المؤشرات الحيوية في نموذج حيواني لكشف الاقتران العصبية، الدموية، والسلوكية للPTSD

Summary

نحن وصفا لنموذج الفئران من اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) أن يكشف عن التعديلات المستمرة في وظيفة الغدد الصم العصبية وتأخر طويل الأجل، استجابة الخوف المبالغ فيه، سمة من المرضى PTSD. النموذج الحيواني والأساليب المذكورة هنا هي مفيدة لربط المؤشرات الحيوية في الدماغ نوى، وهي الآلية ولكن لا يمكن أن يقاس في المرضى، مع المؤشرات الحيوية في خلايا الدم البيضاء الطرفية، والتي يمكن.

Abstract

تحديد المؤشرات الحيوية التي تمثل تطور الفيزيولوجيا المرضية من اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) أمر في غاية الاهمية، ليس فقط من أجل تشخيص موضوعي ولكن أيضا لتقييم الكفاءة العلاجية والقدرة على مواجهة الصدمات. يتم توجيه البحوث الجارية إلى تحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية لاضطرابات ما بعد الصدمة، بما في ذلك البروتينات الصدمة الناجمة، transcriptomes، الفروق الجينية والوراثية جهري، وذلك باستخدام عينات بيولوجية من الدم الموضوعات '، اللعاب، البول، وأنسجة المخ بعد الوفاة. ومع ذلك، فإن العلاقة بين هذه الجزيئات العلامات البيولوجية في عينات الطرفية أو بعد الوفاة لتغيير وظائف المخ المرتبطة الأعراض النفسية في اضطرابات ما بعد الصدمة لا تزال دون حل. هنا، نقدم نموذج حيواني من اضطرابات ما بعد الصدمة التي على حد سواء الدم المحيطي والمؤشرات الحيوية الدماغ الوسطى، فضلا عن النمط الظاهري السلوكية، يمكن جمعها وقياسها، وبالتالي توفير الارتباط اللازمة من المؤشرات الحيوية المركزي PTSD، وهي الآلية وpathognoولكن لا يمكن أن تجمع مونيك من الناس، مع المؤشرات الحيوية الظواهر السلوكية والطرفية، والتي يمكن.

نموذجنا الحيوانية من PTSD توظف ضبط النفس والصدمات المتكررة الذيل لمدة ثلاثة أيام متواصلة - والذي لا مفر منه ذيل للصدمة نموذج (ITS) في الفئران. هذا النموذج ITS يحاكي الفيزيولوجيا المرضية من اضطراب ما بعد الصدمة ^{17، 7، 4، 10.} تحققنا وغيرها أن يدفع نموذجها التعديلات السلوكية والعصبية الحيوية مشابهة لتلك الموجودة في مواضيع PTSD ^{17، 7، 10، 9.} على وجه التحديد، فإن هذه الفئران المتوترة يحمل (1) لتأخر الاستجابة ومبالغ فيها جفل تظهر بعد عدة أيام من وقف الضغوطات التي نظرا لحجم الوقت مضغوط من حياة الفئران مقارنة مع البشر، يتوافق مع تأخير شهر واحد إلى ثلاثة من أعراض في المرضى الذين يعانون اضطرابات ما بعد الصدمة (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E ^13)، (2) تعزيز البلازما كورتيزون (CORT) لعدة أيام، مشيرا إلى حل وسط من محور hypothalamopituitary (HPA)، و (3) بو المتخلفيندى زيادة الوزن بعد الإقلاع عن الضغوطات، مشيرا إلى خلل في تنظيم الأيض.

والنماذج التجريبية المستخدمة لهذا النموذج هي: (1) نموذج العجز المكتسب في الفئران يعاير بواسطة قياس ردود الفعل المفاجئة الصوتية (ASR)، ورسم من كتلة الجسم، (2) تسليخ مجهري من الدماغ الفئران في المناطق ونوى، ( 3) انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) لمستويات الدم من CORT، (4) التعبير الجيني لميكروأري بالإضافة إلى الأدوات المعلوماتية الحيوية ذات الصلة ^18. هذا ميكروأري، يطلق عليها اسم rMNChip، يركز على جينات الميتوكوندريا النووي والميتوكوندريا ذات الصلة في الفئران وذلك لتتناول على وجه التحديد الطاقة الحيوية العصبية افترض أن تشارك في PTSD.

Protocol

1. نموذج حيواني السلوكية من اضطرابات ما بعد الصدمة

1. المواضيع: ذكر البيضاء تستخدم الفئران سبراغ داولي (مزارع تاكونيك، Derwood، MD)، الترجيح 150 حتي 200 غرام في وقت إدارة البروتوكول الإجهاد.
2. قياس كمية الغذاء والماء، والزيادة في وزن الجسم: ولدى وصوله في الفئران المختبرية وزنها 100 ± 25 غ إيواء اثنين إلى قفص (حجم القفص: 45x24x20 سم). قفص الركيزة الحشو (نشارة الخشب) يتم تغيير مرتين أسبوعيا. يتم الاحتفاظ الحيوانات على عكس الضوء دورة 12-HR (أضواء على: 1800/0600 و OFF: 0600-1800) في درجة حرارة (22 ± 4 ° C) - والرطوبة النسبية (30-70٪) التي تسيطر عليها البيئة أسبوع واحد قبل التجارب. المياه ومكعبات القياسية تشاو (هارلان (2018) القوارض البروتين 18٪ النظام الغذائي، والوجبات الغذائية العالمية، هارلان Teklad) هي متاحة بحرية في أقفاص المنزل، وتسجل يوميا bodyweights قبل 3 أيام و 3 أيام و 3 أيام خلال بعد وقف الضغط .
3. وتأقلم الفئران لمدة ثلاثة أيام لبو: تأقلمال مرفق الحيوانية ودائرة جفل الصوتية. حتى يتأقلم منهم إلى الدائرة جفل الصوتية، يتم التعامل مع الحيوانات في ذلك لمدة 5 دقائق كل يوم لمدة ثلاثة أيام متتالية قبل القياسات الأولية.
4. وشدد البروتوكول: يتم تعيين هذه الحيوانات على حد سواء لكل مجموعة على أساس وزن الجسم وردود الفعل المفاجئة خط الأساس. ويتم اختبار على مجموعتين من الحيوانات، كل مجموعة تتألف من 16 الحيوانات. المجموعة 1 يستقبل بروتوكول الإجهاد، والمجموعة 2 هو عنصر التحكم.
   تكرار التعرض بروتوكول الإجهاد المستمر هو 2-HR الداخلي، حيث كل دورة تتكون من ضبط النفس ("لا مفر منه") والصدمات الذيل، مرة واحدة يوميا على مدى 3 أيام متتالية. ويتم ذلك مؤكدا في الصباح (ضمن إطار الساعة 0800 و 1200). ويجري ضبط النفس من قبل الحيوانات يجمد في أنبوب شبكي التهوية. يتم تسليم لذيولها في شبه عشوائي فترات من 150 طن؛ الأربعين صدمات كهربائية (الشبكة الحيوان قفص اختبار الدور المفزع، الآلات Coulbourn، USA 2 مللي أمبير، 3 ثانية مدتها)س 210 ثانية (الجرافيك برامج الترميز الدولة، وصلة Habitest العالمي، Coulbourn الصكوك، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد تم اختيار التحفيز في MA 2 لأنه مكره، ولكن المؤلم لم يكن كذلك، عندما يتم وضع الإصبع عبر تحفيز الانتاج المجرب ل. يتم تطبيق هلام الكهربائي باستخدام Q-تلميح لتشكل طبقة رقيقة من الجل بين إجراء القطب والجلد من ذيل فأر. تم تعديل مقاطع الكهربائي ومتصلا الذيل لضمان اتصال جيد دون التأثير على الدورة الدموية من الذيل.
5. وقد أجريت الصوتية قياس ردود الفعل المفاجئة مع نظام الاستجابة الصوتية باغت اختبار (Coulbourn الصكوك، كولومبوس، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية) ^3: الاستجابة الصوتية باغت (ASR). هذا النظام يتكون من الوزن حساسة منصات في غرفة الصوت الموهن. ومحول، وهو قياس الضغط، في كل من منصات جفل يتطلب معايرة قبل الاستخدام. أولا، يجب أن تكون وصلة الربط في وضع يقترن DC للمعايرة. في هذا الوضع، دي في انتاج مقرنةrectly يلي مدخلات من المنصة، وطريقة المعايرة المطلوبة لمع الأوزان ثابتة. يتم فيها تشغيل محول إلى وضع يقترن AC خلال التجارب مني بأن التغيير السريع في القوة فقط، مما يدل على ردود الفعل المفاجئة، هو الإخراج. وبالتالي يتم قياس تحركات الحيوانات استجابة للمؤثرات الصوت وتغيير الجهد من قبل قياس الضغط داخل كل منصة وكما هو مسجل الاستجابة القصوى التي تحدث داخل 200 مللي ثانية من بداية التحفيز جفل-انتزاع.
   هناك ستة أنواع من المحاكمات التحفيز: 100 ديسيبل وحدها، 100 ديسيبل مع نبض قبل، 110 ديسيبل وحدها، و 110 ديسيبل مع ما قبل النبض، وحدها قبل النبض وعدم التحكم التحفيز. وقدم كل نوع المحاكمة ثماني مرات. يتم عرض أنواع المحاكمة في ترتيب عشوائي لتجنب الآثار النظام والتعود. بين فترات تتراوح عشوائيا محاكمة 15 حتي 25 ثانية. بين المحاكمات الثماني فقط يتم جمع القيم القصوى في النتائج وتعديلها وأخيرا مع الحيوان من وزن الجسم في اليوم نفسه. ويتم اختبار الحيوانات طراز B يومefore الإجهاد أو أي معاملة أخرى وقراءة خط الأساس و 1 و 7 و 14 و 21 يوما بعد اليوم الأخير من أيام 3 متتالية من إجراء الإجهاد أو العلاج الأخرى.
6. تحليل البيانات:
   1. ASR: اتساع ردود الفعل المفاجئة الصوتية اختبار يتم تمثيل كل وقت "٪ من خط الأساس"، والذي يحسب باستخدام المعادلة:٪ من خط الأساس = (مطلق السعة / خط الأساس السعة المطلقة) × 100٪. عن كل يوم اختبار، يتم تنفيذ تدابير لANOVAs المتكررة على سعة جفل مع عوامل التوتر وحالة الجرعات باستخدام SPSS المخدرات (النسخة 16) البرمجيات. وتستخدم توكي، Bonferroni، أو Dunnett اختبارات لتقييم مهمة خاصة بعد الخلافات بين المجموعات الفردية. يتم تمثيل البيانات في يعني ± SEM
   2. النمو: يتم قياس وزن الجسم واستهلاك الطعام والماء على الإجهاد -1 اليوم السابق على يوم و14 و 21 و 30 بعد استكمال بروتوكول الإجهاد. التحليل الإحصائي: تتعرض البيانات تناول الطعام والماء لمدةطريقة المتكررة تدابير تحليل التباين (ANOVA). لتحليل التغيرات في معدل استهلاك الغذاء مع مرور الوقت، وتنقسم كذلك إلى كمية الطعام المتناولة من وزن الجسم للموضوع للحد من التباين في وزن الجسم الناجمة عن الإجهاد وبروتوكول الفرق الأولي في وزن الجسم بين المجموعات. وتجرى جميع الإجراءات بموجب موافقة وفقا لرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC).

2. تشريح الدماغ

1. أدوات ومواد:
   1. جرة التخدير: "جرة بهار" هذا هو وعاء زجاجي مع غطاء وطولها 6 بوصة عالية و5 بوصات في القطر، مثل "جرة الصيدلية"، "جرة الكرة القطن"، أو
   2. مقصلة للفئران، مثل التي قدمتها العلمية كينت.
   3. Vibratome 1000:
      1. قطع شفرة حلاقة في نصف طولي، وغسل النفط قبالة مع الكحول، وضعه في المشبك.
      2. ملء مع حمام الثلج المجروش العاديين.
      3. مكانعلبة طوليا.
      4. مسح صينية من الرطوبة قبل وضع قطرة من CYANOACRYLATE.
   4. قراضة (ومن الأمثلة على ذلك لفريدمان مايكرو قراضة من Miltex، القط. رقم 17-4801 أو مقراض بيرسون من العلوم الجميلة أدوات القط. لا 16015-17).
   5. # 3 أو # 5 ملقط المجوهرات (حاد لسحب قبالة الجافية).
   6. مقص صغير حاد مع نقاط (الفضل V95-304 هو مثال).
   7. (2) شقة صغيرة الفولاذ المقاوم للصدأ ملاعق، مثل المواد الكيميائية المستخدمة لنقل مسحوق على نطاق التوازن. تعتزم واسعة إلى الأمام نهاية وذلك لتناسب بين الدماغ الانتهائي والقبة.
   8. ملعقة لنقل كتلة الدماغ. (A ملعقة حساء البلاستيك من الكافتيريا يعمل بشكل جيد.)
   9. مشرط رقم 10.
   10. مزدوجة حافة شفرة حلاقة (الكربون الصلب):
       1. نصف لVibratome.
       2. نصف لتشريح.
   11. اثنين الزجاج أطباق بتري، ~ 3.5 بوصة و 4 بوصة في القطر، بحيث واحد يناسب داخل الآخر. سحق الجليد في بottom الطبق. ورقتين مرشح في طبق الأعلى. الانتقال إلى مناصب المطلوبة شريحة عن طريق تحريك ورقة الترشيح.
   12. 100 مل دورق.
   13. برود قطارة العين لري الدماغ مع الجليد CSF. (زجاج باستور ماصة مع نهاية الضيقة إدراجها في 1/2 بوصة واسعة لمبة المطاط يعمل بشكل جيد.)
   14. سحق علبة الجليد: حوالي 5 بوصة عالية، 20 بوصة طويلة و 10 بوصات واسعة. يحتوي على:
       1. عصا جميع الصكوك في الثلج المجروش.
       2. انخفاض الكالسيوم / المغنيسيوم عالية ACSF في زجاجة من البلاستيك التي يمكن خبطت لسحق الجليد.
       3. CYANOACRYLATE.
   15. انخفاض الكالسيوم / المغنيسيوم عالية السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF):
       1. في ملي: 125 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 0.5 CaCl ₂ * 2H ₂ O، 2.0 MgCl ₂ * ₂ 0 6H، 1.2 ناه ₂ PO ₄ * H ₂ O، 25 NaHCO، 11 الجلوكوز.
       2. يمكن أن زجاجة من البلاستيك في أن خبطت لسحق الجليد.
       3. البرد لمدة 20 دقيقة في الفريزر -80 درجة مئوية إلى جعله طين.
   16. القطن مسحات.
   17. ورق الترشيح: WHATMAN 42.5 مم (القط لا 1001 042.).
   18. أنابيب الطرد المركزي صغيرة لجمع أجزاء أصغر من الأنسجة.
   19. آبار لجمع أكبر لوحة الهياكل وأقسام الأنسجة.
   20. ورقة منشفة.
   21. اقية حقيبة حمراء.
2. التخدير:
   1. يتم وضع جرة التخدير، ومنصات الشاش، isoflurane، ملقط معدني، في غطاء الدخان.
   2. يتم وضع الفئران في جرة التخدير.
   3. بلل الشاش مع isoflurane ومكان في جرة التخدير.
   4. الانتظار حتى منعكس دواسة - انسحاب مخلب عندما شبكة الإنترنت هو مقروص مع ملقط - أو يختفي منعكس القرنية.
   5. قطع رأس: استيعاب الفئران بيد واحدة حول الصدر من الخلف، مع الفئران قطع رأس المقصلة وقفا بالقرب من ممكن. سوف الأطلس لا تزال تبقى عادة تعلق على الجمجمة.
   6. جمع الدم: الضغط على الصدر الفئران لمنع الدم من الشرايين السباتية يتدفق من.الاسترخاء تدريجيا قبضة وذلك للسيطرة على تدفق الدم إلى حاويات خاصة لجمع.
3. إزالة الدماغ:
   1. قطع بسرعة العضلات والفقرات المتبقية أي بعيدا عن مقص basiocciput مع الصغيرة.
   2. وباستخدام مقراض في بداية ماغنوم الثقبة، وقطع بعيدا اللقم والقذالي وbasiocciput.
   3. خط الوسط شق فروة الرأس مع مشرط.
   4. باستخدام مقص، وقطع شق منتصف السهمي في العظام القذالي الجداري و. استيعاب الهامش قطع من الجمجمة مع قراضة، وكسر مرة أخرى مثل قشرة البيضة بعيدا عن خط الوسط، والحرص على تقليل أي اتصال مع الدماغ. قطع خط الوسط وكسر الظهر قد يتعين القيام به على مراحل.
   5. كما تتعرض كذلك إلى الدماغ، فإن من الأهمية بمكان لاخماد مع ACSF الجليد مبرد للحفاظ على سلامة وحيوية الأنسجة.
   6. كسر العظام وبالمثل بعيدا الزمنية والأمامية.
   7. مع ملقط غرامة، المسيل للدموع بعيدا الجافية، مع التأكد من الحصول علىtentorum المخيخ.
   8. مع ملعقة صغيرة تضاف تحت الفص الجبهي للدماغ رفع من القبة ما يكفي لوضع التوتر في الأعصاب القحفية.
   9. القطع الأعصاب القحفية مع مقص.
   10. رفع الدماغ تماما من الجمجمة وترك تسقط في كوب من الكالسيوم منخفض مثلج / عالية ACSF المغنيسيوم. ترك دقيقة أو أكثر لتبريد الأنسجة بحيث سيكون الصلبة، سيتم الحفاظ على هياكل واضحة للعيان، وصحة الأنسجة.
   11. مع ملعقة من البلاستيك، نقل الدماغ على ورقة الترشيح في طبق بتري الجليد المبردة، حتى الجانب البطني.
4. تشريح الدماغ:
   1. جعل transection الاكليلية مع شفرة حلاقة في الشريان الدماغي الأوسط (الشكل 2A).
   2. برود حفظ الفص الجبهي بشكل مؤقت في الجليد الكالسيوم منخفض / عاليا ACSF المغنيسيوم في الدورق 100 مل.
   3. الوجه الدماغ بحيث السطح الظهري متروك. القطع الدماغ في هذه المرحلة من الدماغ المتوسط ​​علىdiencaphalon الثانية. وينظر كتلة الدماغ مما يؤدي إلى الشكل 2B.
   4. إسقاط العودة إلى المخ منعت الكالسيوم منخفضة المثلج / عالية ACSF المغنيسيوم.
   5. استخدام ملاعق صغيرة، تشريح المخيخ من النخاع / بونس. حفظ في وسائل الإعلام الملائمة لتحليل المقصود.
   6. العودة المخ حظر على طبق بيتري. باستخدام اثنين من أوراق الترشيح، ورفع المخ عن طريق وضع ورقة واحدة تصفية على ventrum. مع ذلك، وضع الطائرة الخلفي من المخ الاكليلية حظر على حافة ورقة تصفية الثانية. مع هذا المكان رقة الترشيح الطائرة قطع الأمامي من المخ حظر على قطرة من CYANOACRYLATE على لوحة القطع Vibratome، القشرة التي تواجه النصل.
   7. مع Vibratome، وقطع ما يكفي من الدماغ الذيلية بحيث يظهر hippcampus (الشكل 2C).
   8. اتخاذ القسم، 2،400 μ سميكة في الفئران ز 125، 2700 μ سميكة في 200 غ من الفئران. نقل المقطع باستخدام مسحة القطن على الأوراق تصفية على طبق بتري(الشكل 2D).
   9. قص وحفظ القشرة الحزامية مع شفرة حلاقة.
   10. مع ملعقة الأسنان، ودفع إلى حافة البعيدة من الجسم الثفني لقطع عليه، ثم انزع القشرة الإسوية.
   11. من هامش ventolateral، تقشر قرن آمون (2E الشكل).
   12. حفظ المخ الأوسط.
   13. اتخاذ القسم الثاني، 2،400 ميكرون سميكة في الفئران ز 120، 2500 ميكرومتر سميكة في 200 غ من الفئران. وضع القسم على أوراق الترشيح على طبق بتري (الشكل 2F). وبدلا من ذلك، يمكن أن نقل خمسة أقسام ميكرومتر 500 في هذه المرحلة لالكهربية.
   14. قص وحفظ القشرة الحزامية مع شفرة حلاقة.
   15. إجراء تخفيضات الجانبي مع شفرة حلاقة في الكبسولة الداخلية لإزالة القشرة الإسوية (الشكل 2F).
   16. إجراء تخفيضات المائل مع شفرة حلاقة لإزالة amygdali (الشكل 2F، G).
   17. جعل مربع قطع مع شفرة حلاقة لإزالة ما تحت المهاد. الجانبيالتخفيضات هي الوحشي لنواة تحت المهاد من بطني إنسي، الذي يكون مرئيا. يمكننا أن نجعل من قطع الظهرية فقط فوق البطين الثالث أو المنطقة الجوفية السقيفية (الشكل 2H).
   18. دفع ملعقة في الجسم الثفني وسحب بعيدا قطعة صغيرة من القشرة الإسوية تعلق على الحصين. وضع نهاية الضيقة للملعقة بطني إلى الصوار الحصين ورفع ظهريا لسحب قبالة قرن آمون.
5. الحفاظ على RNA والبروتين في عينات من أنسجة المخ والدم:
   1. وسائل الإعلام لفحص الحمض النووي الريبي:
      1. الدماغ: RNAlater كاشف الاستقرار RNA، # 76106 في أنابيب إيبندورف.
      2. الدم: PAXgene الدم أنبوب RNA (PreAnalytix، Quagen).
   2. وسائل الإعلام لفحص (CORT) من البروتين في الدم: الحل مد HBSS، ث / س + CA2 والمغنيسيوم 2 +، (جودة البيولوجي، المؤتمر الوطني العراقي).
   3. التخزين:
      1. يتم تخزين الاولى التي جمعت في أنسجة المخ سلة من الثلج الجاف لمدة لا تزيد عن 12 ساعة وبعد ذلك في الفريزر -70 ° Cللاستخدام في غضون 6 أشهر، ومدة الدراسة.
      2. يتم الاحتفاظ الدم التي تم جمعها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها للسماح لاختراق الكواشف، وبعد ذلك يتم تخزينها في الفريزر -70 ° C للاستخدام في غضون 6 أشهر، ومدة الدراسة.

3. ميكروأري الجينات من الجينات النووية الميتوكوندريا الميتوكوندريا والمتصلة

لدراسة وظائف الميتوكوندريا الفئران في أنسجة الدماغ، وقد وضعنا مؤخرا الفئران الخلايا العصبية الحبيبات الخيطية، مركزة ميكروأري (rMNChip) وأدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد مسارات السريع للأنسجة المخ في الفرق ^18. rMNChip يحتوي على 1500 وظائف الجينات المسؤولة عن الميتوكوندريا، استجابة الإجهاد، والإيقاع اليومي ونقل الإشارة. الأداة المعلوماتية الحيوية يتضمن خوارزمية الجينات من أجل الحوسبة أعرب تفاضلي، وقاعدة بيانات لتفسير واضحة وبديهية لنتائج ميكروأري.

1. Purificatioن من الحمض النووي الريبي مجموع من الأنسجة (القط # GPM-كيت 2011-1، GenProMarkers):
   1. أنسجة المخ الفئران من نوى معينة في الحمض النووي الريبي RNA في وقت لاحق الاستقرار كاشف (QIAGEN).
   2. الأنسجة (30 ملغ في 600 العازلة GPM-L / B ميكرولتر) التجانس باستخدام الترا Turrax T8 على Dispergierstation (LABORTECHNIK IKA).
   3. أجهزة الطرد المركزي في 1.5 مل أنابيب دورة في الدقيقة 21000 الكتب التي لمدة 15 دقيقة.
   4. صب طاف في عمود الدوران مع أنبوب جمع 2-مل.
   5. أجهزة الطرد المركزي لعمود أنابيب في 15،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، تجاهل التدفق من خلال.
   6. إضافة ميكرولتر 700 GPM-B العازلة W / إلى كل من أعمدة الدوران، أجهزة الطرد المركزي لعمود أنابيب في 16000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية، تجاهل التدفق من خلال.
   7. إضافة 500 ميكرولتر العازلة GPM-W إلى كل من الأعمدة تدور، أجهزة الطرد المركزي لعمود أنابيب في 16000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية، كرر مرة واحدة.
   8. وضع عمود الدوران في أنبوب جمع 1،5 الجديدة مل.
   9. إضافة 30 ميكرولتر DEPC المعالجة المياه إلى كل من أعمدة الدوران، 16000 دورة في الدقيقة أجهزة الطرد المركزي في ل1 دقيقة، كرر مرة واحدة.
   10. قياس تركيز RNA، وضبط تركيز إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع الدناز-والماء ريبونوكلياز الحرة، وعينات على استعداد لوضع العلامات ميكروأري.
2. ميكروأري وضع العلامات والتهجين (القط # صفيف 900، Genisphere):
   1. يستخدم 1.0 ميكروجم الفئران مجموع RNA لتخليق [كدنا] ووضع العلامات ميكروأري باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   2. ويجري ميكروأري التهجين على rMNChip في C ° 65 لل12-16 ساعة كما هو موضح سابقا ¹⁸
3. غسل الشرائح ميكروأري المهجنة (القط # GPM0101-6، GenProMarkers):

   غسل الحل	حجم	20 X SSC	10٪ SDS	DDH 2 O
   0،5 X SSC/0.01 SDS	500 مل	12،5 مل	0.5 مل	ما يصل إلى 500 مترL
   0،5 X SSC	500 مل	12،5 مل		ما يصل إلى 500 مل
   0،1 X SSC	500 مل	2.5 مل		ما يصل إلى 500 مل
   0،01 X SSC	500 مل	0.25 مل		ما يصل إلى 500 مل

   
   يجب أثناء الغسل يجب حماية الشرائح من الضوء. لا تدع الشرائح تجف في أي مرحلة.
   1. غسل الشرائح في 250 مل الحل 1 في جرة الزجاج coplin (القط #: 70312-20، العلوم المجهر الإلكتروني، هاتفيلد، PA) في درجة حرارة الغرفة قبل إثارة الجرة على MO (الجزيئية تكنولوجيز، وسانت لويس، BioShaker ) حتى كل من تغطية زلات تقع قبالة الشرائح الزجاجية (يأخذ هو <3 دقائق).
   2. غسل الشرائح مع 250 مل محلول 2 في آخر جرة جرة من اثارة لمدة 3 دقائق.
   3. غسل الشرائح مع 250-مل الحل 3في آخر جرة جرة من خلال تناوب لمدة 3 دقائق، وتكرار هذه الخطوة مرتين.
   4. غسل الشرائح مع 250-مل الحل 4 في آخر جرة لمدة 10 ثانية. يجف على الفور الشرائح بواسطة الطرد المركزي في الجرار وضعت على لوحات PN11779 ST-H750 والدوار في جهاز للطرد المركزي في الكتب التي T21 سوبر 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
   5. ضع الشرائح في مربع غسلها للمسح الضوئي في أقرب وقت ممكن.
4. ميكروأري مسح الصورة والتحليل باستخدام الماسح ميكروأري ScanArray اكسبرس (PerkinElmer) عقب دليل التعليمات والتركيز على:
   1. ميكروأري مسح الصورة: مسح سهلة مقابل المسح البروتوكول.
   2. آثار أساليب السلطة، PMT والتطبيع LASER على النتائج البيانات.
   3. محاذاة ملف GAL على الصورة.
   4. محاذاة إلى شبكات البقع على وجه التحديد.
5. تحليل البيانات: الإجراءات الحسابية المخصصة لتحليل البيانات ميكروأري تشمل ميكروأري تقييم الصورة، تصفية البيانات، بقعة تصحيح حجم والإدماج، normalizatioن والمقارنة كما هو موضح سابقا ^18. وبالإضافة إلى ذلك، أساليب تحليل الأنطولوجيا، ومسار شبكة هي نفسها كما هو موضح سابقا من أجل ضمان جيل من النتائج ميكروأري استنساخه ويمكن التحقق منها ^{2، 22، 25، 19، 20، 8، 23، 18.}

4. جمع العينات والدم قياس تركيز البلازما CORT

1. يتم جمع قبل أو بعد الإجهاد عينات الدم من الحيوانات الذيل تخدير في 1 أيام، 14، 21 و 30 في أنابيب heparinized لتحديد مستويات CORT المتداولة.
2. كما يتم جمع عينات الدم في أنابيب الجذع heparinized بعد يصرح باستخدامها في الحيوانات. يتم استخراج البلازما وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى التحليل.
3. وسائل الإعلام لاستخراج البلازما:
   1. يتم جمع عينات الدم لاستخراج الحمض النووي الريبي RNA باستخدام PAXgene الدم أنابيب (PreAnalytix، Quagen)
   2. يتم جمع عينات الدم لاستخراج الحمض النووي DNA باستخدام أنابيب PAXgene الدم (PreAnalytix، Quagen).
   3. يتم جمع عينات من الدم للتحليل البروتين باستخدام بطارية ليثيوم هيبارين أنبوب جمع شعرية (200 ميكرولتر) من MaketLab # ML5601.
4. يتم اختبار البلازما CORT التركيز وتحليلها مع الجرذ بالموقع كورت EIA (تشخيص أنظمة مختبرات شركة http://www.beckmancoulter.com/ ) على النحو التالي:
   1. بمناسبة شرائط microtitration لاستخدامه.
   2. إعداد الجرذ المتقارنة إنزيم CORT الحل عن طريق تمييع الجرذ المتقارنة إنزيم CORT التركيز في مخفف المترافقة.
   3. ماصة ميكرولتر 25 معيارا والضوابط ومجهولون في الآبار.
   4. إضافة 100 ميكرولتر المتقارنة إنزيم حل لكل بئر باستخدام موزع نصف آلية. اضغط بلطف البئر ثانية حامل 5-10.
   5. إضافة 100 ميكرولتر مصل ضدي الجرذ CORT لكل موزع بشكل جيد باستخدام نصف آلية.
   6. احتضان الآبار في درجة حرارة الغرفة، 25 ° C، على مجموعة شاكر في 500-700 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
   7. نضح ويغسل كل أهلا وسهلال 5 مرات مع محلول الغسيل باستخدام صفيحة ميكروسكوبية غسالة أوتوماتيكية. صمة عار الجافة بواسطة لوحة على عكس مادة ماصة.
   8. إضافة 100 ميكرولتر من محلول TMB إلى كل مولد اللون جيدا باستخدام موزع نصف آلية.
   9. احتضان في درجة حرارة الغرفة 15-20 دقيقة على شاكر المداري وضعت في صفيحة ميكروسكوبية 500-700 دورة في الدقيقة. مشاهدة تغير اللون.
   10. إضافة 100 ميكرولتر حل لوقف كل بئر باستخدام موزع نصف آلية.
   11. يهز لوحة من ناحية ثانية 5-10.
   12. قراءة الامتصاصية من الحل في البئر في غضون 30 دقيقة.
   13. تم تعيين مرشح في 450 نانومتر. * ويمكن أيضا مجموعات EIA يمكن شراؤها في مختبرات المناعية ( www.ibl-america.com ).

5. ممثل النتائج

وقيدت الشكل 1. الفئران وتتعرض لصدمة الذيل. لاحقة من وزن الجسم، يتم قياس تركيز البلازما كورتيزون، وردود الفعل المفاجئة الصوتية A:. التعرض الإجهاد: يتم ضبط النفس من قبل الحيوانات التي ثبتوا في أنبوب شبكي التهوية. يتم قياس وزن الجسم واستهلاك الغذاء والماء: أربعون الصدمات الكهربائية (2 مللي أمبير، يتم تسليم 3 ثانية ؛) لمدة ذيولها في شبه عشوائي فترات من 150 إلى 210 باء ثانية وC: الإجهاد يؤخر زيادة في وزن الجسم خلال النمو مباشرة قبل الضغط (يوم -3)، في يوم من الأيام الثلاثة الإجهاد ومن ثم كل يوم هناك بعد حتى اليوم 14. يتم أبدا تعويض نقص زيادة وزن الجسم من خلال الضغط D:. زيادة تركيز البلازما الإجهاد الكورتيزون E: باغت الصوتية: يتم اختبار الحيوانات قبل يوم واحد الإجهاد (اليوم-1) وقراءة خط الأساس و 12 يوما بعد اليوم الأخير من على التوالي 3 أيام من الإجهاد. وأعرب كنسبة مئوية من الصوتية - البيانات لكل مجموعة - الإجهاد والتحكمجفل على يوم 12 إلى يوم النسبية -1. الإجهاد يزيد بشكل ملحوظ منعكس جفل الصوتية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2 تشريح اللوزة، الحصين، وتحت المهاد من الدماغ شريحة A:. دماغ الفئران، وعرض بطني: الأسهم أشر إلى شرايين الدماغ الأوسط B: كتلة الدماغ، وعرض بطني، وعلى استعداد لنقلها إلى Vibratome. C: كتلة الدماغ لصقها على علبة vibratome، جنبا الذيلية حتى، القشرة التي تواجه النصل. وقد تم بالفعل الدماغ الذيلية قطع تعريض الحصين الذيلية. كتلة جاهز الآن لشريحة ميكرون 2500 يحتوي على جزء كبير من الحصين أن تؤخذ D:. شريحة ميكرون سميكة تحتوي على 2500 الحصين الذيلية E:. Tانه مقشر القشرة الإسوية (ISO) من قرن آمون (HC) وقرن آمون مقشر من المخ الأوسط F: إن شريحة ميكرون سميكة تحتوي على 2500 اللوزة وقرن آمون منقاري G: تم رفعه والقشرة الإسوية و(اللوزة) مقطوعة اللوزة . H: يتم رفعه تحت المهاد (HT) وتشريد اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. مستويات التعبير مرنا للمن مستقبلات جلايكورتيكود (GR) ومستقبلات minerocorticoid (MR) في اللوزة، الحصين، تحت المهاد، وقبل القشرة الأمامية (C، التحكم) وبعد (STR) الذيل صدمة الإجهاد. الوحدات نسبة السيطرة؛ الحانات SEM A: اللوزة: الإجهاد يقلل minerocorticoid التعبير مرنا مستقبلات B: الحصين: increa الإجهاد.إس إي إس مرنا مستقبلات minerocorticoid التعبير C: المهاد: الإجهاد يزيد minerocorticoid التعبير مرنا مستقبلات D: القشرة الأمامية: الإجهاد يقلل جلايكورتيكود التعبير مرنا وكذلك مستقبلات minerocorticoid التعبير مرنا مستقبلات.

و(121bp) الاشعال PCR لGR الفئران هي:	1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
و(99 بي بي) PCR الاشعال لMR الفئران هي:	1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

الشكل 4. الكتلة وheatmap من RNA وأعرب تفاضلي من 64 جينات أخذت من 5 أنسجة المخ الفئران، بما في ذلك المخيخ (CL)، المخ (CR)، الجبهي القشرة (FC)، تحت المهاد (HT)، وقرن آمون (HC). خريطة ملونة تشير إلى التغيرات أضعاف في دالخاصة-(الخضراء) وحتى-(الحمراء) الجينات التي أعرب عنها. (A) والكتلة heatmap من شدة إشارة تطبيع من 9 قياسات لكل من 64 الجينات المستمدة من التجارب ميكروأري 15 لهذه الأنسجة في الدماغ خمسة. وقد تم قياس التعبير الجيني من قبل كل ثلاث مكرارت التقنية وثلاث مكرارت التجريبية. (B) والكتلة heatmap من مستويات RNA متوسط ​​هذه القياسات 9 من كل من الجينات 64. هذه النتائج تظهر اختلافات واضحة في التعبير الجيني الميتوكوندريا والمهام ذات الصلة لذلك، والتي تدعم فرضية أن لدينا مناطق الدماغ المختلفة لها متطلبات الطاقة المختلفة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

أدى طلبنا من rMNChip وأدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد كتلة وheatmap من 64 جينات الحمض النووي الريبي مع أعرب تفاضلي المستمدة من 5 أنسجة الدماغ الفئران بما في ذلك المخيخ (CL)، المخ (CR)، الجبهي القشرة (FC)، hypothalamus (HT)، وقرن آمون (HC) (الشكل 4). هذه البيانات تظهر اختلافات واضحة في التعبير الجيني الميتوكوندريا والمهام ذات الصلة لذلك. النتائج تثبت أن مناطق الدماغ المختلفة مطالبة كمية مختلفة من الطاقة من أجل تنفيذ وظائف المخ المقابلة.

Discussion

ويستند التشخيص على الأعراض من اضطراب ما بعد الصدمة النفسية وذكرت النفس (DSM IV) حسب الموضوع المحتملة. لا العلامات البيولوجية واضحة المعالم هو متاح حاليا للوصول إلى حالة المرضية في جسم المريض من المرضى PTSD محتملة. PTSD هو اضطراب تهدد الحياة التي أثارتها الأحداث المؤلمة والأعراض الرئيسية نفسية لا تزال موجودة في الحياة الناجي منذ شهور وحتى سنوات بعد أحداث الأولي. أكثر الأعراض بارزة ومستمرة في كشف المرضى الذين يعانون من اضطرابات ما بعد الصدمة هي hypervigilance، تأخر ردود الفعل المفاجئة المبالغ فيها ^{14 و 15 و 16} و حلا وسطا واضح في محور HPA. في البشر تظل هذه الأعراض، أو تظهر مع تأخير لمدة ثلاثة أشهر، بعد وقف الضغوطات صدمة ^24. نموذجنا الحالي للدراسات العلامات البيولوجية لاضطراب ما بعد الصدمة توظف ضبط النفس والصدمات المتكررة الذيل لمدة ثلاثة أيام متواصلة (2-HR دورات 40، tailshocks مللي أمبير 2) - والذي لا مفر منه ذيل للصدمة نموذج (ITS) في الفئران وزنها 150 غرام. هذا النموذج لديه ITSثبت لتقليد إلى حد كبير في الفيزيولوجيا المرضية من اضطراب ما بعد الصدمة ^{17، 7، 4، 10.} لقد التحقق مختبرنا ومختبرات أخرى أن نموذجها من التوتر في الفئران يدفع التعديلات السلوكية والعصبية الحيوية التي تشبه تلك التي وجدت في مواضيع PTSD ^{17، 7، 10، 9.} على وجه التحديد، فإن هذه الفئران المتوترة يحمل (1) لتأخر الاستجابة ومبالغ فيها جفل تظهر بعد عدة أيام من وقف الضغوطات التي نظرا لحجم الوقت مضغوط من حياة الفئران مقارنة مع البشر، يتوافق مع تأخير شهر واحد إلى ثلاثة من أعراض في المرضى الذين يعانون اضطرابات ما بعد الصدمة (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E ^13)، (2) تعزيز البلازما كورتيزون (CORT) لعدة أيام (10) عدة، مشيرا إلى حل وسط من محور hypothalamopituitary (HPA)، و (3) زيادة وزن الجسم المتخلفين بعد الضغوطات وقف، المقابلة لخلل في تنظيم الأيض من اضطرابات ما بعد الصدمة. ليس هناك أي دليل في الأدب أن الثعلب رائحة، والتعرض المفترس، أو يخشى ردود الفعل المفاجئة potentiated، exhiبت هذه الظواهر السلوكية الثابتة وneuroendocrinologic المرتبطة PTSD.

وقد أظهرت الفئران التي عرضت لدورة واحدة الإجهاد (1DS) عابرة، ولكن ليس شذوذ الثابتة المعروضة من قبل الفئران 3DS ⁽¹⁷⁾ التجربة الحالية مقارنة ردود الفعل المفاجئة من الفئران و3DS 1DS 4 و 7 و 10 أيام بعد وقف الضغوطات. وشدد تتفق مع الأعمال السابقة، أظهرت الفئران مرتفعة القاعدية البلازما مستويات CORT في اول يوم عمل بعد الإجهاد ^17. وكانت هذه المستويات CORT حساسة لعدد من الضغوطات التعرض مع مستويات أعلى في الفئران CORT 3DS من 1DS في الفئران. أما بالنسبة لردود الفعل المفاجئة، والفئران 1DS يحمل ردود الفعل المفاجئة المبالغ فيها 7 أيام الضغوطات آخر، في حين جفل التوعية فقط يصبح واضح 10 أيام آخر الضغوطات في الفئران 3DS. وهكذا، فإن ظهور استجابة المفاجئة المبالغ فيها بعد وقف الضغوطات ويبدو أن المتصل بعدد من التعرض الدورة الإجهاد. نموذج 3DS شدد يبدوتكون مفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة في التعبير غيرت من المؤشرات الحيوية المرتبطة أعراض اضطراب ما بعد الصدمة والظواهر السلوكية مفتاح قياس المرتبطة توقيت بعد توقف التوتر. النتائج الجيني يقدم دليلا على قدم مبدأ لتطبيق rMNChip والمعلوماتية الحيوية لتحديد مسارات أدوات التفاضلية، والمؤشرات الحيوية الجينات والبروتينات، مما يسهل إلى حد كبير النظم البيولوجية دراسة وفهم الآليات الجزيئية الكامنة اضطرابات عصبية معقدة ومتعددة العوامل، بما في ذلك PTSD.

بينما لدينا نموذج لا الخوض في الجوانب المعرفية والسلوكية أكثر تعقيدا من اضطرابات ما بعد الصدمة، نلاحظ أن تغيير أنماط النوم في نموذجها ¹ تتوافق مع صعوبة في البقاء نائما والكوابيس واضطرابات ما بعد الصدمة من المرضى ¹¹ PTSD DSM-IV-TR ( معايير D ^13)، وأوجه القصور في الهروب / تجنب التعلم والتعلم من مهمة مشهي في نموذجها ^{12 يتوافق مع تركيزات الفقراء والعجز ذكرى PTSD 5 (DSM-IV-TR PTSD معايير C 13). النموذج الحالي يرتبط بشكل جيد مع أعراض PTSD الرئيسية المميزة لويقدم نموذجا جيدا لربط المؤشرات الحيوية الطرفية من اضطرابات ما بعد الصدمة، والتي يمكن جمعها من المرضى، مع المؤشرات الحيوية، وسط الآلي، والتي لا 6.}