כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

Summary

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

Abstract

יש צורך גדול מבחני כמותי למדידת חלבונים. Immunoassays כריך מסורתית, נחשב במידה רבה את תקן הזהב ב quantitation, קשורים עם עלות גבוהה, זמן להוביל ארוך, והם טומנת בחובה חסרונות (נוגדנים heterophilic למשל, התערבות autoantibody, "וו אפקט"). ¹ טכניקה חלופית היא העשרה זיקה של פפטידים יחד עם ספקטרומטריית מסה כמותית, המכונות גם SISCAPA (איזוטופ יציב סטנדרטים ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים). ² בטכניקה זו, העשרה זיקה של פפטידים עם דילול איזוטופ יציב זיהוי על ידי נבחרת / מרובות ניטור התגובה ספקטרומטריית מסה ( SRM / MRM-MS) מספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. SRM / MRM-MS היא מבוססת היטב על quantitation מדויק של מולקולות קטנות, ^{3, 4} ולאחרונה הותאם למדידת ריכוזים של חלבונים בפלסמה lysates התא. ^5-7 כדי להשיג quantitation של חלבונים, מולקולות אלה גדול מתעכלים עד פפטידים רכיב באמצעות אנזים כגון טריפסין. אחד או יותר פפטידים אשר נבחר רצף ייחודי חלבון היעד מינים (כלומר "proteotypic" פפטידים) מועשרים אז מן המדגם באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים, כפי שהיא נמדדת בתחליפים stoichiometric כמותי ריכוז חלבון במדגם. לפיכך, מצמידים את דילול איזוטופ (SID) שיטות יציב (כלומר זינק ב-איזוטופ יציב הנקרא פפטיד סטנדרטי), SRM / MRM ניתן להשתמש כדי למדוד ריכוזים של פפטידים proteotypic כתחליפי עבור וכימות של חלבונים מטריצות ביולוגיות מורכבות. מבחני יש כמה יתרונות לעומת immunoassays המסורתית. ריאגנטים הם יחסית פחות יקר לייצר, הספציפיות עבור אנליטי הוא מעולה, מבחני ניתן multiplexed מאוד, העשרה ניתן לבצע מפלסמה מסודר (דלדול לא חובה), ואת הטכניקה ניתנת מגוון רחב של חלבונים או שינויים של עניין. ^8-13 בסרטון הזה אנחנו מדגימים את פרוטוקול בסיסי המותאם פלטפורמה חרוז מגנטי.

Protocol

נוהל ניסיוני:

Assay דורש פפטידים סינתטיים פפטיד אנטי נוגדנים. פפטידים נבחרים צריך להיות ייחודי לחלבון של עניין, מכילים בין 8 ל 22 חומצות אמינו, ואין ידוע שלאחר translational שינויים. שאריות מתיונין נמנעים בדרך כלל ופפטידים המכילים חומצות אמיניות dibasic (למשל KK, KR, RR) אינם רצויים. עבור טכניקה זו, מקובל להשתמש פפטידים איזוטופ יציב שכותרתו סטנדרטים פנימיים, שילוב כבד ⁽¹³ C ו ¹⁵ N) שכותרתו חומצות אמינו בתחנה הסופית-C של הפפטיד (כלומר K או R שכותרתו).

פרוטוקול הבאה מתארת ​​assay שפותחה כדי למדוד את GDSLAYGLR פפטיד מ Osteopontin החלבון העכבר, באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים המתקבל Epitomics Inc (Burlingame, CA) ו - פפטידים סינתטיים מניו אינגלנד פפטיד (גרדנר, MA). פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים (איור 1): 1) טריפסין העיכול של תערובת חלבונים מורכבים, 2) העשרה של פפטידים 3) ניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה. זה יהיה הפגינו על מדגם פלזמה אנושי מתובל החלבון Osteopontin העכבר.

1. טריפסין העיכול ניקוי האנזימטית

1. הפשירי 10 פלזמה μL aliquot מסודר על קרח רטוב.
2. קבע את ריכוז החלבון הכולל ידי assay BCA ו צנטריפוגות מדגם להסיר כל מוצקים מרחפים.
3. 10 Pipet aliquot μL מצינור האחסון שלה כדי בצלחת 1000 deepwell μL ומכסים הסרט לנקב-מסוגל.
4. הוסף 20 μL של 9M טרי אוריאה / 30mm dithiothreitol (DTT) (הריכוז הסופי 6M אוריאה / 20mm DTT) מדגם אחד.
5. דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C.
6. הוסף 3 μL של iodoacetamide 500 טרי מ"מ (IAM הסופי 50mm) מדגם זה.
7. דגירה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
8. הוספת 257 μL של 100 מ"מ טריס (pH 8) (אוריאה מדלל ל ~ 0.6M).
9. הוסף 10 μL של פתרון מניות טריפסין (1 מיקרוגרם / μL, כי האנזים 01:50: יחס המצע).
10. דגירה 37 ° C במשך הלילה (12-16 שעות).
11. הוסף 3 μL של חומצה פורמית נקי (הריכוז הסופי של% 1).
12. הוסף תקן איזוטופ יציב (סטנדרטים מרובים מתווספים אם ביצוע assay multiplexed, בדרך כלל זה על 10 fmol μL 50-100 המכיל של הפפטיד isotopically שכותרתו סטנדרטי).
13. לשטוף את הצלחת היטב עם מחסנית אואזיס μL 500 של חומצה פורמית 0.1% ב אצטוניטריל 80%, משיל את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
14. לאזן את הצלחת מחסנית על ידי הוספת 500 μL של חומצה פורמית 0.1% במים, וזורקים את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו 4 פעמים.
15. טען דגימות לעכל הצלחת מחסנית ולהתאים את חלל כל כך הזרימה היא איטית מאוד.
16. לשטוף עם μL 500 של חומצה פורמית 0.1% במים, וזורקים זרימה דרך. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
17. פפטידים Elute ידי הוספת 2 x 500 μL של חומצה פורמית 0.1% ב 80% אצטוניטריל 1000 לתוך צלחת עמוקה גם μl (לא למחוק את הזרימה דרך).
18. Lyophilize (או speedvac) eluate עד יובש. (Lyophilization היא השיטה המועדפת)
19. מחדש יבשים פפטידים על ידי הוספת 50 μL PBS + 0.03% בחורים.

2. פפטיד העשרה immunoaffinity

1. העברת דגימת לרמת Kingfisher 96 צלחות היטב.
2. הוסף 1 ו - 1.5 מיקרוגרם נוגדן μL חלבון ה-G-חרוזים מגנטיים מצופה לכל מטרה (זה אופציונלי crosslink את הנוגדן חרוזים לפני כן). ודא חרוזים מושעים היטב על ידי רעד או vortexing.
3. מכסים את הצלחת בנייר כסף.
4. דגירה לילה (12-16 שעות) עם עדין הנופל על מנת להבטיח חרוזים מושעים.
5. צנטריפוגה צלחת על XG 32 למשך 5 שניות כדי להסיר כל נוזל ממשטח האלומיניום.
6. הסר את מכסה האלומיניום.
7. כביסה elution של החרוזים יכול להתבצע באופן ידני או באופן אוטומטי. הליך זה מתאר את השלבים אוטומטית על פלטפורמת Kingfisher.
8. שטפו את החרוזים 2 פעמים עם 200 μL PBS + 0.03% בחורים (1 לדקה לשטוף).
9. שטפו את החרוזים פעם 1 עם דילול 200 01:10 μL של PBS בחורים + 0.03% (1 דקה).
10. פפטידים הם eluted ב UL 25 של חומצה אצטית 5% + בחורים 0.03%.
11. מניחים את צלחת elution על מגנט ולהעביר את eluate לצלחת 96 באר, נזהרת שלא להעביר את חרוזי שאריות.
12. מכסים את הצלחת עם מחצלת איטום.
13. צלחת המכילה את eluate מועבר ספקטרומטר מסה לשלש את quadrapole לניתוח.

3. ניתוח על ידי ניטור התגובה מרובים - ספקטרומטריית מסה

1. מעברים לניתוח SRM / MRM ניתן לבחור אופטימיזציה על ידי יציקת picomole 1 לכל פתרון microliter רמת פפטיד חומצה פורמית% 30% acetonitrile/0.1 לתוך ספקטרומטר מסה על 0.5 μL / min. לאחר ריסוס יציב מתקבל, לאסוף ספקטרום MS / MS.
2. מעברים נבחרו מקשת MS / MS ידי זיהוי threדואר יונים שבר בשפע באזור הקשת עם מעט רעש. עבור להכפיל יונים טעונים פפטיד, y-ion שברי זוהה ב m / z> מבשר m / z הם בדרך כלל הטוב ביותר עבור התפתחות SRM / MRM assay. איור 2 מציג את ספקטרום MS / MS ויונים המעבר נבחר 476.3> 508.3, 579.3 , 692.4 (מעברים עבור כבד איזוטופ יציב סטנדרט 481.3 <518.3, 589.3, 702.4 לא מוצג) עבור GDSLAYGLR הפפטיד.
3. בהתאם והדגם של ספקטרומטר מסה בשימוש, ישנם מספר פרמטרים אשר יכול להיות מותאם עבור כל מעבר. כאן, אנו אופטימיזציה האנרגיה התנגשות של כל מעבר נבחר על ידי ramping האנרגיה התנגשות ניטור רמת האות. האנרגיה של ההתנגשות 25 שימש כל מעבר.
4. בקצרה, תצורה טיפוסית לניתוח SRM / MRM הוא כדלקמן: שלב נייד (א) חומצה פורמית 0.1%; (ב) אצטוניטריל 90% / חומצה פורמית 0.1%, 0.3 x 5 מ"מ טור C18 מלכודת, 75 מיקרומטר מזהה x 15 ס"מ טור אנליטית C18 (Reprosil-פור א.ק. C18, 120 נקבוביות °). נפח הזרקה הוא 10 μL ואת מדגם נטען 5 דקות ב B 3% בקצב זרימת הכולל 3 μL / דקה ו eluted ידי שיפוע ליניארית 3-45-B% ב 300-400 NL / min ב 10 דקות. תנאי על QTRAP 4000 (ABSCIEX, פוסטר סיטי, קליפורניה) רוססו 2.3kV מתח, טמפרטורה מקור יון 150 ° C, GS1 של 12, וגז וילון 15.
5. המדגם מנותח על ידי SRM / MRM על ידי הזרקת 10 μL של המדגם. אזורים שיא משולבים עבור פפטידים קל וכבד באמצעות קו רקיע התוכנית. ¹⁴ חשב את יחס שטח השיא (PAR) של הפפטיד ללא תווית / שכותרתו במדגם כל שימוש המעבר הנפוץ ביותר כי ללא רעשי רקע, במקרה הזה, המעבר y5 (פפטיד אור 476.3 <579.3, פפטיד תקן כבד 481.3 <589.3).

4. נציג תוצאות:

נמדד יחס שטח השיא (פפטיד אור יחסית אנדוגני כדי פפטיד ממוסמר isotopically שכותרתו כבד) מספקים מידה כמותי של הפפטיד היעד. איור 3 מראה דוגמא של פפטידים chromatogram קל וכבד במדגם SISCAPA מועשר. שים לב פפטידים קל וכבד elute באותו זמן ומעברים מרובים יכול להיות פיקוח על פפטיד זה כדי לוודא את זהותו.

באיור 1. סקירה סכמטי של תהליך SISCAPA. תערובת חלבונים מורכבים מתעכל לתוך פפטידים. Analytes פפטיד ממוקד (אנליטי אנדוגני איזוטופ שכותרתו ממוסמר יציב סטנדרט פנימי) מועשרים באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים משותקת על חלבון ה-G-מצופה חלקיקים מגנטיים. בעקבות הבידוד, פפטידים ממוקדות eluted מן חלקיקים מגנטיים ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה עבור quantitation יחסית לרמת הפנימי.

איור 2. MS / MS קשת GDSLAYGLR הפפטיד מראה מבחר של שלושה שברי עבור SRM / MRM מעברים.

איור 3. Chromatograms דוגמה המציגה את פרופיל השיא של אנליטי פפטיד אור (אדום) ואת כבד איזוטופ יציב שכותרתו תקן פנימי (כחול). Chromatograms למעבר y5 מן הפפטיד אור (476.3 <579.3) ו איזוטופ יציב כבד שכותרתו סטנדרטי (481.3 <589.3) הם זממו לאורך זמן כפי שהם elute ממערכת כרומטוגרפיה.

Discussion

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול כפי שתואר הוא הבטחת החרוזים להישאר היטב מעורבת במהלך תקופת הדגירה. מתן חרוזים כדי ליישב לתחתית הבאר / בקבוקון תגרום השתנות מוגברת. חשוב גם ספין למטה נוזלי העלול להישאר בחלק העליון של הבאר / בקבוקון לאחר תקופת הדגירה. העיכול טריפסין לשחזור גם קריטי. ההליך המתואר כאן לעיכול נוצל באופן נרחב בשיתוף עם SISCAPA במעבדה שלנו, עם זאת, הוא בשיטות חלופיות סביר של מערכת העיכול יכול להיות מותאם עבור קבוצה מסוימת של חלבונים יעד ¹⁵ elution של נוגדן חופשי לא להפריע לזיהוי של. הפפטיד, סביר להניח כי את הנוגדן אינו נכלל מהעמודה או elutes יאוחר פפטידים, אבל את הנוגדן ניתן crosslinked את חרוזי חלבון G לפני העשרה זיקה בניסויים גדול או אם נוגדן חופשי הופך לבעיה. מצאנו גם את זה שימושי למקום מגנט מתחת לצלחת מדגם על autosampler כמו גם שטיפת העמודה מלכודת בכיוון ההפוך של הזרימה (לעומת טעינה) כדי להסיר כל החרוזים שיורית או חלקיקים. בנוסף הגישה חרוז מגנטי המתואר, הטכניקה ניתן גם להתאים לתבנית עמודה (כלומר זיקה כרומטוגרפיה). ^{12, 16}

לאחר שהמשתמש מרגיש נוח עם פרוטוקול הכולל, הטכניקה היא גם מקובל מספר שינויים המשפרים את assay הכוללת. ¹¹ ראשית, ניתן לנתח analytes מרובים assay אחת על ידי שילוב של נוגדנים בשלב העשרה (כלומר ריבוב). ספקטרומטר מסה הוא מסוגל לנתח בו זמנית מספר גדול של analytes. שנית, הגדלת נפח המדגם המקורי משפרת את הרגישות של assay.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם החומר	חברה	מספר קטלוגי
צלחות עמוקות גם 96-היטב 1000ul	Eppendorf	951032786
אואזיס HLB 1 סמ"ק צלחת מחסנית, ספטמבר-Pak, 40 צלחת 96 מ"ג היטב	ווטרס	186003966
Kingfisher 96 גם צלחת	תרמו פישר סיינטיפיק	97002540
נקה 96 היטב, צלחת קיר לבן	Bio-Rad	HSP9601
לסכל לחפות על צלחת יפה 96	Excelscientific	12-169
Axymat מחצלת איטום לצלחת 96 טוב	Axygen	521-01-151
X לנקב הסרט	סיגמא אולדריץ	Z722502
Kingfisher מעבד חרוז מגנטי עם ראש מגנט PCR	תרמו פישר סיינטיפיק	HSP 9601

שם החומר	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
דשן	סיגמא אולדריץ	U6031
Trizma בסיס	סיגמא אולדריץ	T1503
Dithiothreitol (DTT)	לנקב	20291	"לא, לשקול dithiothreitol"
Iodoacetamide (IAM)	סיגמא אולדריץ	I1149
טריפסין זהב	Promega	V5280
חלבון G חרוזים מגנטיים, 2.8um	Invitrogen	10004D
פוספט שנאגרו מלוחים (PBS)	תרמו פישר סיינטיפיק	L5401
בחורים	תרמו פישר סיינטיפיק	28300
חומצה פורמית	EMD	11670
אצטוניטריל	תרמו פישר סיינטיפיק	A998-1
חומצה אצטית	סיגמא אולדריץ	242853

פתרון	הערות (אופציונלי)
100 מ"מ טריס pH 8
9 M אוריאה / DTT 30 מ"מ 100 מ"מ טריס (pH 8)	חייב להיות מוכן טריים בכל פעם
500 מ"מ IAM ב 100 מ"מ טריס (pH 8)	חייב להיות מוכן טריים בכל פעם
טריפסין 1mg/mL ב-pH 100 טריס 8 מ"מ
מעכבי טריפסין 1mg/mL ב-pH 100 טריס 8 מ"מ
איזוטופ יציב סטנדרט mastermix
Anti-פפטיד נוגדן mastermix