니다. 다음 슬라이드는 아래의 "검색"단계로 이동하기 전에 공기 건조합니다.
5. 액체 표면 miniculture 샘플 하이브 리다이 제이션은 활발한 펠렛의 vortexing 및 포함된 100 μL preheated 하이브 리다이 제이션 버퍼에 resuspension 다음, 2000 XG에서 5 분 (-20 ° C에서 갓 고정 또는 저장 버퍼에 보관) 샘플을 회전하여 수행됩니다 프로브 칵테일. 샘플은 55 hybridized 아르 ° 500 μL preheated 세척 버퍼의 또한 다음 열 블록 또는 기타 적합한 배양 스테이션 (재료 표), 30 분 C. 테이프 바운드 샘플과 마찬가지로,이 샘플은 공식적으로 대한 씻어 수 있습니다 최대 55에서 추가 배양과 30 분하는 ° 간헐 vortexing이 세척 버퍼에 C. 또한, 샘플은 철저하게 분석을 위해 즉시 수확 (아래)에 의해 다음, 500 μL preheated 세척 버퍼를 추가 후 vortexed 수 있습니다.
6. 살모넬라균 종의 검출을위한 준비. 유동세포계측법 통해 액체 표면 miniculture 샘플은 5 분 2,000 XG에 아래 냈지 있으며, 표면에 뜨는가 무시되고 샘플, 300 μL 상온에서 resuspended 아르 (~ 25 ° C) PBS. 샘플가 먼 시설로 수송해야하는 경우 지연이 하이브리드화 분석 사이에 예상되는 경우, 또는 샘플 전에 아나로 냉장 또는 얼음에서 개최됩니다용해. 또한, 샘플은 셀 저장 버퍼 (PBS와 절대 에탄올의 혼합 50:50)로 전송 및 감지할 수있을 정도의 손실없이 일주일에 최대 -20 ° C에서 개최됩니다 프로브 - 수여 형광 (비샤 및 브렘 - Stecher, 2009b) .

5. 검색

1. 살모넬라균 종의 온 - 테이프 감지. 형광 현미경을 통해, 직접 - 투 - 테이프 또는 고체 위상 강화 샘플은 핵 counterstain 4 포함된 ~ 10 μL Vectashield H - 1200 설치 매체 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI), 커버 슬립과 함께 탑재와 overlayed 아르 다음 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 incubated.
2. 단기 집중 오일 커버 슬립에 배치되며, 샘플은 높은 배율 오일 목표 (63x 또는 100x)를 사용하여 검사하고 있습니다. DAPI 필터가 초점에 샘플을 가지고하는 데 사용됩니다, 현미경은 다음 적절한 필터 (녹색 또는 빨간색, 최종 라벨 프로브에 사용되는 염료에 따라 다름) 및 살모넬라의 세포로 전환됩니다는 (자신의 형광에 따라 시각 득점 아르 피규어 2, 3).
3. 액체 표면 miniculture 샘플 cytometric 검출을위한 다양한 악기 현지 예약 상황에 따라 사용할 수 있습니다. 우리 연구실에서는 PBS - 정지 샘플 5 ML 라운드 바텀 샘플링 튜브 (BD 팔콘)에 양도하고 647 nm의 (자료 표)에서 여기로 FACSCanto 흐름 cytometer를 사용하여 검사하고 있습니다. 총 박테리아의 높은 숫자를 포함하는 풍부한 예제에 대해 "낮은 유량"설정 (10 μL 분 ^-1) 사용되며, 5,000-50,000 이벤트가 수집됩니다. 데이터 FlowJo 소프트웨어 (버전 8.8.6, 나무 스타 (주), 애쉬 랜드, OR) 또는 기타 적합한 분석 소프트웨어 (그림 4, 패널 A와 B)을 사용하여 분석하고 있습니다.

6. 대표 결과

그림 1. 살모넬라균 종의 표본 추출을위한 접착 테이프 중 하나를 사용하십시오. 인위적으로 오염된 토마토의 표면에서.

그림 2. 토마토 (100 X 오일 목적)의 표면에서 직접 - 투 - 테이프 샘플링과 살모넬라균 Typhimurium ATCC 14028의 물고기 탐지를위한 일반적인 결과입니다. 텍사스의 두 프로브 칵테일은 레드 - 라벨 프로브는 (Sal3/Salm-63) 사용되었다 이러한 세포를 분류합니다.

그림 3. 살모넬라균 Typhimurium ATCC 14028의 Microcolonies 37에서 8 H에 테이프 농축 ° C. 후 초기 inoculum은 인위적으로 오염된 토마토의 표면에서 샘플되었습니다 자일로 오스 라이신 Tergitol - 4 (XLT - 4) 한천의 표면에 형성. 고체 상 농축은 탐지에 사용할 세포의 숫자를 증가 또한 셀룰러 rRNA 컨텐츠를 향상시킵니다.

그림 4. S.의 샘플링에 대한 접착 테이프의 사용 enterica serovar Typhimurium 피시 앤드 유동세포계측법 (패널 A)을 통해 500 μL Trypticase 간장 맛을 (패널 B 가득한 재관류 챔버 5 H 아닌 선택적 액체 표면 miniculture 농축 후 직접 분석하여 다음 인위적으로 오염 토마토의 표면에서 ).

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토론

생산 표면에 병원균의 검출을위한 간단하고 빠른 방법은 시의 적절하고 실질적인 데이터를 제공함으로써 식인성 질환을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접착제 테이프 기반 샘플링 방법은 1950 년대 이후, 환경 임상 및 식품 미생물학에서 사용하고 직접 현미경 검사 또는 고체 미디어에 점착 성의 미생물의 양도 다음, 미생물의 제거를위한 표면에 '스카치'스타일 테이프를 눌러 포함되?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used