Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Özet

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Özet

Proteinlerin ölçümünde kantitatif testleri için büyük bir ihtiyaç vardır. Ölçümde büyük ölçüde altın standart olarak kabul Geleneksel sandviç immunoassay, yüksek maliyetli, uzun teslim süresi ile ilişkilidir ve sakıncaları (örneğin antikorlar, otoantikor girişim, 'kanca etkisi') ile ^doludur. 1 alternatif bir tekniktir zenginleştirme yakınlığına . peptidlerin kantitatif kütle spektrometresi ile birleştiğinde, genellikle SISCAPA (Anti-Peptid Antikorlar Kararlı İzotop Standartları ve Capture) olarak adlandırılan bu teknikte ² / çoklu seçilen reaksiyon izleme kütle spektrometresi ile stabil izotop seyreltme ve algılama ile peptitler afinite zenginleştirme ( SRM / MRM-MS), peptidler, kendi proteinler vekilleri olarak kantitatif ölçüm sağlar. SRM / MRM-MS, küçük ^{moleküllerin 3,} 4 doğru kantitatif için kurulan ve daha yakın zamanda, plazma ve hücre lizatları proteinlerinin düzeyini ölçmek için adapte edilmiştir. Proteinlerin kantitatif ^ulaşmak için 5-7, bu büyük moleküllerin sindirilir bileşeni peptidler gibi tripsin gibi bir enzim kullanarak. Dizisi bu türün hedef protein (yani "proteotypic" peptitler) özgü bir veya daha fazla seçilmiş peptidler daha sonra anti-peptid antikorları kullanarak örnek zenginleştirilmiş ve kantitatif stokiyometrik vekilleri örnek protein konsantrasyonu olarak ölçülür. Bu nedenle, stabil izotop seyreltme (SID) yöntemleri (yani bir çivili-peptid standart etiketli stabil izotop), SRM / MRM karmaşık biyolojik matrisler proteinlerin ölçümü için vekilleri gibi proteotypic peptidlerin konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılan olabilir. Akuple Deneyleri geleneksel immunoassay göre bazı avantajları vardır. Reaktifler oluşturmak için nispeten daha az pahalı, özgüllüğü analit için mükemmel, testlerin son derece çoğullanır zenginleştirme düzgün plazma (tükenmesi gerekli) yapılan ve tekniği, proteinler ya da değişiklikler geniş bir yelpazeye uygun olabilir bir manyetik boncuk platformuna adapte olarak bu video ilgi. ^8-13 temel protokol göstermektedir.

Protokol

Deneysel İşlemler:

Tahlil sentetik peptidler ve anti-peptid antikorları gerektirir. Seçilen peptidler ilgi protein benzersiz olması, 8 ila 22 amino asitleri içeren ve bilinen hiçbir post-translasyonel modifikasyonlar olmalıdır. Methionine artıkları genellikle kaçınılması ve çift bazlı amino asitler (örneğin, KK, KR, RR) içeren peptidler arzu edilmez. Bu teknik için, ⁽¹³ C ve ¹⁵ N), C-peptid terminus (yani K veya R etiketli) amino asitler etiketli ağır içeren kararlı izotop etiketli peptidler, iç standartlar gibi kullanmak yaygındır .

Aşağıdaki protokol Epitomics A.Ş. (Burlingame, CA) ve New England Peptid (Gardner, MA) sentetik peptidler elde edilen anti-peptid antikorları kullanarak, fare protein osteopontin, peptid GDSLAYGLR ölçmek için geliştirilen bir test açıklamaktadır. 1) peptidler zenginleştirilmesi 3) kütle spektrometresi ile analizi karmaşık protein karışımı, 2 tripsin sindirim): Bu protokol, üç temel aşamadan oluşmaktadır (Şekil 1). Bu fare osteopontin protein ile çivili bir insan plazma örnek gösterilecektir.

1. Tripsin enzimatik sindirim ve temizlik

1. Islak buz üzerinde 10 mcL düzgün plazma kısım çözülme.
2. BCA yöntemi ile total protein konsantrasyonu belirlemek ve askıda katı madde kaldırmak için örnek santrifüj.
3. 1000 mcL derin kuyucuklu plaka delmek mümkün film ile kaplayın ve depolama tüp pipetleyin 10 mcL kısım.
4. Her bir numune üre / 30mm dithiothreitol (DTT) (son konsantrasyon 6M üre / 20mm DTT) taze 9M 20 mcL ekleyin.
5. 37 az 30 dakika boyunca inkübe ° C
6. Her bir numune için taze 500 mM iodoacetamide (son IAM 50mm) 3 mcL ekleyin.
7. Oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
8. 100 mM Tris (pH 8) (~ 0.6M sulandırır üre) 257 mcL ekleyin.
9. Tripsin stok solüsyonu (;: 01:50 enzim substrat oranı 1 mikrogram / mcL) 10 mcL ekleyin.
10. Inkübe 37 ° C gece (12-16 saat).
11. Düzgün formik asit (% 1 final konsantrasyon) 3 mcL ekleyin.
12. Stabil izotop standart (çoğullanır tahlil yapmak, genellikle bu 10 mcL standart isotopically etiketli peptid içeren 50-100 fmol hakkında ise birden fazla standartları eklenir) ekleyin.
13. Oasis kartuş plaka ile% 80 asetonitril atarak akışı ile% 0.1 formik asit 500 mcL yıkayın. Bu 3 kez tekrarlayın.
14. 500 mcL% 0.1 formik asit su ekleyerek kartuşu plaka dengelenmesi ve flow-through atın. Bu 4 kez tekrarlayın.
15. Kartuş plaka sindirmek numuneleri yükleyin ve akışı çok yavaş bu yüzden vakum ayarlayabilirsiniz.
16. 500 mcL% 0.1 formik asit su ile yıkayın ve flow-through atın. Bu 3 kez tekrarlayın.
17. 1000 ul derin kuyu plakasına% 80 asetonitril% 0.1 formik asit, 2 x 500 mcL ekleyerek Zehir peptidler (flow-through atmayın).
18. Eluat kuruyacak kadar (ya da speedvac) Lyophilize. (Liyofilizasyon tercih edilen yöntem)
19. Sulandırın 50 mcL PBS +% 0.03 ahbap ekleyerek peptidler kurutulur.

2. Peptid immünoafinite zenginleştirme

1. Standart Kingfisher 96 kuyucuğu örnek aktarın.
2. 1 mg antikor ve ortalama 1.5 mcL hedef Protein-G kaplı manyetik bilye (yanı sıra boncuklar önce antikor çapraz isteğe bağlıdır) ekleyin. Emin olun boncuk iyi sallayarak veya vorteks askıya alınır.
3. Plaka folyo ile örtün.
4. Nazik boncuk askıya sağlamak için yuvarlanan (12-16 saat) gece inkübe edin.
5. Folyo yüzeyi herhangi bir sıvı kaldırmak için 5 saniye boyunca 32 xg'de plaka santrifüjleyin.
6. Folyo kapağını çıkarın.
7. Yıkama ve elüsyon boncuklar elle ya da otomatik bir şekilde yapılabilir. Bu prosedür Kingfisher bir platform üzerinde otomatik adımları açıklar.
8. 200 mcL PBS +% 0.03 ahbap (1 dakika Yıkama başına) boncuk, 2 kez yıkayın.
9. PBS 200 mcL 1:10 seyreltme +% 0.03 ahbap (1 dakika) ile boncuk, 1 kez yıkayın.
10. % 5 asetik asit +% 0.03 ahbap 25 uL peptidler kolonda sürüklenecektir.
11. Bir mıknatıs elüsyon plaka koyun ve artık boncuk aktarmak için özen, 96 plaka eluat transfer.
12. Sızdırmazlık mat plaka Kapak.
13. Eluat içeren plaka, analiz için üçlü quadrapole kütle spektrometresi teslim edilir.

3. Birden fazla reaksiyon izleme Analizi - kütle spektrometresi

1. SRM / MRM analizi için Geçişler 0.5 mcL / dak kütle spektrometresi% 30 acetonitrile/0.1% formik asit peptid standart mikrolitrelik çözüm başına 1 picomole beslerken tarafından seçilen ve optimize edilebilir. Istikrarlı sprey elde edilir, bir MS / MS spektrum toplamak.
2. Geçişler thre belirleyerek MS / MS spektrum seçilene biraz gürültü ile yelpazenin bir bölgede bol parçası iyonları. Çarpın ücret peptid iyonları için, y-iyon parçaları, z> m / s tespit habercisi m / z genellikle SRM / MRM testinin geliştirilmesi için en iyisidir. Şekil 2 476,3 MS / MS spektrumu ve seçilen geçiş iyonlar> 508,3, 579,3 peptid GDSLAYGLR 692,4 (ağır stabil izotop standart 481,3 geçişler> 518,3, 589,3, 702,4 gösterilir).
3. Kullanılan kütle spektrometresi marka ve modeline bağlı olarak, her geçiş için optimize edilebilir birden çok parametre vardır. Burada seçilen her geçiş çarpışma enerjisi çarpışma enerjisi Ramping ve sinyal seviyesi izleme optimize edilmiş. Her geçiş için 25 bir çarpışma enerjisi kullanıldı.
4. Kısaca, aşağıdaki gibi SRM / MRM analizi için tipik bir yapılandırma: Mobil faz (A)% 0.1 formik asit (B)% 90 Asetonitril /% 0.1 formik asit, 0,3 x 5 mm C18 tuzak sütun, 75 mikron ID x 15 cm C18 analitik kolon (Reprosil-Pur C18 AQ, 120 A ° gözenek). Enjeksiyon hacmi 10 mcL ve örnek toplam akış oranı% 3 B 5 dakika yüklü 3 mcL / dk ve 3 doğrusal bir degrade tarafından yıkandı,% 45 - 300 B - 10 dakika içinde 400 nL / dak. 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) Koşullar sprey gerilim 2.3kV, iyon kaynağı sıcaklığı 150 ° C, 12 GS1 ve perde gaz 15.
5. Örnek, numune 10 mcL enjekte edilerek SRM / MRM tarafından analiz edilir. Pik alanları program Skyline kullanarak hafif ve ağır peptidler için entegre ^14, bu durumda, arka plan gürültü ücretsiz en bol bulunan bir geçiş kullanarak her bir örnek etiketsiz / etiketli peptid pik alan oranı (PAR), Y5 geçiş hesaplayın. (ışık peptid 476,3 579,3, ağır standart peptid 481,3 589,3).

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Ölçülen pik alan oranları (çivili ağır isotopically etiketli peptid ışık endojen peptid akrabası) hedef peptid nicel bir ölçüsüdür. Şekil 3, hafif ve ağır bir SISCAPA zenginleştirilmiş örnek peptidlerin bir örnek kromatogram gösterir . Aynı zamanda ve çoklu geçişler Zehir hafif ve ağır peptidler peptid kimliğini teyit etmek için her için takip edilebilir unutmayın.

Şekil 1 SISCAPA süreci şematik bir bakış. Karmaşık bir protein karışımı peptidlerin içine sindirilir. Hedeflenen peptid analitler (endojen analit ve çivili bir kararlı izotop etiketli internal standart) Protein G-kaplı manyetik parçacıklar üzerinde immobilize anti-peptid antikorları kullanarak zenginleştirilmiştir. Izolasyonundan sonra, hedeflenen peptidler manyetik partiküller yıkandı, ve iç standart göre kantitatif için kütle spektrometresi ile analiz.

Şekil 2 SRM / MRM geçişler için üç parça seçimi gösteren peptid GDSLAYGLR MS / MS spektrumu.

Şekil 3, hafif bir peptid analitin tepe profili (kırmızı) ve ağır stabil izotop etiketli internal standart (mavi) gösteren örnek kromatogramlar . Kromatografi sistemi Zehir gibi ışık peptid (476,3 579,3) ve ağır stabil izotop etiketli Y5 geçiş için Kromatogramlar standart (481,3 589,3) zamanla çizilir.

Tartışmalar

Tarif edildiği gibi, protokolde en kritik adım boncuk kuluçka dönemi boyunca iyi karıştırılmış kalır sağlanmasıdır. Boncuk iyi / flakon altına yerleşmek için izin artan değişkenlik neden olacaktır. Aynı zamanda önemli bir kuluçka dönemi sonrasında iyi / flakon üstüne kalır herhangi bir sıvı aşağı spin. Tekrarlanabilir tripsin sindirim da önemlidir. Ancak, sindirim muhtemel alternatif yöntemleri, belirli bir hedef proteinlerin için optimize edilmiş ^olabilir 15 Elüsyon ücretsiz antikor tespiti ile karışmaz; sindirim için prosedür SISCAPA ile birlikte laboratuvarda yaygın olarak kullanılmıştır Burada anlatılan antikor peptidler daha sonra sütun veya elutes hariç, ama antikor büyük deneylerde ya da serbest antikor varsa afinite zenginleştirme önce Protein G boncuk çapraz olabilir çünkü büyük olasılıkla peptid, bir sorun olur. Biz de herhangi bir kalıntı boncuk veya parçacıklar kaldırmak için örnek otosampler plakası gibi, akış ters yönde tuzak sütun yıkama altında bir mıknatıs (yükleme karşılaştırıldığında) yerleştirmek için yararlı bulduk. Açıklanan manyetik boncuk yaklaşıma ek olarak, tekniği de bir sütun biçiminde (yani afinite kromatografisi) adapte olabilir ^{12, 16}

Kullanıcı genel bir protokol ile rahat sonra, bu teknik, aynı zamanda genel analiz geliştirmek bazı değişiklikler ^için uygun. İlk 11, birden fazla analitler zenginleştirme adım (yani çoklama) antikorlar birleştirerek tek bir tahlil analiz etmek mümkündür. Kütle spektrometresi, aynı anda çok sayıda analitlerin analiz yeteneğine sahiptir. İkinci olarak, orijinal örnek hacminin artırılması testin duyarlılığını artırır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Malzemenin Adı	Şirket	Katalog numarası
1000ul Derin kuyu 96-kuyu tabak	Eppendorf	951032786
Oasis HLB 1 cc kartuş plaka, Eyl-pak, 40 mg 96 plaka	Waters	186003966
Kingfisher 96 plaka	Thermo Fisher Scientific	97002540
96, beyaz duvar tabağı temizleyin	Bio-Rad	HSP9601
96 plaka için kapak Folyo	Excelscientific	12-169
96 plaka Axymat Sızdırmazlık mat	Axygen	521-01-151
X delmek film	Sigma-Aldrich	Z722502
Kingfisher PCR mıknatıs kafa ile manyetik boncuk işlemci	Thermo Fisher Scientific	HSP 9601

Malzemenin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Üre	Sigma Aldrich	U6031
Trizma baz	Sigma Aldrich	T1503
Dithiothreitol (DTT)	Delmek	20291	"Dithiothreitol no-tartmak"
Iodoacetamide (IAM)	Sigma Aldrich	I1149
Tripsin Altın	Promega	V5280
Protein G manyetik boncuk, 2.8um	Invitrogen	10004D
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Thermo Fisher Scientific	L5401
Chaps	Thermo Fisher Scientific	28300
Formik asit	EMD	11670
Asetonitril	Thermo Fisher Scientific	A998-1
Asetik asit	Sigma Aldrich	242853

Çözüm	Yorumlar (isteğe bağlı)
100 mM Tris pH: 8
9 M, 100 mM Tris (pH 8) üre / 30 mM DTT	Her zaman taze hazırlanmış olmalıdır
100 mM Tris 500 mM IAM (pH 8)	Her zaman taze hazırlanmış olmalıdır
100 mM Tris, pH 8 tripsin 1mg/ml
100 mM Tris, pH 8 tripsin inhibitörü 1mg/ml
Kararlı izotop standart Mastermix
Anti-peptid antikor Mastermix