Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

Резюме

Этот протокол описывает простую клей-ленты на основе подход к отбору проб из помидоров и другой свежей поверхности продукции, с последующим быстрым целом обнаружения ячейки Сальмонеллы С помощью флуоресцентной На месте Гибридизации (FISH).

Аннотация

Этот протокол описывает простой подход для клея-ленты на основе выборки из помидоров и других свежих поверхностей производят, а затем на ленту флуоресценции в гибридизация (FISH) для быстрого культуры независимой обнаружения бактерии рода сальмонелла. Сотовые заряженные ленты могут также быть помещены лицевой стороной вниз на селективном агаре для твердофазной обогащения до обнаружения. Кроме того, низкие объемы жидкости обогащения (жидкие miniculture поверхности) могут быть выполнены на поверхности ленты в неселективных бульон, а затем FISH и анализ с помощью проточной цитометрии. Во-первых, стерильные клейкой ленты приводят в контакт со свежими продуктами, нежное давление применяется, и лента удаляется, физически извлечения микробы присутствуют на этих поверхностях. Ленты крепятся липкой стороной вверх на предметные стекла микроскопа и стекла пробы клетки фиксировали 10%-ного формалина (30 мин) и обезвоженной использованием градуированных серии этаноле (50, 80 и 95%; 3 мин каждой концентрации). Затем клетка заряженные ленты пятнистый с буфером, содержащим Salmonella ориентированных коктейль ДНК-зонда и гибридизовали в течение 15 - 30 мин при 55 ° С с последующим кратким полоскания в стиральной буфера для удаления несвязанного зонда. Приверженец, FISH-меченых клеток, затем контрастно с ДНК красителя 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), а результаты просматривать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для твердой фазы обогащения, сотовые заряженные ленты расположены лицевой стороной вниз на подходящей поверхности селективного агара и инкубировали, чтобы на месте рост сальмонелл микроколоний, а затем FISH и микроскопии, как описано выше. Для жидких miniculture поверхности клеточной взимается ленты размещены липкой стороной вверх и камеры силиконовые перфузии применяется таким образом, чтобы лента и стекло микроскопа форма нижней части водонепроницаемую камеру, в которой малый объем (≤ 500 мкл) Trypticase Соевый Отвар (БСЭ) вводится. Впускные отверстия герметизируются и камер инкубируют при 35 - 37 ° C, что позволяет на основе роста усиления ленты экстрагировали микробов. После инкубации, впускные порты распечатал, клетки отделяются и смешивается с энергичным и обратно пипетки, собранных с помощью центрифугирования и фиксировали в 10% нейтральный буферный формалин. Наконец, образцы гибридизированных и исследовали с помощью проточной цитометрии выявить наличие бактерии рода сальмонелла. Как описано здесь, наш «Лента-FISH" подход может обеспечить простой и быстрый отбора проб и обнаружения сальмонеллы в томатном поверхностей. Кроме того, мы использовали этот подход для отбора проб другие виды свежих продуктов, включая шпинат и халапеньо перец.

протокол

1. Поверхность выборки с Стерильные клейкая лента

1. Выберите ленту использовать для отбора проб. Имеющихся в продаже грибов-Tape или контакт-It выборки ленты стерильные и специально упакованы для простоты использования. Тем не менее, мы обнаружили, что прозрачный (оптически прозрачный) общие ленты офиса может также использоваться.
2. Используйте маркер, чтобы нарисовать 1 см ^{2 площади} на нелипкую стороной 10 см кусок клейкой ленты (бумажный шаблон может использоваться). Это будет служить руководством для визуального отметить, какая часть ленты была использована для образцов пищи или окружающей среды поверхности.
3. Форма "С"-образная петля ленты, с липкой стороной к поверхности, чтобы быть в выборку. Для этого, удерживая липкие концы с большого и среднего пальца и положение указательного пальца против обращается квадрат на спине (не клейкой стороной) на кассету (рис. 1).
4. Место ленты на поверхность, чтобы быть отобраны и слегка нажмите выделенную область на поверхность. Не отпуская края ленты, используйте указательный палец, чтобы липкая сторона ленты происходит в полном контакте с поверхностью образца, избегая пузырей.
5. Использование даже движения, медленно потяните ленту от образца, физически извлечения поверхностно-связанной микробов. Закрепите клеточной взимается ленты, липкой стороной вверх, на предметное стекло микроскопа с использованием общих прозрачная лента офиса. Обеспечить надлежащее напряжение / растяжение ленты так, чтобы плоская, без морщинистой поверхностью создается. Это поможет свести к минимуму проблемы с деформацией / свертывания ленты во время последующего нагрева при гибридизации.

2. Твердофазные обогащению и жидких Miniculture поверхности

1. Твердофазные обогащения осуществляется путем размещения ленты лицевой стороной вниз на ксилозы-лизин-Tergitol 4 (XLT-4) агаром, чтобы пробы клетки находятся в непосредственном контакте с поверхности агара. Шаблонный / образец контакт часть ленты находится вровень с поверхностью агара и один конец ленты свободно придерживаться боковой стенке чашки Петри для облегчения удаления ленты от поверхности агара следующие обогащения.
2. Плиты перевернутый (чтобы избежать конденсации) и инкубировали при 35 - 37 ° С тем чтобы обеспечить достаточное рост бактерии рода сальмонелла. Длина инкубационного периода, необходимые для обогащения клетки обнаруживаются уровне будет зависеть от начального уровня загрязнения сальмонеллой. Мы наблюдали отличное образование микроколоний с низкой начальной инокулята через 8 ч обогащения.
3. После обогащения желаемого периода, открытых агар пластины. Лента сохранит свою липкость во время инкубации. Аккуратно нажмите лента против агар использовании указательного пальца для обеспечения максимального извлечения микроколоний формируется на ленту-агар интерфейс. Возьмите ленту с краем прикреплен к стене чашку Петри и удалить его с медленным, даже движения. Горы клеточной взимается ленты, липкой стороной вверх, на стекло микроскопа, как описано в разделе 1.5 выше. Перейдите к разделу "Фиксация и обезвоживание" ступеньку ниже.
4. Для жидких miniculture поверхности, начать с крепления ленты используются для отбора проб на предметное стекло, как описано в разделе 1.5 выше. Затем крышку шаблонных / образец контакт часть ленты с нестерильных силиконовые перфузии камеры (Coverwell, Грейс Био-Labs, Inc), образуя герметичную камеру, дно которой состоит из клеточной взимается ленты, вверх. Крепко, но аккуратно нажмите камеру на место, чтобы обеспечить уплотнение водонепроницаемыми.
5. Использование гибких гель загрузкой пипетки, передача ≤ 500 мкл Бульон Соевый Trypticase или другой подходящей среде обогащения с помощью одного из малых портов камеры на входе. Печать оба порта с прозрачной лентой офис для предотвращения испарения и инкубировать слайды на 35 -37 ° C, сколько необходимо для достаточного обогащения. Хотя все операции должны выполняться в соответствии с надлежащей практикой отбора и обработки, стерильность порта уплотнительную ленту или перфузии камер не требуется в течение жидкой miniculture поверхности. Сочетание FISH и проточной цитометрии позволит ясно дискриминации бактерии рода сальмонелла. от нецелевых бактерии, которые могут присутствовать, с наибольший вклад нецелевых флоры ожидаются из самого образца. Перейдите к разделу "Фиксация и обезвоживание" ступеньку ниже.

3. Фиксация и обезвоживание

1. Для прямой отбор проб поверхностных или для твердых обогащение фазы бактерии рода сальмонелла. на XLT-4-агар, выступать на ленту фиксации клеток в течение 30 мин при 25 ° С, покрывая площадь образца контакт с 500 мкл 10% нейтральный буферный формалин.
2. Отменить фиксатором в герметичный контейнер (под капотом химические сведения к минимуму воздействия раздражающих / токсичных паров).
3. Дегидрировать в серии этанола (50%, 80% и 95%; 300 мкл / 3 мин каждой концентрации). Перейдите к разделу "гибридизации" ступеньку ниже.
4. Для фиксации 500 мкл жидкого образца miniculture поверхностис, перфузии камеры распечатал и гибкий гель загрузкой пипетки используется для извлечения enrichate. Быстрое вверх и вниз пипетирования используется, чтобы помочь в обеспечении эффективного удаления каких-либо оставшейся ленты связанного клеток.
5. Далее, все 500 мкл объема miniculture передается микроцентрифужных трубки и остановлен на 2000 мкг (5 мин). Супернатант отбрасывается, осадок перемешивают энергично в течение 30-60 с, затем ресуспендировали в равном объеме 10% нейтральный буферный формалин. Клетки фиксированной в течение 30 мин при 25 ° C.
6. Далее, фиксирующий удаляется и образец ресуспендировали в ячейку буферной памяти, следующим образом. Образец остановлен на 2000 мкг (5 мин, 25 ° С) супернатант отбрасывается, осадок перемешивают энергично в течение 30 - 60 с, ресуспендировали в равном объеме 50% неденатурированный этиловый спирт-50% фосфатов буферный солевой раствор. Фиксированные клетки могут храниться бесконечно (лет) при температуре -20 ° C. Примечание: Каждый раз, когда жидкости изменяется (например, при введении фиксирующие или различные буфера), важно тщательно ресуспендируют (с вортексе) осадок клеток в минимальном часть (~ 10 - 20 мкл) "исходящих" жидкостной системой . Это поможет предотвратить слипание и гарантируют, что даже суспензии отдельных клеток получаются. Перейдите к разделу "гибридизации" ступеньку ниже.

4. Гибридизация

1. Подготовка гибридизации / мойка буфера с помощью коммерческих молекулярной биологии класса решений отмечено в таблице материалов. Заключительные концентрации компонентов буфера 0,7 М NaCl, 0,1 М Трис [рН 8,0], 10 мМ ЭДТА, 0,1% додецилсульфата натрия, доливают до окончательного желаемого объема с молекулярно-класса водой и фильтруется с помощью шприца 0,22 мкм или чашка фильтра. Этот же буфер, без добавления зондов (см. ниже) используется в качестве моющего буфера. Разогреть гибридизации и стиральные буферов до 55 ° C.
2. Добавить флуоресцентно меченных Sal3 (Nordentoft и др., 1997;. 5'-ААТ CAC TTC АКК TAC GTG-3 ') и Salm-63 (Куттер и др., 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) олигонуклеотидных зондов (Материалы таблицу) на разогретой буфером гибридизации. Общая концентрация зонда 5 нг мкл ^{-1 используется} (например, 2,5 нг мкл ^-1 каждый зонд; Биша и Брем-Stecher, 2009a).
3. Для прямого-лента и твердых образцов фазы обогащения, наложение шаблонных площадь контакта образец ленты с 300 мкл буфера, содержащего гибридизации зонд коктейль и гибридизации ленты связанного клеток в влажной, герметичной камере инкубации набор до 55 ° C. Если прямой контакт инкубатор, такие как инструмент Слайд Ров (Материалы таблицы) используется, образцы гибридизированных в течение 15 мин и> 20 слайдов могут быть обработаны одновременно. Если роторно-стиль гибридизации духовке, такие как инструмент Бамбино (по материалам таблицы) используется, слайды расположены в 50 мл полипропиленовые трубы для центрифуг гибридизации, одного слайда в трубке. Поскольку перенос тепла не является прямым, эти образцы гибридизированных на более длительный срок (до 30 мин).
4. После гибридизации, слайды удаляются и зонд содержащих гибридизации буфера наложения отбрасывается. Слайды то либо кратко и осторожно промыть разогретой промывочного буфера с помощью пипетки небольшой объем буфера более наклонена слайд (3 полоскания в 300 мкл каждой), или формально промывают (до 30 мин), либо с наложением разогретой буфера мытья или Погружение в 50 мл трубки полипропилена центрифуги содержащие разогретой буфера стирки. По нашему опыту, хотя формального мыть обеспечит более высокие результаты (меньше дымка от несвязанного зонда), простые полоскания достаточно для однозначного обнаружения бактерии рода сальмонелла. Далее, слайды сушат на воздухе, прежде чем перейти к "Обнаружение" ступеньку ниже.
5. Гибридизация жидких проб miniculture поверхности осуществляется за счет остановки образцов (свеже-фиксированные или хранятся в буфере хранения при температуре -20 ° С) в течение 5 мин при 2000 мкг, а затем энергично вортексе из гранул и ресуспендирования в 100 мкл буфера разогретой гибридизации содержащие Зонд коктейль. Образцы гибридизированных при 55 ° С в течение 30 мин на блок тепла или другой подходящей станции инкубации (материалы см. таблицу), с последующим добавлением 500 мкл буфера разогретой стирки. Как и в ленте связанного образцов, эти образцы могут быть формально мыть в течение до 30 мин с последующей инкубации при температуре 55 ° C в этом промывочный буфер, с прерывистым вортексе. Кроме того, образцы могут быть тщательно перемешивают после добавления 500 мкл буфера разогретой стирки, с последующим немедленным уборки для анализа (см. ниже).
6. В ходе подготовки к выявлению бактерии рода сальмонелла. с помощью проточной цитометрии, жидких проб miniculture поверхности остановлен на 2000 мкг в течение 5 мин, надосадочную жидкость отбрасывается и образцы ресуспендируют в 300 мкл комнатной температуре (~ 25 ° C) PBS. Если образцы требуют транспорта в далеком объекта, или если задержка, как ожидается, между гибридизации и анализа, образцы могут хранить в холодильнике или находящиеся на льду до анализиса. Кроме того, образцы могут быть переданы в ячейку хранения буфера (50:50 смеси PBS и абсолютного этилового спирта) и выдерживают при температуре -20 ° С до недели без заметных потерь в зонд-возложенных флуоресценции (Биша и Брем-Stecher, 2009b) .

5. Обнаружение

1. Для на-ленту обнаружения бактерии рода сальмонелла. с помощью флуоресцентной микроскопии, прямо к ленте или твердых образцов фазы обогащения наложенных с ~ 10 мкл Vectashield H-1200 монтаж среде, содержащей ядерные контрастирующая 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), установленного с покровным стеклом, затем инкубировали в темноте в течение 10 мин.
2. Погружение нефти находится на покровное стекло, и образцы изучены с помощью высоким увеличением нефти цели (63x или 100x). DAPI фильтр используется для внесения образца в фокусе, микроскоп, затем переключился на соответствующий фильтр (зеленого или красного цвета, в зависимости от красителя используется для конечного этикетке зондов) и сальмонеллы клетки оцениваются визуально по их флуоресценции (рис. 2 и 3).
3. Для цитометрии обнаружения жидких проб miniculture поверхности, различные инструменты могут быть использованы, в зависимости от наличия в конкретном регионе. В нашей лаборатории, PBS-приостановлены образцы передаются в 5 мл круглым дном выборки труб (BD Falcon) и изучены с помощью цитометра FACSCanto потока с возбуждения при 647 нм (Материалы таблицу). Для обогащенных образцов, содержащих большое число от общего числа бактерий, "низкий расход" настройки (10 мкл мин ^-1) используется и 5,000-50,000 событий собираются. Данные анализируются с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 8.8.6, Дерево Star, Inc, Ashland, OR) или другое подходящее программное обеспечение для анализа (рис. 4, панелей и В).

6. Представитель Результаты

Рисунок 1. Использование клейкой ленты для отбора проб бактерии рода сальмонелла. с поверхности искусственно загрязненных помидор.

Рисунок 2. Типичные результаты для прямой-лента отбора проб и FISH обнаружения сальмонеллы Typhimurium АТСС 14028 от поверхности томатный (100 X нефти цель). Двухзондовой коктейль из Texas Red-меченых зондов (Sal3/Salm-63) был использован для обозначения этих клеток.

Рисунок 3. Микроколонии сальмонеллы Typhimurium АТСС 14028 формируются на поверхности Ксилоза Лизин Tergitol-4 (XLT-4) агара после 8 часов на ленту обогащения при температуре 37 ° C. начального инокулята был пробы с поверхности искусственно загрязненных помидор. Твердофазные обогащение увеличивает количество клеток для обнаружения, а также повышает клеточный содержание рРНК.

Рисунок 4. Использование клейкой ленты для отбора проб С. enterica серовар Typhimurium от поверхности искусственно загрязненных помидор, а затем с помощью прямого анализа FISH и проточной цитометрии (панель) или после 5 часов неселективным жидким обогащения miniculture поверхности в перфузионной камере, наполненной 500 мкл Trypticase соевом бульоне (группа В ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Простые и быстрые методы для обнаружения патогенов на производство поверхности могут помочь смягчить болезней пищевого происхождения путем предоставления своевременной и актуальной информации. Скотч основе методов выборки были использованы в экологические, клинические и микробио?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used