Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

Резюме

Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела (SISCAPA) пары близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления масс-спектрометрии (MRM-MS) для обеспечения количественного определения пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. Здесь мы опишем протокол с использованием магнитных частиц в частично автоматизированные формате.

Аннотация

Существует большая потребность в количественных тестов при измерении белков. Традиционные иммунологические сэндвич, в значительной степени считается золотым стандартом в количественной, связаны с высокой стоимостью, долгое время свинца и чреваты недостатки (например, гетерофильных антител, аутоантител помех, "крюк-эффект») ^1. Альтернативная методика является близость обогащения пептидов в сочетании с количественной масс-спектрометрии, как правило, называют SISCAPA (Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела) ^2. В этой технике, близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления и обнаружения по отдельным / множественные реакции мониторинг масс-спектрометрии ( SRM / MRM-MS) обеспечивает количественное измерение пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. SRM / MRM-МС хорошо установлена ​​для точного количественного определения малых молекул, ^{3, 4} и совсем недавно был адаптирован для измерения концентрации белков в плазме крови и клеточных лизатов. ^5-7 Для достижения количественного определения белков, эти крупные молекулы перевариваются до Компонент пептидов использованием ферментов, таких как трипсин. Один или несколько выбранных пептиды, последовательность является уникальным для целевого белка в том, что виды (например, "proteotypic" пептидов) затем обогащенный из примера с использованием анти-пептидных антител и измеряется как количественными суррогаты для стехиометрической концентрации белка в образце. Таким образом, в сочетании с стабильным изотопного разбавления (SID) методов (например, шипами в стабильный изотоп меченый пептид стандарт), SRM / MRM может быть использован для измерения концентрации proteotypic пептидов в качестве суррогатов для количественного определения белков в сложных биологических матриц. Методы имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными иммуноанализа. Реагенты сравнительно дешевле генерировать, специфичность для аналита отлично, анализы могут быть очень мультиплексированных, обогащение может быть выполнена с аккуратным плазмы (без истощения требуется), и техника поддается широкий спектр белков или модификации интересов. ^8-13 В этом видео мы демонстрируем основной протокол, как адаптировать к магнитной бусины платформы.

протокол

Экспериментальные процедуры:

Анализ требует синтетические пептиды и анти-пептидных антител. Выбранный пептиды должны быть уникальными для белок, содержат от 8 до 22 аминокислот, и не известно пост-трансляционной модификации. Метионин остатков, как правило, избегали и пептиды, содержащие двухосновных аминокислот (например, KK, KR, РР) нежелательны. Для реализации этой технологии, она является общей для использования стабильных изотопов в качестве меченых пептидов внутренние стандарты, включая тяжелые ⁽¹³ С и ¹⁵ N) меченых аминокислот на С-конце пептида (т.е. К или R помечены).

Следующий протокол описывает анализа разработана для измерения пептид GDSLAYGLR от Остеопонтин белка мыши, используя анти-пептидных антител, полученных от Epitomics Inc (Burlingame, CA) и синтетических пептидов из Новой Англии пептида (Гарднер, М. А.). Протокол состоит из трех основных этапов (рис. 1): 1) Трипсин переваривания сложную смесь белков, 2) Обогащение пептиды 3) Анализ масс-спектрометрии. Он будет продемонстрирован на человека образце плазмы с шипами белка остеопонтина мыши.

1. Трипсин ферментативного пищеварения и очистки

1. Оттепель 10 мкл аккуратные аликвоты плазмы на льду.
2. Определение общей концентрации белка с помощью анализа ДСС и центрифуги образец для удаления взвешенных твердых частиц.
3. Внесите 10 мкл от его хранения трубки 1000 мкл пластины Дипуэлл и накрыть Pierce-в состоянии фильма.
4. Добавьте 20 мкл свежей 9 месяцев мочевины / 30mm дитиотреитол (DTT) (конечная концентрация 6М мочевины / 20 мМ DTT) для каждого образца.
5. Инкубировать 30 минут при 37 ° C.
6. Добавить 3 мкл свежей 500 мМ iodoacetamide (окончательный IAM 50 мм) для каждого образца.
7. Инкубируйте в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре.
8. Добавить 257 мкл 100 мМ трис (рН 8) (разбавляет мочевины до ~ 0,6 М).
9. Добавьте 10 мкл исходного раствора трипсина (1 мкг / мкл, для 1:50 фермент: субстрат отношение).
10. Инкубируйте 37 ° С в течение ночи (12-16 часов).
11. Добавить 3 мкл аккуратные муравьиной кислоты (конечной концентрации 1%).
12. Добавить стабильный изотоп стандартных (множественные стандарты добавляется, если выполнение мультиплексный анализ, как правило, это около 10 мкл содержащего 50-100 фмоль стандартной изотопно меченного пептида).
13. Промыть пластины Oasis картридж хорошо с 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитрила, отбрасывая проточные. Повторите это 3 раза.
14. Равновесия картридж пластины, добавив 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, и отбросить проточные. Повторите 4 раза.
15. Нагрузка переварить образцы пластину картриджа и регулировать вакуум таким потоком идет очень медленно.
16. Промыть 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, и отбросить проточные. Повторите это 3 раза.
17. Элюции пептидов, добавив 2 х 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитрила в 1000 мкл глубоких скважин пластины (не выбрасывайте проточные).
18. Lyophilize (или speedvac) элюата досуха. (Лиофилизации является предпочтительным методом)
19. Развести сухой пептидов добавлением 50 мкл PBS + 0,03% CHAPS.

2. Пептид иммуноаффинной обогащения

1. Передача образца стандартных Kingfisher 96-луночных.
2. Добавьте 1 мкг антител и 1,5 мкл белка-G покрытием магнитных гранул в год (это не является обязательным для сшивания антитела к бисера перед добавлением). Обеспечить бисер хорошо подвешен при встряхивании или вортексе.
3. Обложка пластинки с пленкой.
4. Инкубируйте ночь (12-16 часа) с нежным акробатика для обеспечения бисер приостановлено.
5. Центрифуга пластины на 32 мкг в течение 5 секунд, чтобы удалить жидкость из поверхности фольги.
6. Удалить фольгу крышку.
7. Стиральные и элюирование бусины могут быть выполнены вручную или в автоматическом режиме. Эта процедура описывает шаги автоматизированы на Kingfisher платформы.
8. Вымойте бисером 2 раза с 200 мкл PBS + 0,03% CHAPS (1 минута за мытье).
9. Вымойте бисером 1 раз в 200 мкл 1:10 разбавление PBS + 0,03% CHAPS (1 минута).
10. Пептиды элюировали в 25 мкл 5% уксусной кислоты + 0,03% CHAPS.
11. Место элюирования пластину на магнит и передачи элюата в 96 ячейках, заботясь не передавать остатки бус.
12. Обложка пластинки с уплотнением мат.
13. Пластины, содержащей элюата доставляется тройной quadrapole масс-спектрометр для анализа.

3. Анализ по нескольким мониторинга реакции - масс-спектрометрии

1. Переходы для SRM / MRM анализа могут быть выбраны и оптимизированы вливая 1 picomole на микролитр решение пептид стандарт в 30% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты в масс-спектрометр на 0,5 мкл / мин. После стабильного распыления получается, собирать MS / MS спектра.
2. Переходы выбираются из MS / MS спектр путем выявления Автошоуэлектронной обильные ионов фрагмента в области спектра с небольшим шумом. Для многозарядных ионов пептид, у-ионные фрагменты обнаружены на т / г> предшественником т / г, как правило, лучше всего для SRM / MRM анализа развития. Рисунок 2 показывает, MS / MS спектр и отдельных ионов переходных 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (переходы для тяжелого стабильного изотопа стандартных 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 не показан) для пептида GDSLAYGLR.
3. В зависимости от марки и модели использован масс-спектрометр, Есть несколько параметров, которые могут быть оптимизированы для каждого перехода. Здесь, мы оптимизировали столкновения энергия каждого выбранного перехода наращивает энергию столкновения и мониторинга уровня сигнала. Энергии столкновения в 25 был использован для каждого перехода.
4. Одним словом, типичная конфигурация для SRM / MRM анализа выглядит следующим образом: Подвижная фаза () 0,1% муравьиной кислоты; (б) 90% ацетонитрил / 0,1% муравьиной кислоты, 0,3 х 5 мм C18 колонка ловушка, 75 мкм ID х 15 см C18 аналитическую колонку (Reprosil-Пур C18 AQ, 120 A ° поры). Инъекции объемом 10 мкл и образец загружается в течение 5 минут при 3% B на общую скорость потока 3 мкл / мин и элюировали линейным градиентом от 3 - 45% В при 300 - 400 Нл / мин в течение 10 мин. Условия на 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) были брызги напряжения 2.3kV, ионная температура источника 150 ° С, GS1 12, и занавес газа 15.
5. Образец проанализирован SRM / MRM путем введения 10 мкл образца. Пик областях интегрированы для легких и тяжелых пептидов с помощью программы Skyline. ¹⁴ Рассчитать пик соотношение площади (PAR) немеченого / меченого пептида в каждом примера с использованием наиболее распространенных перехода, который свободен от фонового шума, в данном случае, переход y5 (светло пептид 476,3> 579,3, тяжелые стандартных пептидных 481,3> 589,3).

4. Представитель Результаты:

Измеренные пик соотношения площади (свет эндогенных относительной пептид шипами тяжелых изотопно меченного пептида) обеспечивают количественную меру целевой пептид. Рисунок 3 показывает пример хроматограммы легких и тяжелых пептидов в SISCAPA обогащенного образца. Обратите внимание, что легкие и тяжелые пептидов элюируются в то же время и многочисленные переходы можно отслеживать для каждого пептида для подтверждения личности.

Рисунок 1. Схематический обзор процесса SISCAPA. Сложная смесь белка усваивается на пептиды. Целевые пептидных аналитов (эндогенные аналита и шипами стабильного изотопа меченных внутренний стандарт) обогащены с использованием анти-пептидных антител иммобилизованных на Protein G-покрытием магнитных частиц. После изоляции, целевые пептиды элюируют из магнитных частиц и проанализированы масс-спектрометрии для количественного относительно внутреннего стандарта.

Рисунок 2. MS / MS спектр пептидных GDSLAYGLR показывает выбор из трех фрагментов для SRM / MRM переходами.

Рисунок 3. Пример хроматограммы показывает пик профиля свет анализируемого пептида (красный) и тяжелый стабильный изотоп меченных внутреннего стандарта (синий). Хроматограммы для y5 переход от света пептид (476,3> 579,3) и тяжелого стабильного изотопа помечены стандарт (481,3> 589,3) нанесены в течение долгого времени, как они элюируются из хроматографии системы.

Обсуждение

Наиболее важным шагом в протокол, как описано, является обеспечение бисером остаются хорошо перемешанных в течение инкубационного периода. Разрешение бисером осели на дно колодца / флакон приведет к увеличению изменчивости. Важно также, чтобы спин-вниз любой жидкости, которые могут остаться на вершине и / флакон следующие инкубационного периода. Воспроизводимые пищеварения трипсина также имеет важное значение. Процедуры для пищеварения, описанные здесь был использован широко в нашей лаборатории совместно с SISCAPA, однако, вполне вероятно, альтернативные методы пищеварения может быть оптимизирована для данного набора белков-мишеней ¹⁵ Элюирование свободных антител не мешает обнаружению. пептид, вероятно, потому что антитела, исключается из столбца или элюируется позднее пептидов, но антитела могут быть сшиты с гранулами Protein G до близости обогащения в крупных экспериментов или при наличии свободных антител становится проблемой. Кроме того, мы сочли целесообразным поместить магнит ниже образец пластина на автосамплером а также стирку ловушку колонки в обратном направлении потока (по сравнению с загрузкой), чтобы удалить остатки бисера или частиц. В дополнение к магнитной бусины подход, описанный, метод также может быть адаптирована к колонке формате (т.е. аффинная хроматография). ^{12, 16}

После того как пользователь комфортно с общим протоколом, техника также поддаются несколько модификаций, которые повышают общий анализ. ^{11-первых,} это возможность анализировать несколько аналитов в одном анализе, комбинируя антитела в обогащении шаг (т.е. мультиплексирование). Масс-спектрометр, способный одновременно анализировать большое количество аналитов. Во-вторых, увеличение объема исходного образца повышает чувствительность анализа.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название материала	Компания	Номер в каталоге
1000ul глубоких скважин 96-луночных	Эппендорф	951032786
Oasis HLB 1 мл картридж плиты, сентябрь-пак, 40 мг 96 ячейках	Воды	186003966
Kingfisher 96 ячейках	Thermo Fisher Scientific	97002540
Открытый 96 лунок, белая пластина стене	Bio-Rad	HSP9601
Фольга крышки для 96-луночного планшета	Excelscientific	12-169
Axymat Уплотнительная коврик для 96-луночного планшета	Axygen	521-01-151
X пробить фильм	Sigma-Aldrich	Z722502
Kingfisher магнитной бусины процессор с головой магнит ПЦР	Thermo Fisher Scientific	HSP 9601

Название материала	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Мочевина	Sigma Aldrich	U6031
Trizma базы	Sigma Aldrich	T1503
Дитиотреитол (DTT)	Проколоть	20291	"Нет-весить дитиотреитол"
Iodoacetamide (IAM)	Sigma Aldrich	I1149
Трипсин золото	Promega	V5280
Protein G магнитных бус, 2.8um	Invitrogen	10004D
Фосфат-солевом буфере (PBS)	Thermo Fisher Scientific	L5401
CHAPS	Thermo Fisher Scientific	28300
Муравьиная кислота	EMD	11670
Ацетонитрил	Thermo Fisher Scientific	A998-1
Уксусная кислота	Sigma Aldrich	242853

Решение	Комментарии (необязательно)
100 мМ Трис рН 8
9 M мочевины / 30 мМ DTT в 100 мМ Трис (рН 8)	должен быть готов каждый раз свежее
500 мМ IAM в 100 мМ Трис (рН 8)	должен быть готов каждый раз свежее
Трипсин 1mg/mL в 100 мМ Трис рН 8
Ингибитор трипсина 1mg/mL в 100 мМ Трис рН 8
Стабильный изотоп стандартных Mastermix
Анти-пептид антител Mastermix