胶粘剂基于磁带的采样和荧光组合原位杂交快速检测沙门氏菌新鲜农产品

摘要

本协议描述了简单的基于磁带的粘合剂为番茄等新鲜农产品表面取样的方法，全细胞快速检测沙门氏菌用荧光原位杂交（FISH）。

摘要

本协议描述了一个简单的基于磁带的粘合剂番茄等新鲜农产品表面取样的方法，沙门氏菌快速培养独立检测原位杂交（FISH） 技术在磁带上的荧光。细胞收取磁带也可以正面朝下放置在选择性琼脂固相富集前检测。另外，小批量的液体浓缩（液体表面miniculture）上可以执行的磁带表面，其次是鱼，并通过流式细胞仪分析，在非选择性的肉汤。首先，无菌胶带带来接触到新鲜农产品，应用温和的压力，并删除磁带，身体中提取这些表面上的微生物。磁带安装到玻璃显微镜玻片上粘端和采样细胞固定，10％的福尔马林（30分钟），脱水梯度乙醇系列（50，80，和95％;每个浓度3分钟）。下一步，细胞电磁带发现含有沙门氏菌针对性的DNA探针鸡尾酒缓冲区和杂交为15 - 30分钟，在55℃，其次是在洗涤液去除未结合的探针的一个简短的冲洗。贴壁，鱼标记的细胞，然后counterstained DNA染料4',6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI）的结果与用荧光显微镜观看。固相浓缩，细胞带电磁带正面朝下放置在一个合适的选择性琼脂表面，培养沙门氏菌 microcolonies鱼和显微镜如上所述，允许在原位生长。液体表面miniculture，细胞带电磁带放置粘边和硅胶灌注室应用，使磁带和显微镜幻灯片的形式融入其中一个防水室底部的胰酪胨大豆体积小（≤500微升）肉汤（TSB）的介绍。密封进气道和商会孵育在35 - 37℃，允许的磁带中提取的微生物的增长为基础的放大。潜伏期之后，进气道被启封，细胞分离和混合大力回来回移液，通过离心收获并固定在10％中性缓冲福尔马林。最后，样品杂交，并通过流式细胞仪检测， 以揭示沙门氏菌的存在。这里描述的，我们的“大盘鱼”的做法可以提供番茄表面的简单和快速采样和检测沙门氏菌。我们也用这种方法进行取样其他类型的新鲜蔬菜，包括菠菜和墨西哥辣椒。

研究方案

1。表面取样用无菌胶带

1. 选择磁带使用采样。市售真菌磁带或Con轻触采样磁带无菌和易用性，特殊包装。然而，我们发现也可用于透明（透明）通用办公磁带。
2. 使用永久性记号笔画出1厘米²广场上的胶带10厘米的片（一纸模板可用于）非粘性的一面。这将作为一个注意到的磁带部分已用于样品的食物或环境表面的视觉引导。
3. 形成一个“C”形循环的磁带，粘方面临的表面进行采样。要做到这一点，对磁带的背面（非粘性的一面）（图1）的正方形，用拇指和中指和食指的位置举行的粘性末端。
4. 放置在磁带表面进行采样，并轻轻按压表面对标记的区域。不释放磁带的边缘，用食指，以确保磁带的粘端与样品表面的充分接触，避免气泡。
5. 使用更议案，慢慢拉磁带远离样品，身体表面结合的微生物提取。法尔胜细胞电胶带，粘边，使用通用透明办公磁带到玻璃显微镜幻灯片。确保适当的张力磁带/伸展，平坦，不皱面，使创建。这将有助于减少变形/磁带卷曲在随后的加热过程中杂交问题。

2。固相浓缩和液体表面Miniculture

1. 固相富集朝下放置磁带木糖赖氨酸TERGITOL 4（XLT - 4）琼脂平板上，使采样细胞在琼脂表面的直接接触。磁带的接触部分模板/样本被置于与琼脂表面和磁带的一端平齐的是松散地坚持培养皿的侧墙，以方便磁带容易去除琼脂表面以下浓缩。
2. 倒板（以避免水汽凝结），孵育35 - 37 ° C至允许沙门氏菌足够的增长。需要丰富的细胞可检测水平的潜伏期的长短将取决于最初的沙门氏菌污染水平。我们观察到从低初始接种后8小时浓缩优秀microcolony形成。
3. 所需的浓缩铀期后，开放的琼脂平板上。磁带将保留其孵化过程中的粘性。轻轻按下磁带对琼脂，用食指，以确保在磁带琼脂界面形成microcolonies的最大恢复。从附着到培养皿壁的边缘抓住磁带和一个缓慢的，甚至动议删除。装载到载玻片的细胞收取的胶带，粘边，上文第1.5节所述。继续以“固定和脱水”一步。
4. 对于液体的表面miniculture，开始固定到载玻片采样上文第1.5节所述使用的磁带。下一步，包括磁带的模板/样本接触与非无菌硅胶灌注室（Coverwell，格雷斯生物实验室公司）的部分，形成一个密封腔，其底部是由细胞电磁带，朝上。牢固，但轻轻按入到位室，以确保防水密封。
5. 使用灵活的凝胶装载枪头，转移≤500μL胰酪胨大豆肉汤或其他合适的浓缩液通过商会的小进气道。透明办公胶带密封两个端口，以防止蒸发和孵化的幻灯片，在35 -37 ° C的需要足够的浓缩铀。虽然所有操作应根据良好的采样和处理方法，不育的端口密封胶带或灌注井不需要在液体表面miniculture。鱼和流式细胞仪的结合，将使沙门氏菌明确的歧视。从非目标细菌可能存在与预期来自样品本身的非目标植物的贡献最大，。继续以“固定和脱水”一步。

3。固定和脱水

1. 对于直接表面取样或固相富集沙门氏菌 。 XLT - 4琼脂培养基上，进行磁带上的细胞固定在25分钟30 °彗星样本的接触面积覆盖500μL，10％中性福尔马林。
2. 丢弃到一个密封的容器（下化学罩，以尽量减少接触刺激性/有毒蒸气）的固定液。
3. 脱水乙醇（50％，80％和95％;每个浓度300μL/ 3分钟）。继续进行“杂交”的步骤下面。
4. 500μL液体表面miniculture样品固定S，灌注商会启封，和一个灵活的凝胶装枪头是用来提取enrichate。用于快速向上和向下吹打，以帮助确保有效去除任何剩余磁带绑定细胞。
5. 接下来，整个500μLminiculture量转移到离心管和纺2,000 XG（5分钟）。丢弃上清液，沉淀振荡大力30-60小号，然后悬浮在同等体积的10％中性缓冲福尔马林。细胞是固定的25 ° C时为30分钟
6. 接下来，固定液和样品悬浮细胞存储缓冲区，如下所示。该样本是2,000 XG（5分钟，25 ° C）被丢弃上清液，沉淀是振荡30大力 - 60秒，在同等体积的50％的非变性乙醇50％的重悬于磷酸盐降速，缓冲液。固定细胞，可以无限期地储存在-20 ° C（年）注：每当液体被改变（例如，当引入固定液或不同的缓冲区），重要的是彻底重悬（震荡）在一个最小的部分的细胞沉淀（约10 - 20μL）“传出”液体系统。这将有助于防止结块，并确保获得，甚至单个细胞悬浮液。继续进行“杂交”的步骤下面。

4。杂交

1. 准备杂交/洗涤缓冲液使用的商业分子生物学级解决方案在材料表中注明。最后的缓冲组件的浓度为0.7 M氯化钠，0.1中号的TRIS pH值8.0，10 mM的EDTA，0.1％十二烷基硫酸钠，分子级的水和使用0.22微米的注射器或一杯过滤筛选，最终所需的量。使用相同的缓冲区，没有探头（见下文）此外，作为洗涤液。预热杂交和洗涤缓冲液至55 ° C。
2. 加入荧光标记的Sal3（Nordentoft 等，1997; 5' -亚洲空运中心CAC TTC ACC交咨会的GTG - 3'）的Salm - 63（Kutter 等，2006; 5' - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3“ ）寡核苷酸探针（材料表）预热杂交缓冲。一个5毫微微升^-1的总探针浓度（如2.5毫微^微升 -1每个探头;碧沙和布雷姆-施特彻，2009A） 。
3. 对于直接到磁带和固相浓缩样本，覆盖300μL杂交缓冲区包含探头鸡尾酒磁带的模板样本的接触面积，并在潮湿，密封的孵化室设置为55 ° C杂交磁带势必细胞如果直接接触的孵化器如幻灯片护城河仪器（材料表）用于杂交，样品为15分钟，可以同时处理> 20张幻灯片。如果一个小孩的仪器（材料表），如旋转式杂交炉，幻灯片置于50 mL聚丙烯离心管中进行杂交，每管幻灯片。由于不是直接传热，这些样品是杂交更长的时间（最多30分钟）。
4. 杂交之后，被删除的幻灯片和含探针的杂交缓冲覆盖被丢弃。幻灯片然后预热洗涤液覆盖或预热洗涤液冲洗简单地，轻轻地吹打在一个倾斜的幻灯片（3 300μL，每冲洗）体积小的缓冲，或正式洗净（最多30分钟）浸泡在含有预热洗涤液50 mL聚丙烯离心管。根据我们的经验，虽然正式洗会提供更好的结果（未结合的探针阴霾），一个简单的冲洗是足够明确的检测沙门氏菌 。下一步，幻灯片移动到下面的“检测”步骤之前，空气干燥。
5. 纺纱2000 XG 5分钟的样品（新鲜固定或存储缓冲区保存在-20 ° C）是由液体表面miniculture样品的杂交，大力振荡的沉淀和再悬浮在100μL预热的杂交含有缓冲区探头的鸡尾酒。样品进行杂交，在55 ° C为30分钟加500μL预热的洗涤液，在热块或其他合适的孵化站（材料表）。用胶带绑定的样品，这些样品可能是正式洗进一步孵化到30分钟，55 °在这个间歇振荡的洗涤缓冲液，C。此外，样品可能会彻底振荡后加入500μL预热的洗涤液，立即进行分析收获（下图）。
6. 在沙门氏菌检测的准备。通过流式细胞仪，液体表面miniculture样品纺在2000 XG 5分钟，取上清液丢弃，样品重悬于300μL室温（〜25 ° C）PBS。如果样品需要运输到遥远的设施，或延迟预期之间的杂交和分析，样品可冷藏或冰面上举行前以ANA裂解。此外，样品可能会转移到细胞储存的缓冲液（50:50 PBS和无水乙醇混合），在-20 ° C，没有明显的损失探头一个星期举行，赋予荧光（碧沙和布雷姆 - 施特彻，2009b） 。

5。检测

1. 磁带上的沙门氏菌的检测。通过荧光显微镜，直接到磁带或固体阶段浓缩样本覆盖〜10μLVectashield的H - 1200安装含有核染液4的媒介“,6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI）的安装，盖玻片，然后在10分钟的黑暗孵育。
2. 浸油放在盖玻片，使用高倍率的油浸物镜（63X或100X）和样品检验。的DAPI过滤器是用来将成为关注的焦点样品，然后切换到适当的过滤器（绿色或红色，取决于结束标签的探头使用的染料）和沙门氏菌细胞显微镜取得视觉根据其荧光（图2和3）。
3. 液体表面miniculture样品的流式细胞仪检测，各种仪器可以使用，这取决于当地的可用性。在我们的实验室，PBS暂停样品转移到5 mL圆底采样管（BD猎鹰），并用一个FACSCanto流式细胞仪在647纳米（材料表）的激发。对于丰富的样品含有高数量的细菌总数，使用“低流量”设置（10μL ^分钟-1）和5,000-50,000事件收集。数据分析使用FlowJo软件（版本8.8.6，树星公司，亚什兰，或）或其他合适的分析软件（图4，面板A和B）。

6。代表性的成果

图1。胶带使用沙门氏菌抽样。从表面人为污染的番茄。

图2。直接到磁带的采样和一个西红柿的表面（100 ×油浸物镜）鱼鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028检测的典型结果。得克萨斯的两个探头鸡尾酒红色标记的探针（Sal3/Salm-63）标签，这些细胞。

图3。鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 Microcolonies木糖赖氨酸TERGITOL - 4（XLT - 4）琼脂表面上形成初始接种后8小时的磁带上浓缩在37 ° C是从人为污染的西红柿的表面采样。固相浓缩，增加检测细胞的数目，也增强了细胞的rRNA的内容。

图4。胶带使用S 的采样鼠伤寒沙门从表面通过鱼类和流式细胞仪（A组）或5 h的非选择性液体的表面，在与500μL，胰酪胨大豆肉汤（B组填补了灌注腔miniculture浓缩后直接分析，人为污染的番茄）。

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讨论

检测产生表面上的病原体的简单快速的方法可以帮助减轻食源性疾病，提供及时的和可操作的数据。胶粘剂基于磁带的抽样方法已用于环境，临床和食品微生物学自1950年以来涉及按下“苏格兰”式磁带的表面去除的微生物，由直接的微观考试或附着的微生物为固体介质转移增长（Barnetson和米尔恩，1973年，爱德华兹和哈特曼，1952年; Evancho等，2001;丰等，1980; Lakshmanan提供夏弗纳?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used