ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم<em&gt; في المختبر</em

Summary

نقدم الإجراء لتصنيع وتشغيل جهاز ميكروفلويديك الذي يجسد microenvironments ورم غير متجانسة في المختبر. وكميا التباين في موت الخلايا المبرمج داخل أنسجة الورم باستخدام البقع الفلورية ومعامل الانتشار الفعال لدوكسوروبيسين العلاج الكيميائي المخدرات في أنسجة الورم وتقييمها.

Abstract

قمنا بتطوير الجهاز ميكروفلويديك الذي يحاكي التسليم وإزالة النظامية من الأدوية إلى الأنسجة ثلاثي الأبعاد غير متجانسة السرطانية في المختبر. العناصر الغذائية التي تقدمها الأوعية الدموية تفشل في الوصول إلى جميع أجزاء من الأورام، مما أدى إلى microenvironments غير متجانسة تتكون من أنواع الخلايا قابلة للحياة، هادئة ونخرية. عقاقير مضادة للسرطان كثيرة لا تخترق بشكل فعال وعلاج جميع أنواع الخلايا وبسبب هذا التباين. Monolayers الخلايا السرطانية لا تقليد هذا التباين، مما يجعل من الصعب لاختبار عقاقير مضادة للسرطان مع نموذج مناسب في المختبر. ملفقة أجهزتنا ميكروفلويديك من PDMS باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. أدرجت الأجسام الشبه الكروية الورم متعددة الخلايا، والتي شكلتها طريقة قطرة شنقا، ومقيدة إلى غرف مستطيلة على الجهاز والحفاظ على التروية المتوسطة مع المستمر على جانب واحد. إنشاء شكل مستطيل الغرف على الجهاز التدرجات الخطية داخل الأنسجة. واستخدمت البقع الفلورية لتحديد التقلب ه في موت الخلايا المبرمج داخل الأنسجة. تم علاج الأورام على الجهاز مع الفلورسنت تم استخدام العلاج الكيميائي المخدرات دوكسوروبيسين، الوقت الفاصل بين المجهري لرصد انتشارها في الأنسجة، وقدر معامل الانتشار الفعال. يسمح أسلوب قطرة شنقا سرعة تشكيل الأجسام الشبه الكروية موحدة من عدة خطوط الخلايا السرطانية. تمكين الجهاز نمو الأجسام الشبه الكروية لمدة تصل إلى 3 أيام. وكانت الخلايا التي تتدفق على مقربة من الحد الأدنى والمتوسط ​​أفكارك بعيدا عن تلك القناة كانت أكثر أفكارك، وبالتالي محاكاة بدقة المناطق المتاخمة للأورام في الأوعية الدموية. وافق القيمة المقدرة للدوكسوروبيسين معامل انتشار بقيمة عنها سابقا في سرطان الثدي البشرية. لأن الاختراق والاحتفاظ المخدرات في الأورام الصلبة يؤثر فعاليتها، ونحن نعتقد أن هذا الجهاز هو أداة هامة في فهم سلوك المخدرات، وتطوير علاجات جديدة للسرطان.

Protocol

1. جهاز التصنيع

واستند تكرار الميزات ميكروفلويديك في المواد المرنة على طريقة وصفها دافي وآخرون .. ¹

1. الاستومر مزيج (polydimethylsiloxane؛ PDMS) وكيل علاج من سيليكون إلاستومر كيت (داو كورنينج وميدلاند، MI) في نسبة الوزن وأكثر من صب 09:01 الرئيسي لتشكيل طبقة سميكة 4 مم. ديغا لإزالة فقاعات الهواء وعلاج الخليط في C ° 60 لمدة 5 ساعات. قشر الشفاء من PDMS العفن للحصول على ختم من الميزات تدفق على المطاط الصناعي.
2. شنت الثقوب لكمة لمداخل ومنافذ باستخدام 1.5 مم خزعة لكمة (Miltex، نيويورك، PA) على الصحافة الحفر. سحب أي حطام.
3. إخضاع الجانب ملامح الطابع وشريحة زجاجية نظيفة لالأوكسجين البلازما لمدة 8 دقائق في الأكسجين مطبوع البلازما. جعل الأسطح المعالجة في الاتصال فورا لتشكيل رابطة بينهما. الحفاظ على الجمعية العامة في C ° 60 على الأكثر دفئا الشريحة لا يقل عن 5 ساعةق لتعزيز السندات.
4. الاتصال 0،032 "أنابيب PTFE ID (كول Parmer، فيرنون هيلز، IL) إلى مداخل ومنافذ باستخدام واجهة من قفل الأنبوب ذكر الموصلات تعلق على الإناث الشائكة موصلات قفل الأنبوب (Qosina، إيدجوود، NY).
5. انشاء الجمعية تدفق باستخدام صمامات اغلاق وموصل Y-(أبتشيرتش العلمية، اوك هاربور، WA، الشكل 1). تركيب جهاز إلى المجهر. إرفاق الحقن باستخدام أنابيب ل20G 1.5 "الإبر (BD العلوم البيولوجية، روكفيل، MD).

2. تشكيل الأجسام الشبه الكروية الموحدة

وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من خلال طريقة قطرة شنقا ^2،3.

1. يعرض للتريبسين الخلايا تحت غطاء الخلية الثقافة العقيمة.
2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا trypsinized في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend في المتوسط ​​مل 6 الطازجة. تخفيف محلول المخزون إلى تركيز النهائي المطلوب (الجدول 1).
3. إزالة الغطاء من 48 لوحة جيدا ووضعه رأسا على عقب في الظريفrilized غطاء محرك السيارة. مناطق دائرية المقابلة لكل جيدا واضحة على الغلاف. ملء كل بئر من لوحة مع 1 مل من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة. وضع قطرة 20 ميكرولتر من الحل الخلية المخففة في كل منطقة دائرية باستخدام micropipette. عكس بعناية غطاء ووضعه على لوحة جيدا، وضمان أن لا تلمس قطرات حواف الآبار.
4. احتضان لوحة جيدا في C ° 37 لعدد محدد من الأيام (الجدول 1). وسوف تشكل كروي في كل قطرة شنقا.

3. إدخال الأجسام الشبه الكروية في جهاز

الرجوع إلى الشكل 1 والجدول 2 لهذا القسم.

1. تعقيم الجهاز عن طريق التنظيف مع الايثانول 70٪ من خلال عرض مدخل التدفق. وبعد ذلك، طرد مع PBS تليها HEPES مخزنة خلية ثقافة المتوسط. ترك الحقنة _F S المتوسطة تعلق على الأنابيب.
2. رسم 2-3 الأجسام الشبه الكروية في حقنة _P S، اضغط حقنة لإزالة فقاعات الهواء، ونعلق على مدخل التعبئة للجهاز.
3. فتح صمام مدخل V _دبوس وإغلاق _{مؤشرات مالية} V. فتح منفذ _العبوس V صمام إغلاق _وفوت V. عقد حقنة التعبئة الرأسية مع الإبرة نحو الانخفاض؛ مشاهدة الأجسام الشبه الكروية كما تترسب في القاع من المحقنة إلى الأنبوب الموصل للقفل الإبرة. دفع المكبس على حقنة التعبئة والأجسام الشبه الكروية ووتش إدخال الأنبوب وتصب في الجهاز. فقط لأن صمام مأخذ التعبئة مفتوحة، وسوف كروي دخول غرفة الجهاز ويتم الاحتفاظ من قبل المشاركات في الجزء الخلفي (الشكل 2).
4. إغلاق مدخل صمام V _دبوس ومنفذ _العبوس V صمام. تحميل _F S الحقنة على مضخة الحقنة. فتح صمام صمام V _{مؤشرات مالية وفوت} V. تدفق المتوسطة في الجهاز في 3 ميكرولتر / دقيقة.

4. إدخال عامل موت الخلايا المبرمج الكشف عن (CaspGLOW)

بعد التعبئة غرف مع الأجسام الشبه الكروية، والسماح للموازنة شف إلى 24 ساعة لإنشاء تدرجات المغذيات وmicroenvironments، قبل تقديم كشف الخلايا أو العوامل العلاجية. لأن الأنسجة في غرف على اتصال مع الجدران التي لا يمكن اختراقها من أعلى وأسفل، لا توجد التدرجات المغذيات على طول سمك (0.15mm) من الأنسجة. بعد 24 ساعة من الحضانة، وجميع طبقات الخلايا على طول سمك الأنسجة وبالتالي تعادل عدم التجانس الوحيد هو في اتجاه بعيدا عن قناة التدفق.

1. اغلاق _{مؤشرات مالية} V، ووقف ضخ حقنة، حقنة إزالة _F S من المضخة واستبدالها حقنة وجود المتوسطة تحتوي على 0.25 ميكروليتر / مل من CaspGLOW الأحمر بالموقع كاسباس-3 علامة (الحمراء DEVD-FMK؛ Biovision، ماونتن فيو، CA).
2. مسح يدويا 0،7 مل من هذا الحل من خلال الجهاز لضمان تشريد أقدم المتوسط. تحميل الحقنة على مضخة، أعد تشغيل التدفق، _{ومؤشرات مالية} مفتوحة V. على مدى فترة من 5-8 ساعات، وموت الخلايا المبرمج كشف وكيل ينشر في رانه نسيج وfluoresces أكثر إشراقا في مناطق أفكارك. ويحتفظ وكيل موت الخلايا المبرمج في الكشف عن هذا التركيز في كل الحلول تدفق اللاحقة في الجهاز.

ملاحظة:

1. ويمكن التأكد من عدم التجانس الأنسجة عن طريق الحصول على ملفات تعريف كثافة خطية من مضان كما هو موضح في القسم 6. يجب أن تظهر ملامح التدرجات المكانية في موت الخلايا المبرمج، مؤكدا أن الأنسجة غير المتجانسة فيما يتعلق بقاء الخلية.
2. CaspGLOW الخضراء بالموقع كاسباس-3 علامة (فلوريسئين DEVD--FMK؛ Biovision) ويمكن أيضا أن تستخدم لكشف الخلايا. هذه العلامة يحتوي على فلوريسئين fluorophore الأخضر بدلا من الأحمر رودامين fluorophore.

5. إدخال عامل علاجي

1. اتبع الإجراء في الخطوات 4،1-4،2 لإنتاج 10 هيدروكلوريد دوكسوروبيسين ميكرومتر (دوكس؛ سيغما الدريخ، سانت لويس، MO) تحتوي على كشف وكيل موت الخلايا المبرمج.
2. تواصل تدفق therapeUTIC حل كيلا لفترة محددة من الزمن. اغلاق صمام V _{مؤشرات مالية} وإيقاف المضخة حقنة. استبدال المحاقن العلاج مع حقنة تحتوي على موت الخلايا المبرمج المتوسطة الطازجة كشف وكيل. تسمح تدفق المتوسطة الطازجة لمدة 24 -36 ساعة في حين رصد مستمر النسيج تحت المجهر.

6. الوقت الفاصل بين المجهري وتقدير معاملات انتشارية المخدرات

للحصول على البيانات مضان أنظف، والحصول على جميع الصور من خلال التركيز المجهر على الطبقات السفلي من الأنسجة. لأنه لا توجد التدرجات المغذيات في الاتجاه العمودي (انظر القسم 4)، وطبقات السفلي من الخلايا ممثلي جيدة من جميع الطبقات الأخرى أعلاه.

1. وعملية الاستحواذ الآلي كامل باستخدام برنامج نصي مخصص في IPLab (BD العلوم البيولوجية، روكفيل، MD). الحصول على الصور المنقولة الخفيفة ومضان من كروي معبأة على التكبير 10x كل 30 دقيقة (الشكل 3A). Acquirه صورة من مضان الخلفية قبل إدخال دوكس. لاستيعاب الحجم الكبير لللغرفة (1000 × 300 ميكرومتر ميكرومتر)، والحصول على صورتين المجاورة والبلاط معا ^4.
2. لتقدير معاملات رياضية انتشارية المخدرات، فإن الخطوة الأولى هي لتوليد متوسط ​​كثافة التشكيلات الخطية من مضان دوكس باستخدام يماغيج. تحديد منطقة مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) تشمل الأنسجة في الغرفة. استخدم الأمر مؤامرة الشخصي لإنشاء ملف تعريف من شدة المتوسط ​​بوصفها وظيفة من المسافة من قناة التدفق. كرر لمدة تصل إلى 3 نقاط زمنية مختلفة.
3. الحصول على صورة خلفية مضان قبل إدخال دوكس لقياس تألق ذاتي من الأنسجة. طرح مضان الخلفية متوسط ​​كثافة من كثافة التشكيلات التي تم الحصول عليها وتطبيع كل من شدة الشخصي الحد الأقصى للحصول على المقابلة (خ، ر) (الشكل 3B).
4. الخطوة التالية هي تقييم فعالية معامل الانتشار D من دوكس داخل أنسجة الورم. يمكن أن تكون ممثلة من قبل دوكس نشر المعادلة ⁵ التالية
   
   حيث erfc هي وظيفة مكملة الخطأ، x هو المسافة في الأنسجة من القناة، وحان الوقت بعد ر إدخال دوكس (راجع الشكل رقم 3). استخدم ما يلي مخطط تكراري في كل نقطة تعتبر الوقت:
   • تخمين قيمة لD
   • حساب الجانب الأيمن من المعادلة في كل مكان X
   • حساب مجموع الأخطاء مربع (المتبقية) بين الجانبين
   • تعديل D لتقليل المتبقية
5. متوسط ​​القيم الأمثل للD تم الحصول عليها في كل نقطة من الوقت لتقدير متوسط ​​معامل الانتشار الفعال للدوكس في الأنسجة.

7. ممثل النتائج:

<ف الطبقة = "jove_content"> الأجهزة ميكروفلويديك تقديم 1MM X 0.3mm 0.15mm X بصريا غرف ثقافة الوصول إليها لنمو أنسجة الورم ثلاثي الأبعاد. تم نقل الأجسام الشبه الكروية متعددة الخلايا السرطانية في هذه الدوائر وكانت تحتفظ بها وظيفتين مرشح في الخلف. يسمح أسلوب قطرة شنقا سرعة تشكيل الأجسام الشبه الكروية من حجم ثابت وشكل من عدة خطوط الخلايا. كانت تزرع بنجاح الأجسام الشبه الكروية على الجهاز لمدة تصل إلى 3 أيام. ارتبط النمو في غرف مع تعديل استنساخه من microenvironments داخل الأجسام الشبه الكروية. حدث موت الخلايا المبرمج في الخلايا أقل على مقربة من القناة وتدفق أعلى أعمق في الأنسجة. تم استخدام جهاز لتقدير معامل انتشار دوكسوروبيسين في أنسجة الورم. القيمة التي تم الحصول عليها من 8.75 X 10 ^{-7 -1} سم S ² تتفق مع قيمة قدرها 9.1 X 10 ^-7 سم ² ث ^-1 عنها سابقا ⁶ في سرطان الثدي البشرية.

خلية الخط	مطلوب خلية تركيز	حضانة الزمن
LS174T	300 خلية / ميكرولتر	2-3 أيام
T47D	750 خلية / ميكرولتر	3-4 أيام
MDA-MB-231	150 خلية / ميكرولتر	5-6 أيام

الجدول 1. معلمات لإسقاط الأجسام الشبه الكروية المعلقة

جزء	وصف
S F	تدفق الحقنة
S P	التعبئة الحقنة
V مؤشرات مالية	تدفق مدخل صمام
V الدبوس	التعبئة صمام مدخل
V فوت	تدفق صمام المخرج
V العبوس	التعبئة صمام المخرج

الجدول 2. صمامات الحقن وتدفق في الإعداد

الشكل 1 تخطيطي _{للمؤشرات مالية} الإعداد V V وتدفق _فوت: مدخل التدفق وصمامات منفذ؛ V V _{دبوس والعبوس:} مدخل تغليف وصمامات منفذ؛ S _F S _وP: تدفق الحقن والتعبئة. وتستخدم الحقنة التعبئة والتغليف مدخل ومخرج الصمامات عند جوا كروي في الغرفة. وتستخدم الحقنة تدفق وتدفق وصمامات مدخل مخرج لتدفق المتوسطة في وقت لاحق.

الشكل 2. التخطيطي لكروي المحاصرين في غرفة على الجهاز. وتدفقت A كروي في غرفة على الجهاز ويتم حظرها بواسطة نقاط البيع تصفية 2TS في الجزء الخلفي من الغرفة.

الشكل 3. دوكسوروبيسين نشرها في أنسجة الورم على الجهاز. مدموجة A. تنتقل الصورة الفلورية ضوء أحمر والنسيج، والتي تبين موقع وتركيز دوكسوروبيسين (باللون الأحمر). شريط النطاق يمثل 250 ميكرون. B. تطبيع الملف الشخصي كثافة مضان خطية من دوكسوروبيسين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الأوعية الدموية في الأورام متناثر وضعت سوء ^7،8. هناك مناطق تقع على مسافة بعيدة (> 100 ميكرون) من الأوعية الدموية التي لا يمكن الوصول إليها لتوفير المواد الغذائية والأدوية على الرغم من ال ⁹ الأوعية الدموية. والمكروية غير متجانسة مما أدى يسهم في فعالية محدودة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
سيليكون المطاط الصناعي عدة	لاصقات ألسويرث	184 سيل المرانة كيت
Miltex خزعة لكمة	MedexSupply	MTX-33-31AA	1.5 مم
PTFE أنابيب	كول Parmer	EW-06417-31	0،032 "ID
ذكر الأنبوب الموصل قفل	Qosina	65111
الشائكة الإناث موصل قفل الأنبوب	Qosina	11556
للإيقاف صمام	آيدكس الصحة والعلوم	P-721
Y-موصل	آيدكس الصحة والعلوم	P-513
20G 1.5 "الإبر	BD Biosciencه	305176
التربسين EDTA-	إينفيتروجن	25300-054
HEPES	سيجما	H-4034
CaspGLOW فلوريسئين	Biovision	K183-25
CaspGLOW الأحمر	Biovision	K193-25
دوكسوروبيسين هيدروكلوريد	سيجما	44583
LS174T	ATCC	CCL-188	سرطانة الخلايا البشرية القولون خط
T47D	ATCC	HTB-133	الإنسان خلية سرطان الأقنية خط
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	خلية غدية الإنسان الثديية خط