שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל תא סלמונלה באמצעות פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH).

Abstract

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה עבור דגימה דבק, סרט המבוסס על עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו הקרינה על הקלטת הכלאה באתרו (FISH) לאיתור תרבות עצמאית מהירה של Salmonella spp. קלטות תא טעון גם יכול להיות ממוקם עם הפנים כלפי מטה על אגר סלקטיבי להעשרת מוצק שלב לפני זיהוי. לחלופין, בנפח נמוך enrichments נוזלי (miniculture פני הנוזל) יכול להתבצע על פני השטח של הקלטת במרק הלא סלקטיבי, ואחריו דגים ניתוח באמצעות cytometry הזרימה. כדי להתחיל, דבק סטרילי מובא במגע עם תוצרת טרייה, לחץ עדין מוחל, ועל הסרט מוסר, פיזית לחילוץ חיידקים המצויים על גבי משטחים אלה. קלטות מורכבים דביקות בצד לעלות על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית התאים שנדגמו הם קבועים עם 10% פורמלין (30 דקות) ו מיובש באמצעות סדרה אתנול מדורגים (50, 80, ו - 95%; 3 דקות כל ריכוז). לאחר מכן, התא טעון קלטות הם הבחינו עם חוצץ המכיל סלמונלה במיקוד DNA קוקטייל בדיקה הכלאה במשך 15 - 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס, ואחריו קצר לשטוף במאגר כביסה להסיר בדיקה מאוגד. חסיד, דגים שכותרתו תאים counterstained מכן עם ה-DNA לצבוע 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) והתוצאות שנצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להעשרת מוצק שלב, תא מטען קלטות ממוקמים עם הפנים כלפי מטה על משטח מתאים אגר סלקטיבי וטופחו על מנת לאפשר צמיחה באתרו של microcolonies סלמונלה, ואחריו דגים מיקרוסקופיה כמתואר לעיל. עבור miniculture פני הנוזל, תא מטען קלטות ממוקמים בצד הדביק למעלה וחדר זלוף סיליקון מוחל כך את הקלטת שקופיות מיקרוסקופ טופס התחתון של תא מים חזק שלתוכו נפח קטן (≤ 500 μL) של Trypticase סויה מרק (TSB) הוא הציג. יציאות כניסת חתומות ותאי מודגרת ב 35-37 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר צמיחה המבוססת על הגברה של קלטת חילוץ חיידקים. לאחר דגירה, יציאות כניסת אינן חתומות, תאים מנותקים מעורב עם הגב נמרץ ושוב pipetting, שנקטפו באמצעות צנטריפוגה ותוקנו ב -10% ניטרלית שנאגרו פורמלין. לבסוף, דוגמאות הכלאה ובדק באמצעות זרימת cytometry לגלות נוכחות של סלמונלה spp. כפי שתואר כאן, שלנו "קלטת FISH" הגישה יכולים לספק דגימה פשוטה ומהירה וזיהוי של סלמונלה על משטחים עגבניות. יש לנו גם השתמשו בגישה זו הדגימה סוגים אחרים של תוצרת טרייה, כולל תרד ופלפלים חריפים.

Protocol

1. משטח דגימה עם דבק סטרילי

1. בחר קלטת לשימוש הדגימה. זמינים מסחרית פטריות קלטת או Con-תאקט, זה קלטות הדגימה סטרילי ארוז במיוחד וקלות השימוש. עם זאת, מצאנו כי הקלטת שקוף (ברור אופטית) משרד גנריות יכול לשמש גם.
2. השתמש בטוש בלתי מחיק לצייר ריבועים 1 ² ס"מ בצד הלא דביק של חתיכה 10 ס"מ של נייר דבק (תבנית הנייר יכול לשמש). זה ישמש כמדריך חזותי לציין באיזה חלק של הסרט נעשה שימוש במדגם השטח מזון או סביבתיים.
3. טופס "C" בצורת לולאה של סרט, עם הצד הדביק מול פני השטח להיות שנדגמו. כדי לעשות זאת, החזק את קצוות דביקים עם האגודל והאצבע האמצעית עמדת האצבע על הכיכר נמשך על הגב (לא דביק בצד) של הקלטת (איור 1).
4. הניחו את הקלטת על פני השטח להיות שנדגמו ולחץ בעדינות את האזור המסומן נגד פני השטח. מבלי לשחרר את הקצוות של הסרט, השתמש האצבע כדי להבטיח את הצד הדביק של הקלטת בא במגע מלא עם משטח המדגם, הימנעות בועות.
5. שימוש בתנועה אפילו לאט למשוך את הקלטת מן המדגם, פיזית חילוץ משטח הנכנס חיידקים. הדקו את הקלטת תא מטען, הצד הדביק למעלה, גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות משרד הגנרית סרט שקוף. ודאו כי המתח הנכון / מתיחה של הקלטת כך שטוח, ללא המקומט משטח נוצר. זה יעזור לצמצם בעיות עם דפורמציה / סלסול של הקלטת במהלך החימום הבאים במהלך ההכלאה.

2. מוצק שלב העשרה Miniculture פני הנוזל

1. שלב מוצק העשרה מבוצע על ידי הצבת את הקלטת עם הפנים כלפי מטה על קסילוז-ליזין Tergitol-4 (XLT-4) צלחות אגר כך התאים שנדגמו ממוקמים במגע ישיר עם השטח אגר. החלק בתבניות קשר / מדגם של הקלטת ממוקם מיושר עם משטח אגר ועל קצה אחד של הקלטת הוא דבק רופף הקיר הצדדי של צלחת פטרי כדי להקל על הסרת קל של הקלטת מפני השטח אגר הבאים העשרה.
2. צלחות הם הפוכים (כדי למנוע התעבות) ו מודגרות ב 35-37 ° C כדי לאפשר צמיחה מספקת של סלמונלה spp. משך תקופת הדגירה צורך להעשיר את התאים לרמה לגילוי יהיה תלוי ברמות זיהום ראשוני סלמונלה. ראינו היווצרות microcolony מעולה inocula הראשונית נמוכה לאחר 8 שעות העשרה.
3. לאחר תקופת העשרה הרצוי, לפתוח את צלחת אגר. הקלטת ישמרו לדביקות שלה במהלך הדגירה. לחץ בעדינות את הקלטת נגד אגר באמצעות האצבע כדי להבטיח התאוששות מרבית של microcolonies נוצר על הממשק קלטת אגר. אחוז קלטת מהקצה מחובר לקיר של צלחת פטרי ולהסיר אותו עם בהילוך איטי אפילו,. הר את הקלטת תא מטען, הצד הדביק למעלה, לשקופית מיקרוסקופ, כמתואר בסעיף 1.5 לעיל. המשיכו לשלב "קיבוע והתייבשות" להלן.
4. עבור miniculture פני הנוזל, מתחילים מהדק את הקלטת המשמש הדגימה לשקופית מיקרוסקופ, כמתואר בסעיף 1.5 לעיל. לאחר מכן, לכסות את החלק בתבניות קשר / מדגם של הקלטת עם תא שאינו סטרילי סיליקון זלוף (Coverwell, גרייס Bio-Labs, Inc), ויצרו תא אטום אשר התחתונה מורכבת קלטת התא טעון, הפונה כלפי מעלה. היטב, אבל בעדינות העיתונות חדר למקום על מנת להבטיח חותם למים.
5. שימוש בג'ל גמיש טעינת פיפטה קצה, העברת ≤ 500 מרק μL סויה Trypticase או העשרה אחרות בינוני מתאים דרך אחת היציאות קטן של תא מפרצון. חותם בשתי יציאות עם הקלטת למשרד שקוף כדי למנוע אידוי שקופיות דגירה 35 ב -37 ° C לפי הצורך להעשרה מספקת. למרות כל פעולות יש לבצע על פי שיטות דגימה טוב וטיפול, עקרות של סרט נמל איטום או לתאי זלוף אינה נדרשת במהלך miniculture פני הנוזל. השילוב של דגים cytometry זרימה יאפשר אפליה ברורה של Salmonella spp. מתוך אי - יעד חיידקים שעלולים להיות נוכח, עם התרומה הגדולה ביותר של יעד שאינו צומח צפוי לבוא מן המדגם עצמו. המשיכו לשלב "קיבוע והתייבשות" להלן.

3. קיבוע והתייבשות

1. עבור דגימה משטח ישיר או להעשרת שלב מוצק של סלמונלה spp. על אגר XLT-4, לבצע על קלטת קיבוע התא למשך 30 דקות ב 25 ° C שנאגרו על ידי כיסוי שטח מגע עם מדגם 500 μL 10% נייטרלי פורמלין.
2. בטל מקבע לתוך מיכל סגר (מתחת למכסה המנוע כימי כדי למזער את החשיפה מעצבן / אדים רעילים).
3. מייבשים בסדרה אתנול (50%, 80% ו 95%; 300 μL / 3 דקות כל ריכוז). המשיכו לשלב "הכלאה" להלן.
4. עבור קיבעון של 500 μL מדגם פני הנוזל minicultureים, חדרי זלוף אינן חתומות, ועל קצה גמיש ג'ל טעינת פיפטה משמשת כדי לחלץ את enrichate. Pipetting מהירה למעלה ולמטה משמש כדי להבטיח סילוק יעיל של כל קלטת מחויב התאים הנותרים.
5. בשלב הבא, כל נפח 500 miniculture μL מועברת צינורית microcentrifuge וסובב אל XG 2000 (5 דקות). Supernatant נמחקת, גלולה היא vortexed 30-60 במרץ עבור s, אז resuspended בנפח שווה של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין. תאים הם קבועים למשך 30 דקות במהירות של 25 ° C.
6. מקבע לאחר מכן, הוא הסיר את המדגם הוא resuspended במאגר תא אחסון, כדלקמן. המדגם הוא הסתובב לעבר XG 2000 (5 דקות, 25 ° C) supernatant נמחקת, גלולה היא vortexed במרץ עבור 30-60 s, resuspended בנפח שווה של 50% לא מפוגל אתנול-50% פוספט שנאגרו מלוחים. תאים קבוע ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל (שנים) ב -20 ° C. הערה: בכל פעם נוזלים משתנים (לדוגמה, כאשר החדרת חיץ מקבע או אחרת), חשוב ביסודיות resuspend (עם vortexing) התא גלולה בחלק מזערי (~ 10-20 μL) של מערכת "היוצא" נוזלי . זה יעזור למנוע clumping ולהבטיח כי השעיות אפילו של תאים בודדים מתקבלים. המשיכו לשלב "הכלאה" להלן.

4. הכלאה

1. הכן הכלאה / כביסה חיץ שימוש מסחרי ביולוגיה מולקולרית כיתה פתרונות ציין בטבלה חומרים. סופי מרכיב ריכוזי חיץ הם 0.7 M NaCl, 0.1 מ 'טריס [pH 8.0], 10 mM EDTA, נתרן גופרתי 0.1% dodecyl, עשה עד נפח הרצוי הסופי עם מים מולקולרית כיתה ו מסונן באמצעות מזרק 0.22 מיקרומטר או לסנן כוס. המאגר זהה, ללא תוספת של בדיקות (ראה להלן) משמש חיץ כביסה. מחממים הכלאה ושטיפת מאגרים על 55 ° C.
2. הוסף fluorescently שכותרתו Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ") ו Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3" ) בדיקות oligonucleotide (לוח חומרים) למאגר הכלאה שחומם מראש. ריכוז בדיקה כוללת של 5 μL ^-1 ng משמש (למשל 2.5 ננוגרם μL ^-1 כל בדיקה; Bisha ו-Brehm Stecher, 2009a).
3. לקבלת דוגמיות העשרה ישיר ל-קלטת מוצק שלב, כיסוי המדגם בתבניות לפנות שטח של הקלטת עם μL 300 של חיץ הכלאה המכיל את קוקטייל בדיקה להכליא תאים קלטת כבול בתא, לח הדגרה אטום מוגדר 55 ° C. אם קשר ישיר חממה כגון מכשיר שקופית חפיר (לוח חומרים) משמש, דוגמאות הכלאה של 15 דקות ו> 20 שקופיות יכול להיות מעובד בו זמנית. אם תנור רוטרי בסגנון הכלאה כגון מכשיר במבינו (לוח חומרים) משמש, מגלשות ממוקמים 50 צנטריפוגות מ"ל צינורות פוליפרופילן עבור הכלאה, שקופית אחת לכל צינור. בגלל העברת החום אינה ישירה, דוגמאות אלה הן הכלאה לתקופות ארוכות (עד 30 דקות).
4. בעקבות הכלאה, מגלשות מוסרים ואת המכילים בדיקה הכלאה שכבת חיץ נמחקת. שקופיות הן מכן לשטוף קצר בעדינות עם חיץ כביסה שחומם מראש על ידי pipetting נפח קטן של המאגר על שקופית מוטה (3 שטיפות של 300 כל μL), או שטף רשמית (עד 30 דקות) עם כיסוי צדי החיץ כביסה שחומם מראש או טבילה שפופרת 50 מ"ל פוליפרופילן צנטריפוגה המכילה מאגר כביסה שחומם מראש. מניסיוננו, למרות לשטוף רשמי יספק תוצאות משופרות (אובך פחות מ בדיקה מאוגד), פשוט לשטוף היא נאותה לאיתור חד משמעי של Salmonella spp. בשלב הבא, הם שקופיות אוויר יבש לפני שעבר את הצעד "איתור" להלן.
5. הכלאה של דגימות נוזל miniculture משטח מבוצע על ידי ספינינג מטה דגימות (שאך קבוע או נשמר חיץ אחסון ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות XG ב 2000, ואחריו vortexing הנמרצת של גלולה ו resuspension במאגר הכלאה μL שחומם מראש המכיל 100 קוקטייל בדיקה. דוגמאות הן הכלאה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גוש חום או דגירה אחרות תחנת מתאים (לוח חומרים), ואחריו תוספת של חיץ כביסה μL 500 שחומם מראש. כמו קלטת מחויב דוגמאות, דוגמאות אלה עשויים להיות שטף רשמית עד 30 דקות עם הדגירה נוסף על 55 מעלות צלזיוס במאגר זה לשטוף, עם vortexing לסירוגין. לחלופין, ניתן דגימות vortexed ביסודיות לאחר תוספת של חיץ כביסה μL 500 שחומם מראש, ואחריו קצירת מיידית לניתוח (להלן).
6. לקראת זיהוי של סלמונלה spp. דרך cytometry זרימה, נוזל miniculture דגימות פני השטח הם הסתחררו מטה XG 2000 דקות 5, supernatant נמחקת ואת הדגימות resuspended בטמפרטורת החדר 300 μL (~ 25 ° C) PBS. אם דגימות דורשים הובלה למתקן מרוחק, או אם עיכוב צפוי בין הכלאה וניתוח, דגימות יכול להיות בקירור או שנערך על הקרח לפני anaתמוגה. לחלופין, ניתן להעביר דגימות למאגר תא אחסון (50:50 תערובת של PBS ואתנול מוחלט) שנערך -20 ° C עד שבוע ללא הפסד ניכר בדיקה, שמעניקה פלואורסצנטי (Bisha ו-Brehm Stecher, 2009 ב) .

5. איתור

1. לגילוי על קלטת של סלמונלה spp. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ישיר ל-קלטת או מוצק העשרה דגימות שלב הם overlayed עם ~ 10 בינוני μL H-1200 Vectashield הרכבה המכיל את counterstain גרעיני 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), רכוב עם תלוש כיסוי, מודגרות אז בחושך במשך 10 דקות.
2. שמן טבילה מושם על להחליק את המכסה, דגימות נבדקות באמצעות המטרה הגדלה גבוהה שמן (63x או 100x). המסנן DAPI משמש כדי להביא את המדגם אל המוקד, מיקרוסקופ מופעלת ואז לסנן את המתאים (ירוק או אדום, תלוי צבע המשמש קצה התווית בדיקות) ותאי סלמונלה הם הבקיע חזותית על פי הקרינה שלהם (איורים 2 ו -3).
3. לגילוי cytometric של דגימות נוזל miniculture פני השטח, מכשירים שונים עשויים לשמש, בהתאם לזמינות המקומית. במעבדה שלנו, PBS, הושעה דגימות מועברים 5 מ"ל סיבוב תחתית צינורות דגימה (BD פלקון) ובדק באמצעות cytometer תזרים FACSCanto עם עירור ב 647 ננומטר (לוח חומרים). לקבלת דוגמיות מועשר המכיל מספר רב של חיידקים בסך הכל, את "זרימת שיעור נמוך" הגדרת (10 דקות μL ^-1) משמש 5,000-50,000 אירועים נאספים. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה FlowJo (גרסה 8.8.6, עץ Star, Inc, Ashland, OR) או ניתוח אחר תוכנה מתאימה (איור 4, לוחות A ו-B).

6. נציג תוצאות

באיור 1. השימוש דבק עבור מדגם של Salmonella spp. מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי.

איור 2. תוצאות אופייניות של הדגימה ישיר ל-קלטת זיהוי דגים של סלמונלה Typhimurium ATCC 14028 מפני השטח של עגבנייה (100 X אובייקטיבי שמן). קוקטייל של שתי בדיקה של טקסס אדום שכותרתו בדיקות (Sal3/Salm-63) שימש לתייג את התאים האלה.

איור 3. Microcolonies של סלמונלה Typhimurium ATCC 14,028 נוצר על פני השטח של אגר ליזין Tergitol-4 (XLT-4) קסילוז אחרי 8 שעות על קלטת העשרה ב 37 ° C. inoculum הראשוני היה שנדגמו מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי. מוצק שלב העשרה מגדיל את מספר התאים הזמינים עבור איתור גם משפר הסלולר תוכן rRNA.

איור 4. השימוש דבק עבור מדגם של ס enterica serovar Typhimurium מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי, ואחריו ניתוח ישיר באמצעות דגים תזרים cytometry (לוח א ') או לאחר 5 שעות ללא סלקטיבית העשרה miniculture נוזלי משטח בתא זלוף מלא 500 μL Trypticase סויה מרק (לוח ב' ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטות פשוטה ומהירה לגילוי של פתוגנים על משטחים לייצר עשוי לסייע להפחית מחלות foodborne על ידי מתן מידע עדכני ושימושי. דבק סרט המבוסס על שיטות הדגימה שימשו מיקרוביולוגיה סביבתית, קלינית מזון מאז 1950 וה לערב הקשה של "סקוטש" בסגנון סרט על משטחים לסילוק של מיקרואורגניזמי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used