Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti tumorali In vitro. La variabilità in apoptosi nel tessuto tumorale è stata quantificata mediante macchie fluorescenti e il coefficiente di diffusione efficace del farmaco chemioterapico doxorubicina nel tessuto tumorale è stata valutata.

Abstract

Abbiamo sviluppato un dispositivo a microfluidi che imita la consegna e la clearance sistemica di farmaci per eterogenei tessuti tumorali tridimensionali in vitro. I nutrienti forniti da vascolarizzazione non riescono a raggiungere tutte le parti di tumori, dando luogo a microambienti eterogenei costituiti da tipi di cellule vitali, quiescenti e necrotico. Farmaci contro il cancro Molti non riescono a penetrare in modo efficace e trattare tutti i tipi di cellule a causa di questa eterogeneità. Monostrati di cellule tumorali non imitare questa eterogeneità, rendendo difficile per testare farmaci antitumorali di un idoneo modello in vitro. I nostri dispositivi microfluidici sono stati realizzati su PDMS utilizzando la litografia soffice. Sferoidi multicellulari tumorali, formate con il metodo della goccia pendente, sono stati inseriti e vincolati in camere rettangolari sul dispositivo e mantenuto con perfusione mezzo continuo su un lato. La forma rettangolare delle camere sul dispositivo creato gradienti lineari all'interno del tessuto. Macchie fluorescenti sono stati utilizzati per quantificare °variabilità e in apoptosi all'interno del tessuto. Tumori sul dispositivo sono stati trattati con la doxorubicina farmaco chemioterapico fluorescente, time-lapse microscopia è stata utilizzata per monitorare la diffusione nel tessuto, e il coefficiente di diffusione efficace è stato stimato. Il metodo della goccia pendente permesso rapida formazione di sferoidi uniformi dalle diverse linee cellulari tumorali. Il dispositivo è attivata crescita di sferoidi fino a 3 giorni. Cellule in prossimità del flusso mezzo erano minimamente apoptotica e lontani dal canale erano più apoptotico, così accuratamente mimando regioni tumori adiacenti ai vasi sanguigni. Il valore stimato del coefficiente di diffusione doxorubicina concordato con un valore precedentemente riportato nel carcinoma mammario umano. Poiché la penetrazione e ritenzione dei farmaci nei tumori solidi influenza la loro efficacia, noi crediamo che questo dispositivo è uno strumento importante per comprendere il comportamento dei farmaci, e lo sviluppo di nuove terapie contro il cancro.

Protocollo

1. Dispositivo Fabrication

Replica di caratteristiche microfluidica in materiali elastomerici si basa sul metodo descritto da Duffy et al. ¹

1. Mix elastomero (polidimetilsilossano, PDMS) e catalizzatore dal Kit elastomero di silicone (Dow Corning, Midland, MI), in un rapporto in peso 9:1 e versare sopra il master in modo da formare uno strato di 4 mm di spessore. Degas per rimuovere le bolle d'aria e polimerizzare la miscela a 60 ° C per 5 ore. Peel curata PDMS dallo stampo per ottenere un timbro di caratteristiche del flusso sul elastomero.
2. Fori Punch per ingressi e le uscite con un 1,5 mm biopsia (Miltex, York, PA), montato su un trapano a colonna. Estrarre tutti i detriti.
3. Oggetto Il lato le caratteristiche del timbro e un vetrino pulito per plasma di ossigeno per 8 minuti in un incisore plasma di ossigeno. Portare le superfici trattate immediatamente a contatto per formare un legame tra loro. Mantenere il gruppo a 60 ° C su un vetrino più caldo per almeno 5 ores per rafforzare il legame.
4. Collegare 0.032 "ID tubi in PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) per le entrate e le uscite utilizzando un'interfaccia di luer lock maschio connettori collegati ai connettori spinato femmina luer lock (Qosina, Edgewood, New York).
5. Impostare il gruppo di flusso con valvole di intercettazione e di un connettore a Y (Upchurch scientifico, Oak Harbor, WA; la figura 1). Montare il dispositivo al microscopio. Collegare siringhe di tubi tramite 20G 1.5 "aghi (BD Bioscience, Rockville, MD).

2. Formazione di Spheroids uniformi

Sferoidi sono formate attraverso il metodo della goccia pendente ^2,3.

1. Tripsinizzare le cellule sotto cappa sterile coltura cellulare.
2. Centrifugare cellule tripsinizzate a 2000 rpm per 5 minuti e risospendere in 6 ml di mezzo fresco. Diluire la soluzione madre alla concentrazione finale desiderata (Tabella 1).
3. Togliere il coperchio di una piastra da 48 pozzetti e metterlo a testa in giù nella sterilized cappuccio. Zone circolari corrispondenti a ciascun pozzetto sono evidenti sul coperchio. Riempire ogni pozzetto della piastra con 1 ml di acqua sterilizzata per mantenere l'umidità. Mettere a goccia 20 ml di soluzione diluita di cellule in ciascuna regione circolare con una micropipetta. Agitare delicatamente il coperchio e posizionarlo sopra la piastra pozzo, assicurando che le gocce non toccare i bordi dei pozzetti.
4. Incubare la piastra a pozzetti a 37 ° C per un determinato numero di giorni (Tabella 1). Uno sferoide si formerà in ogni goccia.

3. Introduzione di Spheroids in Dispositivo

Fare riferimento alla Figura 1 e Tabella 2 per questa sezione.

1. Sterilizzare il dispositivo da lavaggio con etanolo 70% introdotto attraverso l'ingresso del flusso. Successivamente, lavare con PBS seguita da HEPES tamponati terreno di coltura cellulare. _F lasciare la siringa medio S attaccato al tubo.
2. Pareggio 2-3 sferoidi in _P siringa S, toccare la siringa per rimuovere le bolle d'aria, ecollegare alla presa di imballaggio del dispositivo.
3. Apertura valvola di ingresso V _Pin e vicino _Fin V. Aprire la valvola di uscita _Pout V e vicino _Fout V. Tenere la siringa confezionatrice verticale con l'ago rivolto verso il basso; guardare come sferoidi depositano sul fondo della siringa nel connettore luer lock dell'ago. Spingere lo stantuffo sulla siringa di imballaggio e sferoidi orologi inserire il tubo e il flusso nel dispositivo. Poiché solo la valvola di uscita imballaggio è aperta, uno sferoide entrerà nella camera del dispositivo e conservate dal posti sul retro (Fig. 2).
4. Chiudere la valvola di ingresso e di uscita V _Pin valvola _Pout V. Montare la siringa _F S su una pompa a siringa. Aprire la valvola V _Fin e la valvola V _Fout. Flusso medio nel dispositivo al 3 ml / min.

4. Introduzione di Agente Rilevamento Apoptosi (CaspGLOW)

Dopo l'imballaggio camere con sferoidi, raggiungere l'equilibrio per up a 24 ore per stabilire gradienti nutrizionali e microambienti, prima di introdurre l'apoptosi o la rilevazione di agenti terapeutici. Perché i tessuti in camere sono in contatto con le pareti impenetrabili dall'alto e dal basso, non vi sono gradienti nutrienti lungo lo spessore (0,15 mm) del tessuto. Dopo 24 ore di incubazione, tutti strati di cellule lungo lo spessore del tessuto sono quindi equivalenti e l'eterogeneità solo in una direzione lontano dal canale di flusso.

1. Spegnere V _Fin, fermare la pompa a siringa, rimuovere _F S siringa dalla pompa e sostituirlo con una siringa con terreno contenente 0,25 microlitri / ml di CaspGLOW Red attiva caspasi-3 marcatore (Red-DEVD-FMK, Biovision, Mountain View, CA).
2. Manualmente irrigare 0,7 ml di questa soluzione attraverso il dispositivo per garantire lo spostamento di vecchi media. Montare la siringa sulla pompa, riavviare il flusso, e aperto _Fin V. In un periodo di 5-8 ore, l'apoptosi rilevamento diffonde agente in tegli reagisce in tessuto e brillanti nelle regioni apoptotici. Agente apoptosi rilevamento a questa concentrazione viene mantenuta in tutte le successive soluzioni di flusso nel dispositivo.

Nota:

1. Eterogeneità del tessuto può essere confermata mediante l'ottenimento di profili di intensità di fluorescenza lineare come descritto nella Sezione 6. I profili dovrebbero mostrare gradienti spaziali in apoptosi, a conferma che il tessuto è eterogenea rispetto alla vitalità cellulare.
2. CaspGLOW verde attivo caspasi-3 marcatore (fluoresceina-DEVD-FMK; Biovision) può anche essere utilizzato per rilevare l'apoptosi. Questo indicatore contiene il fluoroforo verde fluoresceina invece della rodamina fluorocromo rosso.

5. Introduzione di agente terapeutico

1. Seguire la procedura dei passi 4,1-4,2 per introdurre doxorubicina cloridrato 10 mM (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contenente l'apoptosi rilevazione agente.
2. Continua il flusso del therapeagente soluzione UTIC per un determinato periodo di tempo. Valvola di intercettazione _Fin V e spegnere la pompa a siringa. Sostituire la siringa trattamento con una siringa contenente mezzo fresco apoptosi rilevamento agente. Permettono il flusso di mezzo fresco per 24 -36 ore mentre monitorando continuamente il tessuto al microscopio.

6. Time-lapse microscopia e la stima dei coefficienti diffusività droga

Per ottenere puliti dati di fluorescenza, acquisire tutte le immagini al microscopio, concentrandosi sugli strati inferiori dei tessuti. Perché non ci sono gradienti di nutrienti in direzione verticale (vedi sezione 4), gli strati inferiori di cellule sono buoni rappresentanti di tutti gli altri livelli di cui sopra.

1. Il processo di acquisizione è stato automatizzato tramite uno script personalizzato in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Acquisire le immagini trasmesse luce e fluorescenza della sferoide imballato con ingrandimento 10x ogni 30 minuti (Fig. 3A). All'acquisie l'immagine di fluorescenza di fondo prima dell'introduzione Dox. Per ospitare per le grandi dimensioni della camera (1000 micron x 300 micron), acquisisce due immagini adiacenti e piastrelle insieme ^4.
2. Per la stima dei coefficienti di diffusività matematica droga, il primo passo è di generare profili di intensità medi lineari di Dox fluorescenza usando ImageJ. Selezionare una regione rettangolare di interesse (ROI) comprendente il tessuto nella camera. Utilizzare il comando Plot profilo per generare un profilo di intensità media in funzione della distanza dal canale di flusso. Ripetere l'operazione per un massimo di 3 punti temporali diversi.
3. Ottenere un'immagine di fluorescenza di fondo prima di introdurre Dox misurare autofluorescenza dal tessuto. Sottrarre la media intensità di fluorescenza di fondo dai profili di intensità ottenuti e normalizzare ogni profilo corrispondente per l'intensità massima per ottenere (X, t) (Fig. 3B).
4. Il passo successivo è quello di valutare l'efficacia del coefficiente di diffusione D Dox nel tessuto tumorale. Dox diffusione può essere rappresentata dalla seguente equazione ⁵
   
   dove FUNZ.ERRORE.COMP è la funzione errore complementare, x è la distanza nel tessuto dal canale, et è il tempo dopo l'introduzione di Dox (vedi fig. 3). Utilizzare il seguente schema iterativo in ogni tempo considerato:
   • Indovinate un valore per D
   • Calcolare lato destro dell'equazione in ogni posizione x
   • Calcolare la somma dei quadrati degli errori (residuo) tra i due lati
   • Modificare D per minimizzare il residuo
5. Media dei valori ottimali di D ottenuta ad ogni tempo per stimare il coefficiente medio di diffusione efficace Dox nel tessuto.

7. Rappresentante dei risultati:

I dispositivi microfluidici disponibile 1mm x 0,3 millimetri x 0,15 millimetri otticamente accessibili camere di coltura per la crescita di tridimensionale tessuto tumorale. Sferoidi tumorali multicellulari sono stati portati in queste camere e sono stati accolti da due posti di filtro sul retro. Il metodo della goccia pendente permesso rapida formazione di sferoidi di dimensioni consistenti e forma da linee cellulari diverse. Sferoidi sono stati coltivati ​​con successo sul dispositivo per un massimo di 3 giorni. Crescita nelle camere era associata con una modifica riproducibile di microambienti all'interno sferoidi. Apoptosi in cellule verificato meno in prossimità del canale di flusso superiore e più in profondità nel tessuto. Il dispositivo è stato usato per stimare il coefficiente di diffusione della doxorubicina nel tessuto tumorale. Il valore ottenuto di 8,75 x 10 ^-7 cm ² s ^-1 concorda con il valore di 9,1 x 10 ^-7 cm ² s ^-1 riportato precedentemente ⁶ nel carcinoma mammario umano.

Linea cellulare	Cella concentrazione richiesta	Tempo di incubazione
LS174T	300 cellule / mL	2-3 giorni
T47D	750 cellule / mcl	3-4 giorni
MDA-MB-231	150 cellule / mL	5-6 giorni

Parametri Tabella 1. Spheroids per goccia

Parte	Descrizione
S F	Flusso Siringa
S P	Imballaggio Siringa
V Fin	Flusso in entrata della valvola
V Pin	Imballaggio valvola di aspirazione
V Fout	Portata in uscita della valvola
V Pout	Imballaggio valvola di scarico

Siringhe Tabella 2. E valvole in configurazione di flusso

Figura 1 Schema della configurazione del flusso V e V _{Fin Fout:.} Aspirazione di flusso e valvole di scarico, V _Pin e _Pout V: ingresso Imballaggio e valvole di scarico, S _F e S _P: flusso e siringhe di imballaggio. La siringa imballaggio e confezionamento valvole di aspirazione e scarico sono utilizzati quando uno sferoide è volato nella camera. La siringa flusso e flusso di aspirazione e valvole di scarico vengono utilizzati per scorrere medio successivamente.

Figura 2. Schematica di uno sferoide intrappolato in una camera sul dispositivo. Uno sferoide è fluito nella camera del dispositivo ed è bloccato da due pos filtrots sul retro della camera.

Figura 3. Doxorubicina diffusione nel tessuto tumorale sul dispositivo. A. Fusione trasmessa immagine luce e rosso fluorescente del tessuto, mostra la località e la concentrazione di doxorubicina (in rosso). Barra della scala rappresenta 250 micron. B. profilo normalizzato intensità di fluorescenza lineare da doxorubicina.

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Discussione

Il sistema vascolare nei tumori è scarsa e mal sviluppati ^7,8. Ci sono regioni lontane (> 100 micron) dai vasi sanguigni che sono inaccessibili ai nutrienti e farmaci forniti anche se il sistema vascolare ^9. Il microambiente eterogenea risultante contribuisce alla limitata efficacia di molti chemioterapici ^10. Il dispositivo microfluidico qui sviluppato ricrea un microambiente tumorale eterogenea caratterizzata da proliferazione, le cellule quiescenti e apoptotiche o necrotiche, in v...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Silicone elastomero kit	Adesivi Ellsworth	184 Sil Elast Kit
Miltex biopsia	MedexSupply	MTX-33-31AA	1,5 millimetri
Tubi in PTFE	Cole Parmer	EW-06417-31	0,032 "ID
Maschio luer lock	Qosina	65111
Spinato raccordo luer lock femmina	Qosina	11556
Valvola di intercettazione	Idex Health and Science	P-721
Connettore a Y	Idex Health and Science	P-513
20G 1.5 "aghi	BD Bioscience	305176
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25300-054
HEPES	Sigma	H-4034
CaspGLOW fluoresceina	Biovision	K183-25
CaspGLOW Red	Biovision	K193-25
Doxorubicina cloridrato	Sigma	44583
LS174T	ATCC	CCL-188	Carcinoma del colon umano linea di cellule
T47D	ATCC	HTB-133	Umano carcinoma duttale linea cellulare
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	Adenocarcinoma mammario umano linea di cellule