Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

معايير النظائر مستقرة والتقط بواسطة أجسام المضادة للالببتيد (SISCAPA) أزواج من الببتيدات تخصيب تقارب مع النظائر مستقرة تخفيف الطيف الكتلي (MRM - MS) لتوفير قياس الكمي من الببتيدات كبدائل للبروتينات كل منهما. نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام الجزيئات المغناطيسية في شكل الآلي جزئيا.

Abstract

هناك حاجة كبيرة لفحوصات قياس الكمي في البروتينات. وترتبط المناعية شطيرة التقليدية ، وتعتبر الى حد كبير في الكميات معيار الذهب ، مع ارتفاع تكلفة وطويلة المهلة الزمنية ، ومحفوفة عيوب (أضداد غيروي على سبيل المثال ، تدخل الأجسام المضادة ، 'ربط تأثير") 1 ان البديل هو تقنية تخصيب تقارب من الببتيدات مقرونا مطياف الكتلة الكمية ، ويشار اليه عادة باسم SISCAPA (المعايير النظائر المستقرة والتقط بواسطة أجسام المضادة للالببتيد) 2 في هذه التقنية ، تقارب تخصيب الببتيدات مع تخفيف النظائر مستقرة والكشف عن طريق اختيار / رصد رد فعل متعددة الطيف الكتلي ( SRM / MRM - MS) على القياس الكمي للالببتيدات كبدائل للبروتينات كل منهما. راسخة SRM / MRM - MS لالكميات الدقيقة من جزيئات صغيرة 3 ، 4 ، ومؤخرا تم تكييفها لقياس تركيز البروتينات الموجودة في البلازما وlysates الخلية. 5-7 ولتحقيق الكميات من البروتينات ، ويتم هضم هذه الجزيئات لأكبر الببتيد المكون باستخدام انزيم مثل التربسين. ثم يتم إثراء واحد أو أكثر الببتيدات المحدد الذي تسلسل فريد من نوعه للبروتين المستهدف في ذلك الأنواع ("proteotypic" أي الببتيدات) من العينة استخدام الألغام المضادة للأضداد الببتيد وقياس الكمي كبديل متكافئة لتركيز البروتين في العينة. وبالتالي ، بالإضافة إلى تخفيف النظائر مستقرة (SID) أساليب (أي ارتفعت في النظائر مستقرة الببتيد المسمى قياسي) ، ويمكن استخدامها SRM / MRM لقياس تركيز الببتيد proteotypic كبديل عن الكمي للبروتينات في مصفوفات بيولوجية معقدة. والمقايسات تتمتع بالعديد من المزايا مقارنة المناعية التقليدية. الكواشف هي أقل تكلفة نسبيا لتوليد وخصوصية لتحليلها هي ممتازة ، ويمكن أن تكون المقايسات المضاعفة للغاية ، يمكن إجراء تخصيب متقنة من البلازما (أي استنزاف المطلوبة) ، وتقنية قابلة للمجموعة واسعة من البروتينات أو تعديلات من الفائدة. 8-13 وفي هذا الفيديو نظهر البروتوكول الأساسية وتكييفها لمنصة حبة المغناطيسي.

Protocol

الإجراءات التجريبية :

ويتطلب مقايسة الببتيد الاصطناعية وأضداد الببتيد. وينبغي أن تكون فريدة من نوعها الببتيدات المحدد للبروتين من الفائدة ، وتحتوي على ما بين 8 و 22 من الأحماض الأمينية ، وليس لديهم معروفة بعد متعدية التعديلات. وتجنبت عموما مخلفات ميثيونين والببتيدات تحتوي على الأحماض الأمينية ثنائي القاعدة (على سبيل المثال KK ، KR ، RR) غير مرغوب فيها. لهذا الأسلوب ، فإنه من الشائع استخدام النظائر مستقرة الببتيدات وصفت بأنها المعايير الداخلية ، وتتضمن الثقيلة (13 C و N 15) المسمى الأحماض الأمينية في النهاية - C من الببتيد (أي K المسمى أو R).

بروتوكول التالية يصف مقايسة وضعت لقياس GDSLAYGLR الببتيد من الماوس Osteopontin البروتين ، واستخدام الألغام المضادة للببتيد الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من شركة Epitomics (بورلنجام ، كاليفورنيا) والببتيدات الاصطناعية من نيو انغلاند الببتيد (غاردنر ، MA). بروتوكول يتكون من ثلاث خطوات رئيسية (الشكل 1) : 1) التربسين هضم البروتين من خليط معقد ، 2) إثراء الببتيدات 3) تحليل بواسطة مطياف الكتلة. سيظهر ذلك على عينة البلازما البشرية ارتفعت مع البروتين Osteopontin الماوس.

1. التربسين الهضم الأنزيمي وتنظيف

  1. أذاب 10 ميكرولتر قسامة البلازما أنيق على الجليد الرطب.
  2. تحديد تركيز البروتين الكلي عن طريق فحص BCA وأجهزة الطرد المركزي لعينة لإزالة أي المواد الصلبة العالقة.
  3. الماصة قسامة 10 ميكرولتر من أنبوب التخزين لديها بصورة طبق deepwell ميكرولتر 1000 ، وتغطي مع بيرس ، وقادر على الفيلم.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من 9M الطازجة اليوريا / 30mM dithiothreitol (DTT) (6M النهائي تركيز اليوريا / 20mM DTT) لكل عينة.
  5. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. إضافة 3 ميكرولتر العذبة iodoacetamide 500 مم (IAM النهائي 50mM) لكل عينة.
  7. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة تريس 257 ميكرولتر من 100 ملم (الرقم الهيدروجيني 8) (يخفف اليوريا إلى ~ 0.6M).
  9. أضف 10 ميكرولتر من محلول المخزون التربسين (1 ميكروغرام / ميكرولتر ، على انزيم 01:50 : نسبة الركيزة).
  10. احتضان 37 درجة مئوية خلال الليل (12-16 ساعة).
  11. إضافة 3 ميكرولتر من حمض الفورميك أنيق (تركيز النهائي من 1 ٪).
  12. إضافة معيار النظائر المستقرة (تضاف معايير متعددة إذا إجراء مقايسة المضاعفة ، وعادة هذا هو حوالي 10 ميكرولتر fmol 5-10 تحتوي على معيار الببتيد isotopically المسمى).
  13. غسل لوحة خرطوشة واحة جيدة مع 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في أسيتونتريل 80 ٪ ، وتتناسى من خلال تدفق. كرر هذا 3 مرات.
  14. يوازن لوحة خرطوشة بإضافة 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في الماء ، والتخلص من التدفق من خلال. كرر هذا 4 مرات.
  15. تحميل عينات من هضم لوحة خرطوشة وضبط الفراغ حتى تدفق بطيء للغاية.
  16. يغسل مع 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في الماء ، والتدفق من خلال تجاهل. كرر هذا 3 مرات.
  17. الببتيدات أزل بإضافة 2 × 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في أسيتونتريل 80 ٪ في 1000 لوحة في آبار عميقة ميكرولتر (لا يتخلص من التدفق من خلال).
  18. Lyophilize (أو speedvac) وشطافة للجفاف. (Lyophilization هو الأسلوب المفضل)
  19. المجففة إعادة الببتيدات بإضافة 50 ميكرولتر PBS + 0.03 ٪ الفصول.

2. الببتيد immunoaffinity تخصيب

  1. نقل العينة إلى مستوى 96 لوحات الرفراف جيدا.
  2. إضافة 1 و 1.5 ميكروغرام الأضداد البروتين - G المغلفة ميكرولتر الخرز المغناطيسي في الهدف (وهو اختياري لتشعبي الأجسام المضادة لحبات قبل الإضافة). وعلقت كذلك ضمان الخرز عن طريق هز أو vortexing.
  3. تغطية صحن مع احباط.
  4. يحضن بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) مع تراجع لطيف لضمان تعليق الخرز.
  5. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 32 x ج لمدة 5 ثوان لإزالة أي سطح السائل من احباط.
  6. إزالة الغطاء احباط.
  7. يمكن إجراء غسيل وشطف من الخرز يدويا أو بطريقة آلية. يصف هذا الإجراء الخطوات الآلية على منصة الرفراف.
  8. تغسل حبات 2 مرات مع 200 ميكرولتر الفصول + 0.03 ٪ PBS (1 في الدقيقة يغسل).
  9. تغسل حبات 1 الوقت مع التخفيف من 200 ميكرولتر 01:10 PBS الفصول + 0.03 ٪ (1 دقيقة).
  10. وeluted الببتيد في 25 ماي من حامض الخليك 5 ٪ + 0.03 ٪ الفصول.
  11. وضع لوحة على شطف المغناطيس ونقل إلى لوحة شطافة 96 بشكل جيد ، مع الحرص على عدم نقل حبات متبقية.
  12. تغطية صحن مع حصيرة الختم.
  13. يتم تسليم لوحة تحتوي على شطافة إلى مطياف الكتلة quadrapole الثلاثي للتحليل.

3. تحليل من خلال رصد ردود الفعل متعددة -- الطيف الكتلي

  1. يمكن تحديد التحولات لSRM / MRM تحليل والأمثل من خلال غرس بيكو مول 1 في حل ميكروليتر القياسية في الببتيد حمض الفورميك 30 ٪ acetonitrile/0.1 ٪ في مطياف الكتلة عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة. مرة واحدة يتم الحصول على رش مستقرة ، وجمع لطيف MS / MS.
  2. ويتم اختيار الانتقال من الطيف MS / MS عن طريق تحديد ثلاث ،ه أيونات تفتيت وفيرة في المنطقة من الطيف مع الضجيج قليلا. لمضاعفة الأيونات المشحونة الببتيد ، وشظايا ذ في الكشف عن أيون م / ض> السلائف م / ض وعادة ما تكون أفضل من أجل التنمية مقايسة SRM / MRM. ويبين الشكل 2 طيف MS / MS والأيونات الانتقالية المحددة 476.3> 508.3 ، 579.3 ، 692.4 (التحولات لمستوى النظائر مستقرة الثقيلة 481.3> 518.3 ، 589.3 ، 702.4 لا يظهر) لGDSLAYGLR الببتيد.
  3. اعتمادا على وتقديم النموذج للاستخدام مطياف الكتلة ، وهناك عدة معايير يمكن أن يكون الأمثل لكل مرحلة انتقالية. هنا ، نحن الأمثل للطاقة اصطدام كل انتقال مختارة من خلال زيادة الطاقة الاصطدام ورصد مستوى الإشارة. تم استخدام الطاقة اصطدام 25 لكل مرحلة انتقالية.
  4. باختصار ، تكوين نموذجي لSRM / MRM التحليل على النحو التالي : المرحلة المتنقلة (أ) حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، (B) الأسيتونيتريل 90 ٪ / 0.1 ٪ حمض الفورميك ، 0.3 × 5 ملم فخ العمود C18 ، 75 ميكرومتر معرف x 15 سم التحليلية العمود C18 (بور Reprosil - AQ C18 ، و 120 ألف مسام °). حجم الحقن هو 10 ميكرولتر ويتم تحميل العينة لمدة 5 دقائق عند B 3 ٪ في معدل التدفق الكلي 3 ميكرولتر / دقيقة وeluted الانحدار الخطي من قبل 3-45 ٪ عند B 300-400 NL / دقيقة في 10 دقيقة. الظروف على QTRAP 4000 (ABSCIEX ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) وكان رذاذ 2.3kV الجهد ، ايون حرارة 150 درجة مئوية المصدر ، GS1 من 12 عاما ، وستارة الغاز 15.
  5. ويتم تحليل العينة SRM / MRM عن طريق ضخ 10 ميكرولتر من العينة. تتكامل المناطق الذروة لالببتيدات الخفيفة والثقيلة باستخدام برنامج الأفق (14). أحسب نسبة المساحة الذروة (PAR) من الببتيد غير المسماة / المسمى في كل عينة باستخدام الانتقالية الأكثر وفرة خالية من الضوضاء في الخلفية ، في هذه الحالة ، والانتقال Y5 (ببتيد ضوء 476.3> 579.3 ، 481.3 الببتيد القياسية الثقيلة> 589.3).

4. ممثل النتائج :

قياس نسب منطقة الذروة (ضوء النسبية الذاتية لالببتيد الببتيد الثقيلة ارتفعت isotopically المسمى) مقياسا كميا لالببتيد الهدف. الشكل 3 يبين chromatogram سبيل المثال من الببتيدات الخفيفة والثقيلة في عينة SISCAPA التخصيب. علما أنه يمكن رصد الببتيدات الخفيفة والثقيلة أزل في نفس الوقت والتحولات متعددة لكل الببتيد لتأكيد الهوية.

figure-protocol-8711
الشكل 1. نظرة عامة التخطيطي لعملية SISCAPA. يتم هضم البروتين مزيج معقد في الببتيدات. يتم إثراء analytes الببتيد المستهدفة (الحليلة الذاتية وارتفعت النظائر مستقرة ذات العلامات القياسية الداخلية) استخدام الألغام المضادة للأضداد الببتيد ثبتوا على بروتين G - مغلفة الجسيمات المغناطيسية. بعد العزلة ، هي eluted والببتيدات المستهدفة من الجزيئات المغناطيسية وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عن الكميات النسبية للمعايير الداخلية.

figure-protocol-9282
الشكل 2. MS / MS طيف GDSLAYGLR الببتيد تبين اختيار ثلاثة أجزاء عن SRM / MRM التحولات.

figure-protocol-9521
الشكل 3. chromatograms مثال يظهر ملف ذروة الحليلة الببتيد الضوء (أحمر) والنظائر الثقيلة مستقرة ذات العلامات القياسية الداخلية (الأزرق). Chromatograms للانتقال Y5 من الببتيد الخفيفة (476.3> 579.3) ، والنظائر مستقرة الثقيلة المسمى القياسي (481.3> 589.3) هي تآمر على مر الزمن لأنها أزل من النظام اللوني.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول كما هو موضح هو ضمان بقاء حبات جيدا مختلطة خلال فترة الحضانة. وسوف يسمح للالخرز لتستقر في قاع البئر / فيال نتيجة التباين المتزايد في. فمن المهم أيضا أن تدور إلى أسفل أي السائل الذي قد تبقى على رأس البئر / فيال بعد فترة الحضانة. استنساخه الهضم التربسين أمر بالغ الأهمية أيضا. ووصف الإجراء للهضم هنا قد استخدمت على نطاق واسع في مختبرنا بالتعاون مع SISCAPA ، ومع ذلك ، فإنه يمكن أن أمثل الطرق البديلة المحتملة لعملية الهضم لمجموعة معينة من البروتينات 15 هدفا شطف من الأجسام المضادة الحرة لا تتداخل مع اكتشاف. الببتيد ، من المحتمل بسبب استبعاد الضد من العمود أو elutes في وقت لاحق من الببتيد ، ولكن يمكن crosslinked الأجسام المضادة لبروتين G حبات قبل تخصيب تقارب كبير في التجارب الحرة أو إذا كان الضد يصبح مشكلة. لقد وجدنا من المفيد أيضا أن تضع المغناطيس تحت لوح العينة على الاوتوماتيكى وكذلك غسل فخ العمود في الاتجاه العكسي للتدفق (مقارنة ب تحميل) لإزالة أي بقايا أو جزيئات حبات. بالإضافة إلى نهج حبة المغناطيسي صفها ، ويمكن أيضا أن تتكيف مع أسلوب شكل عمود (أي تقارب اللوني) 12 ، 16

مرة واحدة للمستخدم هو مريح مع بروتوكول عموما ، فإن الأسلوب هو أيضا قابلة لعدة تعديلات التي تعزز الفحص الشامل. 11 الأولى ، فإنه من الممكن تحليل analytes متعددة في فحص واحد من خلال الجمع بين الأضداد في خطوة تخصيب (أي مضاعفة). مطياف الكتلة قادرة على تحليل واحد عدد كبير من analytes. ثانيا ، زيادة حجم العينة الأصلي يحسن حساسية مقايسة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل السريرية NCI البروتين تقييم التكنولوجيا مركز (CPTAC) منحة (# U24 CA126476) ، فضلا عن منحة من مؤسسة صناعة الترفيه (EIF) ، وصندوق المرأة EIF لأبحاث السرطان للكونسورتيوم سرطان الثدي اكتشاف العلامات البيولوجية ، و هدايا سخية من مؤسسة كيك ، ومؤسسة الكناري ، والأسرة بول آلن مؤسسة جي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم المادة شركة فهرس العدد
1000ul وحات بئر عميقة 96 - جيدا إيبندورف 951032786
واحة HLB 1 خرطوشة لوحة مكعب ، باك سبتمبر ، و 40 ملغ 96 لوحة جيدا مياه 186003966
الرفراف 96 لوحة جيدا الحرارية فيشر العلمية 97002540
96 واضح تماما ، لوحة الحائط الأبيض الحيوي راد HSP9601
احباط غطاء جيدا لمدة 96 لوحة Excelscientific 12-169
Axymat حصيرة ختم جيدا لمدة 96 لوحة Axygen 521-01-151
فيلم X بيرس سيغما الدريخ Z722502
الرفراف المعالج حبة المغناطيسي مع رئيس المغناطيس PCR الحرارية فيشر العلمية HSP 9601

الجدول رقم 1 : مواد

اسم المادة شركة فهرس العدد تعليقات (اختياري)
اليوريا سيغما الدريتش U6031
Trizma قاعدة سيغما الدريتش T1503
Dithiothreitol (DTT) ثقب 20291 "لا تزن dithiothreitol"
Iodoacetamide (IAM) سيغما الدريتش I1149
التربسين الذهب Promega V5280
بروتين G حبات المغناطيسي ، 2.8um Invitrogen 10004D
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحرارية فيشر العلمية L5401
الفصلان الحرارية فيشر العلمية 28300
حمض الفورميك EMD 11670
أسيتونتريل الحرارية فيشر العلمية A998 - 1
حمض الخليك سيغما الدريتش 242853

الجدول 2 : الكواشف

حل تعليقات (اختياري)
100 درجة الحموضة تريس 8 ملم
9 M اليوريا / 30 ملم في تريس DTT 100 ملم (الرقم الهيدروجيني 8) يجب أن يكون مستعدا في كل مرة جديدة
500 ملم IAM في تريس 100 ملم (الرقم الهيدروجيني 8) يجب أن يكون مستعدا في كل مرة جديدة
التربسين 1mg/mL في 100 درجة الحموضة تريس 8 ملم
مثبط التربسين 1mg/mL في 100 درجة الحموضة تريس 8 ملم
نظائر مستقرة القياسية mastermix
الأضداد المضادة للببتيد mastermix

الجدول 3 : حلول ليكون مستعدا

References

  1. Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
  2. Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
  3. Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
  4. Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
  5. Barr, J. R. Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
  6. Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
  7. Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
  8. Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
  9. Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
  10. Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
  11. Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
  12. Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
  13. Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
  14. MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  15. Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
  16. Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

53 MRM SISCAPA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved