TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Özet

Biz TSSB hastalarının karakteristik nöroendokrin fonksiyonlarda kalıcı değişikliklere ve gecikmiş uzun vadeli, abartılı bir korku tepkisi, ortaya travma sonrası stres bozukluğu (TSSB) bir sıçan modelinde tarif. Hayvan modeli ve burada tarif edilen yöntemler, fakat mekanistik çevresel beyaz kan hücrelerindeki biyolojik olan hastalarda ölçülemez beyin çekirdeklerinde biyo, kutu arasında ilişki için yararlıdır.

Özet

Travma Sonrası Stres Bozukluğu patofizyolojisi evrimi temsil biyolojik tanımlanması (TSSB) objektif tanı için değil, aynı zamanda travma terapötik etkinlik ve esnekliğinin değerlendirilmesi için değil sadece, hayati önem taşımaktadır. Yürütülen araştırma konuları 'kan, tükürük, idrar ve postmortem beyin dokularından biyolojik örnekler kullanarak travmatik stres kaynaklı proteinler, transcriptomes, genomik varyansları ve genetik modülatörleri dahil TSSB için biyobelirteçler, tespit yöneliktir. Ancak, TSSB psikiyatrik belirtiler ile ilişkili değişmiş beyin fonksiyonları ile periferik veya postmortem örneklerin içinde bu biyobelirteç moleküllerin korelasyon çözümlenmemiş kalır. Burada, böylece mekanik ve pathogno olan TSSB merkezi biyomarkerların gerekli ilişki, sağlanması, periferik kan ve orta beyin biyolojik yanı sıra, davranışsal fenotip hem de toplanmış ve ölçülebileceği TSSB'nin bir hayvan modeli mevcutcarlosclint ancak hangi olabilir, periferik biyolojik ve davranışsal fenotipleri ile, insanlardan toplanan edilemez.

Sıçanlarda kaçınılmaz kuyruk şok modeli (ITS) - TSSB Bizim hayvan modeli kısıtlama ve üç sürekli gün boyunca tekrarlanan kuyruk şoklara kullanır. Bu ITS modeli TSSB ^{17, 7, 4, 10} patofizyolojisi taklit eder. Biz ve diğerleri ITS modeli TSSB vakalarında ^{17, 7, 10, 9} bulunanlara benzer davranışsal ve nörobiyolojik değişiklikler neden olduğunu doğruladılar. Özellikle, bu gerilmiş sıçanlar (1) ile karşılaştırıldığında insanlarda sıçan yaşamının sıkıştırılmış zaman ölçeği belirli bir stres bırakıldıktan sonra birkaç gün görünen bir gecikmeli ve aşırı irkilme yanıtı, TSSB hastada semptomların 1-3 ay geciktirme ile karşılık gelen gösterirler (DSM-IV-TR PTSD Criterian D / E ^13), (2) artmış plasma gonadotropin (HPA) arasında bir uzlaşma gösteren birkaç gün boyunca kortikosteron (CORT), ve (3) gecikmiş boMetabolik regülasyon disfonksiyonu gösteren stres kesilmesinden sonra dy kilo.

Bu model için kullanılan deneysel paradigmalar şunlardır: akustik irkilme tepkisi (ASR) ve vücut kitle grafik ölçümü ile tayin sıçan (1) öğrenilmiş çaresizlik paradigma; bölgeler ve çekirdekleri içine sıçan beyin (2) mikrodisseksiyon; ( CORT kan düzeyleri için 3) enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), (4), bir gen mikroarray artı ilgili biyoinformatik araçlar ^18. RMNChip adlandırılan bu mikroarray, özellikle TSSB dahil olduğu varsayılan nöronal biyoenerjetik ele şekilde sıçan mitokondriyal ve mitokondri ile ilgili nükleer genler üzerinde duruluyor.

Protokol

1. TSSB Hayvan Davranış Modeli

1. Konular: Erkek albino Sprague Dawley sıçanları (Taconic Farms, Derwood, MD) kullanılmıştır, stres protokolü uygulama sırasında 200 g ağırlığı 150.
2. Yiyecek, su alımı ve vücut kilo ölçümü: 100 ağırlığında laboratuvar fareleri varış ± 25 g üzerinde bir kafes (: 45x24x20 cm kafes boyutu) iki yerleştirilmiştir. Kafes dolgu substrat (talaş) haftada iki kez değiştirilir. Ve bağıl nem (% 30-70)-kontrollü bir ortamda bir hafta - bir sıcaklık (22 ± 4 ° C) Hayvanlar, ters 12 saat ışık döngüsü (0600-1800: 1800/0600 ve kapalı ışıkları) sürdürülür deneyler önce. Su ve standart peletlenmiş yemi (Harlan (2018)% 18 protein kemirgen diyeti, Global diyetler, Harlan Teklad) serbestçe kafeslerine mevcuttur, ve Ağırlıklar stres kesilmesinden sonraki gün boyunca ve 3, 3 gün önce günlük 3 gün kaydedilmiştir .
3. Acclimation: Sıçanlar bo üç gün için acclimated olanhayvan tesisi ve bir akustik irkilme odası th. Akustik irkilme odasına onları alıştırmak için, hayvanların ilk ölçümleri önce üç gün boyunca her gün 5 dakika içinde işlenir.
4. Protokolü Stresli: hayvanlar eşit kendi vücut ağırlığı ve bazal irkilme tepkisi dayalı her gruba atanır. 16 hayvan içeren her bir grup; Test hayvanları iki grup üzerinde yapılır. Grup 1 stres protokolü alır ve Grup 2 kontrol edilmesidir.
   Stres maruz protokolü sürekli her oturumun başlığı oluşur 2-hr prosedürü, ("kaçınılmaz") ve kuyruk-şoklara, ardışık 3 gün boyunca günde bir kez tekrarlanır. Vurgulayan (0800 ve 1200 penceresi içinde) sabah yapılır. Hayvanlar havalandırılan bir pleksiglas tüp içinde immobilize edilerek sınırlanmıştır. Kırk elektrik şoku (2 mA, 3 sn beklemeli; ABD Hayvan Testi Kafes Izgara Kat Shocker, Coulbourn Instruments) 150 t yarı rasgele aralıklarla onların kuyrukları teslim ediliro 210 sn (Grafik Devlet Notasyon yazılımı, Habitest Evrensel Link, Coulbourn Instruments, USA). 2 mA Uyarım uyarıcı çıkış deneycinin parmak çapında yerleştirildiğinde, bunun caydırıcı olduğu için seçilmiş, ancak ağrılı değildi. Elektrot jel elektrot ve sıçan kuyruk derisinde arasındaki jel iletken ince bir tabaka oluşturacak şekilde Q-ucu kullanılarak uygulanır. Elektrot klipler ayarlanabilir ve kuyruk kan dolaşımı etkileyen olmaksızın iyi bir bağlantı sağlamak için kuyruk bağlanır.
5. Akustik irkilme tepkisi (ASR): Akustik irkilme tepkisi ölçümü bir irkilme tepkisi Akustik Test Sistemi (Coulbourn Instruments, Columbus, Ohio, ABD) ³ ile gerçekleştirilmiştir. Bu sistem, bir ses-zayıflatılmış oda içinde ağırlık-duyarlı platformlar oluşur. Irkilme platformların her bir gerinim ölçer olduğunu dönüştürücü, kullanım öncesi kalibrasyon gerektirir. İlk olarak, bağlayıcı kalibrasyon için DC coupled modunda olmalıdır. Bu modda, coupler çıkış directly platformdan giriş, statik ağırlıklar ile kalibrasyon için gerekli modu takip eder. Irkilme tepkisi gösterir kuvvet de o sadece hızlı değişim, çıkış yani dönüştürücü deneyleri sırasında AC coupled moduna geçer. Ses uyaranlara yanıt olarak hayvanların hareketleri dolayısıyla her platform içinde bir strain gauge bir gerilim değişikliği olarak ölçülür ve irkilme yol açan uyaranın başlangıcından 200 ms içinde meydana gelen maksimum yanıt olarak kaydedilmektedir.
   Uyarıcı çalışmaların altı türü vardır: Tek başına 100 dB, ön darbe, tek başına 110 dB, ön darbe öncesi nabız yalnız ve hiçbir uyaran kontrolü ile 110 dB 100 dB. Her deneme türü sekiz kez sunuldu. Deneme türleri mertebe etkileri ve alışkanlık önlemek için rastgele sırayla sunulmuştur. Inter-deneme aralıklarla 15 ile 25 sn rasgele değişir. Sekiz çalışmanın arasında, sadece maksimum değerler sonuçlar alınır ve nihayet aynı gün hayvan vücut ağırlığı ile ayarlanabilir. Hayvanlar bir gün b test edilmiştirefore stres ya da bir temel okuma ve 1, 7, 14 ve stres işlem ya da başka tedavi birbirini takip eden 3 gün son günü izleyen 21 gün gibi diğer tedavi.
6. Veri analizi:
   1. ASR:% baseline = arasında (mutlak genlik / temel mutlak genlik) × 100%: akustik irkilme tepkisi genliği her zaman denklemi kullanılarak hesaplanan "bazal%" olarak temsil edilir test. Her test günü için, tekrarlı ölçümler için varyans analizi SPSS (Version 16) yazılımını kullanarak stres durumu ve ilaç dozu faktörleri ile irkilme genlikleri üzerinde gerçekleştirilir. Tukey, Bonferroni veya Dunnett testleri ayrı ayrı gruplar arasında anlamlı post-hoc farklılıkları değerlendirmek için kullanılır. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir
   2. Büyüme: Vücut ağırlığı ve gıda ve su tüketimi Gün -1 önceki stres ve gün 14, 21 ve stres protokolü 30 aşağıdaki tamamlanması ölçülür. İstatistiksel analiz: Yiyecek ve su giriş veri tabi tutulur tek-yönlü varyans tekrarlayan ölçümler analizi (ANOVA). Zamanla gıda tüketim oranındaki değişiklikleri analiz etmek, yiyecek alımının miktarı daha da stres protokolü ve gruplar arasında vücut ağırlığı ilk fark ile oluşturulan vücut ağırlığı varyans en aza indirmek için konu vücut ağırlığı bölünür. Tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) uyarınca onayı altında yürütülmektedir.

2. Beyin Diseksiyon

1. Araçlar ve Malzemeler:
   1. Anestezi jar: ". Çeşni jar" Bu tür bir "eczacı kavanoz", "pamuk kavanoz", veya çapı, yaklaşık 6 inç yüksek ve 5 inç ölçme, kapaklı bir cam kavanozu
   2. Böyle Kent Scientific tarafından sağlanan, sıçan için Giyotin.
   3. Vibratome 1000:
      1. Uzunlamasına yarım jilet Kes, kelepçe ekleyin, alkol ile yağ yıkayın.
      2. Sıradan ezilmiş buz banyosu doldurun.
      3. Yeruzunlamasına tepsi.
      4. Siyanoakrilat bir damla yerleştirmeden önce nem tepsisi silin.
   4. Rongeurs (Örnekler Miltex, kedi bir Mikro Friedman rongeur vardır. Hayır. 17-4801 veya Güzel Bilim Araçları kedi bir Pearson rongeur. Hiçbir 16015-17).
   5. # 3 veya # 5 forseps (dura koparmak için keskin).
   6. Keskin noktaları (Vantage V95-304 bir örnektir) Küçük makas.
   7. (2) Böyle bir denge ölçek toz kimyasal aktarmak için kullanılan Düz paslanmaz çelik minivan spatula,. Telencephalon ve kalvaryumun arasındaki uygun olarak geniş sonuna kadar öne eğilir.
   8. Beyin blok transfer Kaşık. (Kafeteryadan bir plastik çorba kaşığı çalışıyor.)
   9. Neşter # 10.
   10. Çift kenar jilet (karbon çeliği):
       1. Vibratome için bir buçuk.
       2. Diseksiyon için bir buçuk.
   11. İki cam petri, ~ 3,5 inç çapında ve 4 inç, biri diğerinin içinde uyan böyle. B Ezilmiş buzottom çanak. En iyi yemeğin iki filtre kağıtları. Filtre kağıdı hareket ettirerek gerekli pozisyonlara dilim taşıyın.
   12. 100 ml beher.
   13. Buz ile beyin sulanması Göz damlalık bir BOS soğutulmuş. (1/2 inç genişliğinde lateks kauçuk ampul takılı dar ucu ile cam Pasteur pipeti iyi çalışıyor.)
   14. 10 inç genişliğinde, 20 santim uzunluğunda, 5 Hakkında inç yüksek: buz tepsisi ezdi. Içerir:
       1. Ezilmiş buz tüm enstrümanlar yapıştırınız.
       2. Düşük kalsiyum / buz ezmek için çarptım edilebilir plastik şişe yüksek magnezyum aCSF.
       3. Siyanoakrilat.
   15. Düşük kalsiyum / yüksek magnezyum yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF):
       1. MM olarak: 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl ₂ * 2H ₂ O, 2.0 _MgCl2 * 6H ₂ 0, 1.2 NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O, 25 NaHCO, 11 Glukoz.
       2. Plastik şişede ki buz ezmek için çarptım edilebilir.
       3. -80 Içinde 20 dakika için buz gibi ° C'de derin dondurucu, bir sulu çamur haline getirerek.
   16. Pamuklu çubuklar.
   17. Filtre kağıdı: Whatman 42.5 mm (Cat no 1001 042.).
   18. Mini santrifüj tüpleri doku küçük bölümlerde toplamak.
   19. Wells plaka büyük yapılar ve doku bölümlerini toplamak için.
   20. Kağıt havlu.
   21. Kırmızı biohazard çantası.
2. Anestezi:
   1. Anestezi kavanoz, gazlı bez, izofluran, metal forseps, bir davlumbaz konumlandırılmıştır.
   2. Sıçan anestezi kavanoza konur.
   3. Anestezi kavanozun içinde izofluran ve yer ile gazlı bezle nemlendirin.
   4. Web forseps ile sıkışmış zaman pençe çekme - - pedal refleksi kadar bekleyin ya da kornea refleksi kaybolur.
   5. Işten çıkarmak: arkasından toraks çevresinde tek elle sıçan kavra, mümkün olduğunca oksiput yakın olarak giyotin ile sıçan başını kesmek. Atlas hala genellikle kafatasına bağlı kalacaktır.
   6. Kan Toplama: karotis arterler akan kan önlemek için toraks Squeeze sıçan.Toplama kabı içine kan akışını kontrol edecek şekilde yavaş yavaş tutuş rahatlayın.
3. Beyin çıkarılması:
   1. Hızla küçük makas ile basiocciput gelen kas ve kalan omurları kesti.
   2. Foramen magnum de rongeur ve başında kullanarak, oksipital kondil ve basiocciput kesip.
   3. Neşterle Midline skalp insizyonu.
   4. Makas kullanarak, oksipital ve paryetal kemiklerde bir orta sagital insizyon kesti. Rongeurs ile kafatasının kesilmiş kenar kavrama, beyin ile herhangi bir temas en aza indirmek için dikkatli olmak, uzak orta hattan bir yumurta kabuğu gibi geri bölünürler. Orta hat kesimi ve ara geri aşamada yapılabilir.
   5. Beyin daha fazla maruz gibi, dokunun bütünlüğünü korumak için canlılık ve buz ile soğutulmuş bir aCSF söndürmek için kritik önem taşır.
   6. Benzer temporal ve frontal kemiklerin ayrılacağım.
   7. Ince forseps ile almak için emin, dura gözyaşıtentorum cerebelli.
   8. Yeterli kranial sinirler üzerindeki gerilimin koymak kalvaryumun gelen beyin yükseltmek frontal lob altına yerleştirilen küçük bir spatula ile.
   9. Makas ile kranial sinirler transeksiyonu.
   10. Kafatası tamamen beyin kaldırın ve buzlu düşük kalsiyum / yüksek magnezyum aCSF arasında behere boşverebilirdik. Doku katı olacak şekilde soğutmak için bir dakika ya da daha bırak, açıkça görünür yapıları ve doku sağlığı korunmuş olacaktır.
   11. Plastik kaşık ile, buz soğutulmuş Petri kabındaki filtre kağıdı üzerine ventral tarafında beyin aktarabilirsiniz.
4. Beyin diseksiyonu:
   1. Orta serebral arter (Şekil 2A) de jilet ile koronal transeksiyonu olun.
   2. Buz geçici frontal lob kaydet 100 ml beher düşük kalsiyum / yüksek magnezyum aCSF soğutulmuş.
   3. Dorsal yüzeyi yukarı gelecek şekilde beyin ters. Ortabeyin kesiştiği bir de beyin sapı transeksiyonund diencaphalon. Sonuçta ortaya çıkan beyin blok Şekil 2B'de görülmektedir.
   4. Bloke beyinin arka buzlu düşük kalsiyum / yüksek magnezyum aCSF içine bırakın.
   5. Mini spatula kullanarak, medulla / pons gelen beyincik teşrih. Amaçlanan analizi için uygun ortam kaydedin.
   6. Petri kabı bloke serebrum dön. Iki filtre kağıdı kullanarak, üzerinde olduğu ventrumun olduğu bir filtre kağıdı yerleştirerek beyin kaldırın. Bununla beraber, ikinci filtre kağıdının kenarına bloke beynin posterior koronal düzlemde yerleştirin. Bu filtre kağıdı yeri ile Vibratome kesim plaka üzerinde siyanoakrilat bir damla üzerinde bloke beyinin ön kesme düzlemi, korteks bıçak bakacak.
   7. Vibratome ile yeterli kaudal beynin kesilmiş böylece hippcampus gösterir (Şekil 2C).
   8. 200 g sıçan 2.700 μ kalınlığında 125 gr sıçan yılında 2,400 μ kalınlığında, bir bölüm ayırın. Petri kabı filtre kağıtları üzerine pamuklu bir bez kullanarak bölümü aktarın(Şekil 2B).
   9. Kes ve jilet ile singulat korteks kaydedin.
   10. Bir diş spatula ile, ardından isocortex soyulabilir, kesmek için korpus kallosum distal kenarına doğru itin.
   11. Onun ventolateral kenarından itibaren hipokampus (Şekil 2E) soyulabilir.
   12. Ortabeyin kaydedin.
   13. 200 g sıçan 2.500 mikron kalınlığında 120 gr sıçan 2,400 mikron kalınlığında ikinci bir bölümü, atın. Petri kabı (Şekil 2F) üzerinde filtre kağıtları bölümüne yerleştirin. Alternatif olarak, beş 500 mı'lik kesitler elektrofizyoloji için bu aşamada atılabilecektir.
   14. Kes ve jilet ile singulat korteks kaydedin.
   15. Isocortex (Şekil 2F) kaldırmak için internal kapsül de jilet ile yanal kesim olun.
   16. Amygdali (Şekil 2F, G) kaldırmak için jilet ile eğik kesikler yapın.
   17. Hipotalamus kaldırmak için jilet ile kesilmiş bir kutu yapın. Yanalkesintileri görülebilir hipotalamus ve ventromedial çekirdeğine yönlüdür. Biz sadece üçüncü ventrikül veya ventral tegmental alan (Şekil 2H) Yukarıdaki dorsal kesim yapmak.
   18. Korpus kallosum içine spatula itin ve hipokampus bağlı isocortex arasında küçük bir parça uzak çekin. Hipokampal komissür ventral spatula dar ucuna yerleştirin ve hipokampus koparmak için dorsal yükseltmek.
5. RNA Koruma ve Beyin Dokusu ve Kan Örneklerinde Protein:
   1. RNA testi için Medya:
      1. Beyin: RNAlater RNA stabilizasyonu reaktifi, Eppendorf tüpleri içerisinde 76106.
      2. Kan: PAXgene Kan RNA Tüp (PreAnalytix, Quagen).
   2. Kan proteini (CORT) tayini için Medya: Çözüm d-HBSS, w / o Ca 2 + ve Mg 2 +, (Kalite Biyolojik, Inc.)
   3. Depolama:
      1. Toplanan beyin dokusu olanlar en fazla 12 saat süreyle kuru buz bir sepet içinde saklanır ve daha sonra -70 ° C derin dondurucuda6 ay, çalışma süreleri içinde kullanılmak üzere.
      2. Toplanan kan reaktifler 6 ay içinde kullanımı, çalışma süresi boyunca, -70 ° C'lik dondurucuda saklanabilir ve bundan sonra, nüfuz etmesi için gece boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilir.

3. Mitokondriyal & Mitokondri ile ilgili Nükleer Genlerin Gen Mikroarray

Beyin dokularında sıçan mitokondrial fonksiyonları incelemek için, son zamanlarda sıçan mitokondri-nöron odaklı mikroarray (rMNChip) ve beyin dokularında ¹⁸ diferansiyel yolların hızlı tespiti için biyoinformatik araçlar geliştirdik. rMNChip mitokondrial fonksiyonları, stres yanıtı, sirkadiyen ritim ve sinyal iletimi dahil 1.500 gen içermektedir. Biyoinformatik araç Farklı olarak ifade genlerin bilgisayar için bir algoritma ve microarray sonuçları için basit ve sezgisel yorumlanması için bir veritabanı içerir.

1. Purificatiodokulardan elde edilen toplam RNA n (Cat # GPM-Kit 2011-1, GenProMarkers):
   1. RNA spesifik nüve Sıçan beyin dokularında daha sonra stabilizasyon reaktifi (Qiagen) RNA.
   2. Dispergierstation (IKA Labortechnik) Ultra-turrax T8 kullanarak Doku (600 ul GPM-L / B tamponunda 30 mg) homojenizasyon.
   3. 15 dakika için 21,000 rpm'de Sorvall 1.5 ml'lik tüplerde santrifüjleyin.
   4. 2 ml toplama tüpü ile bir spin kolon içine süpernatant süzün.
   5. 3 dakika 15.000 rpm'de sütun tüpler santrifüj, flow-through atın.
   6. Spin sütunların her birine 700 ul GPM-S / B tamponunu ekleyin, flow-through atın, 15 saniye boyunca 16,000 rpm'de sütun tüpler santrifüj.
   7. Spin sütunların her birine 500 ul GPM-W tamponunu ekleyin, bir kez tekrarlayın, 15 sn için 16.000 rpm'de sütun tüpler santrifüj.
   8. Yeni bir 1.5 ml toplama tüpüne spin kolon yerleştirin.
   9. Spin sütunların her birine 30 ul DEPC-işlenmiş su ekleyin, 16.000 rpm'de santrifüj1 dakika, bir kez tekrarlayın.
   10. RNA konsantrasyonu ölçün, DNaz-ve RNaz içermeyen su ile 1 mg / ul konsantrasyonunu ayarlamak örnekleri mikroarray etiketleme için hazırız.
2. Mikroarray etiketleme ve hibridizasyon (Cat # Array 900, Genisphere):
   1. 1.0 mikrogram sıçan toplam RNA üreticinin yönergelerini izleyerek cDNA sentezi ve mikroarray etiketlenmesi için kullanılır.
   2. Daha önce tarif edildiği gibi Mikrodizi hibridizasyon 12-16 saat süre ile 65 ° C 'de bir rMNChip üzerinde gerçekleştirilmiştir. ¹⁸
3. Melezleşmiştir Mikroarray Slaytlar (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers) Yıkama:

   Çözüm Yıkama	Hacim	20 X SSC	% 10'luk SDS	GKD 2 O
   0.5 X SSC/0.01 SDS	500 ml	12.5 mL	0.5 ml	500 ml
   0,5 X SSC	500 ml	12.5 mL		500 ml
   0,1 X SSC	500 ml	2.5 ml		500 ml
   0.01 X SSC	500 ml	0.25 ml'lik		500 ml

   
   Yıkama sırasında slaytlar ışıktan korunmalıdır. Slaytlar herhangi bir aşamada kurumasına izin vermeyin.
   1. Bir BioShaker (Moleküler Technologies Inc, St Louis, MO üzerine kavanoz çalkalayarak oda sıcaklığında: Cam Coplin kavanoza 250 ml Çözüm 1 (70312-20, Elektron Mikroskobu Bilimler, Hatfield, Pensilvanya Kedi #) slaytlar yıkayın ) kapak slipi tüm kadar cam slaytlar (O <3 dakika sürer) düşer.
   2. 3 dakika kavanoz ajitasyon tarafından başka bir kavanoza 250 ml Çözüm 2 ile slaytlar yıkayınız.
   3. 250 ml Çözüm 3 slaytlar yıkayınız, 3 dk süreyle kavanoz dönen iki kez bu adımı yineleyerek başka bir kavanozun içinde.
   4. 10 sn için başka bir kavanoza 250 ml Çözüm 4 ile slaytlar yıkayınız. Hemen 5 dakika için 1000 rpm'de bir Sorvall santrifüj Süper T21 PN11779 plakaları ve ST-H750 rotor üzerine yerleştirilmiş kavanoz santrifüjleme ile slaytlar kurutun.
   5. Kısa sürede tarama için bir kutu içinde yıkanmış slaytlar yerleştirin.
4. Mikroarray görüntü tarama ve ilgili kullanım kılavuzu ve odak takip ScanArray Express Mikroarray Tarayıcı (Perkin Elmer) kullanılarak analizi:
   1. Mikroarray görüntü tarama: protokolü tarama vs kolay tarama.
   2. Veri sonuçlarına LAZER güç, PMT ve normalizasyon yöntemlerinin etkisi.
   3. Görüntü üzerine GAL dosyasının Hizalama.
   4. Tam ızgaralara noktalar Hizalama.
5. Veri analizi: mikroarray veri analiz için özelleştirilmiş hesaplama prosedürleri mikroarray görüntü değerlendirme, veri filtreleme, spot büyüklüğü düzeltme, içerme, normalizatio dahiln ve karşılaştırma gibi daha önce ¹⁸ tarif. Tekrarlanabilir ve doğrulanabilir microarray sonuçları ^{2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18,} ​​üretim sağlamak için yukarıda açıklandığı gibi Buna ek olarak, ontoloji, yol ve ağ analizi için yöntemler aynıdır.

4. Kan Örnek Toplama ve Plazma CORT Konsantrasyon Ölçümü

1. Anestezi hayvanlardan öncesi veya sonrası stres kuyruk kan örnekleri dolaşımdaki CORT düzeylerinin belirlenmesi için, Gün-1 Heparinize tüplere 14, 21 ve 30 toplanır.
2. Hayvan ötenazi edildikten sonra Trunk kan örnekleri heparinli tüplere toplanır. Plazma -70 ekstre edilmiş ve depolanan ° C'de analize kadar.
3. Plazma ekstraksiyonu için Medya:
   1. RNA ekstraksiyonu için kan örnekleri PAXgene Kan RNA tüpleri (PreAnalytix, Quagen) kullanılarak toplanan
   2. DNA ekstraksiyonu için kan örnekleri PAXgene Kan DNA tüpleri (PreAnalytix, Quagen) kullanılarak toplanmıştır.
   3. Protein analizi için kan örnekleri MaketLab # ML5601 gelen Lityum Heparin Kapiler Koleksiyonu tüp (200 ul) kullanılarak toplanmıştır.
4. Plazma CORT konsantrasyonu Aktif Rat Cort ÇED (Diagnostic Systems Labs Inc ile test ve analiz http://www.beckmancoulter.com/ aşağıdaki gibi):
   1. Kullanılacak bantlar mikrotitrasyon işaretleyin.
   2. Konjuge Dilüent Rat CORT Enzim Konjugat Konsantre sulandırarak Sıçan CORT Enzim Konjugat Çözüm hazırlayın.
   3. Pipet 25 ul Standartlar, Kontroller ve kuyulara Bilinmeyenler.
   4. Bir yarı-otomatik dağıtıcı kullanarak her kuyucuğa 100 ul Enzim konjugat solüsyonu ekleyin. Yavaşça iyi tutucu 5-10 sn dokunun.
   5. Iyi bir yarı-otomatik dağıtıcı kullanılarak her 100 ul Rat CORT Antiserum ekleyin.
   6. 60 dakika için 500-700 rpm'de bir çalkalama grubu üzerinde, oda sıcaklığı, 25 ° C sıcaklıkta inkübe kuyu.
   7. Her wel aspire ve yıkayınotomatik mikroplak yıkayıcı kullanarak Yıkama Çözeltisi ile l 5 kez. Emici malzeme üzerine ters plaka kurutunuz.
   8. Iyi bir yarı-otomatik dağıtıcı kullanılarak her TMB Kromojen Çözüm 100 ul ekleyin.
   9. 500-700 rpm olarak ayarlanan bir yörünge mikroplak çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15-20 dk inkübe edin. Renk değişimi izleyin.
   10. Bir yarı-otomatik dağıtıcı kullanarak her kuyucuğa 100 ul Durdurma çözeltisi ekleyin.
   11. Elle 5-10 sn plaka çalkalayın.
   12. 30 dakika içinde kuyudaki çözüm absorbans okuyun.
   13. Filtre 450 nm'de ayarlanmıştır. * ÇED kitleri de immünobiyolojik Laboratuvarları (satın alınabilir www.ibl-america.com ).

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Sıçanlar ölçülü ve kuyruk şok maruz kalmaktadır. Müteakip vücut ağırlığı, Plazma kortikosteron konsantrasyonu ve akustik irkilme tepkisi ölçülür A:. Stres Pozlama: Hayvanlar havalandırılan bir pleksiglas tüp içinde immobilize edilerek sınırlanmıştır. Kırk elektrik şoku (2 mA, 3 sn beklemeli ;) 150-210 sn B ve C yarı rasgele aralıklarla onların kuyrukları teslim edilir:. Büyüme sırasında vücut ağırlığı Stres geciktirir kazanç: Vücut ağırlığı ve gıda ve su tüketimi ölçülür Orada Günü 14 kadar hemen sonra stres üç gün gününde stres (Gün -3), önce ve sonra her gün. Stres sırasında vücut ağırlığı artışı eksikliği telafi asla D:.. Stres arttıkça plazma kortikosteron konsantrasyonu D: Akustik irkilme: Hayvanlar son gününü izleyen bir temel okuma ve 12 gün gibi stres bir gün önce (gün-1) test edilmiştir stres ardışık 3 gün. Stres ve Kontrol - - her grup için veri akustik yüzde olarak ifade edilirgün gün -1 ila 12 bağıl korkutmak. Stres belirgin akustik irkilme refleksinin artırır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2 amigdala, hipokampus ve beyin dilim gelen hipotalamus diseksiyonu A:.. Sıçan beyin, ventral görünümü: orta serebral arterlere Oklar B:. Vibratome taşınacak hazır beyin blok, ventral görünümü. C: yukarı vibratome tepsi, kaudal tarafına yapıştırılmış beyin blok, korteks bıçak bakacak. Kaudal beyin zaten kaudal hipokampus teşhir kesip olmuştur. . Blok 2.500 mikron alınacak hipokampüsün büyük bir kısmını içeren dilim D için artık hazırdır: Kaudal hipokampus içeren 2,500 mikron kalınlığında dilim D:. TO isocortex (ISO) hipokampus (HC) ve orta beyin soyulmuş hipokampus soyulmuş F:.. amigdala ve hipokampus rostral içeren 2,500 mikron kalınlığında dilim G: isocortex eksize ve amigdala (Amyg) rezeke edilmiş . H:. Hipotalamus (HT) eksize ve deplase olduğu büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3. Glukokortikoid reseptör (GR) ve amigdala minerocorticoid reseptörü (MR), hipokampus, hipotalamus ve frontal korteks öncesinde (C, kontrol) ve sonra (Str) kuyruk şok stres mRNA ekspresyon düzeyleri. Birimler kontrol oranı vardır; çubukları SEM şunlardır: Amigdalanın: Stres minerocorticoid reseptör mRNA ekspresyonu azalır B: Hippocampus: Stres increa.ses minerocorticoid reseptör mRNA C:. Hipotalamus:. Stres minerocorticoid reseptör ekspresyonunu artırır D: Frontal Korteks: Stres glukokortikoid reseptör mRNA yanı sıra minerocorticoid reseptör mRNA ekspresyonu azalır.

GR sıçan için (121bp) PCR primerleri şunlardır:	1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
Sıçan MR (99 bp) PCR primerleri şunlardır:	1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

Şekil 4. Küme ve RNA heatmap ayirt serebellum (CL), beyin (CR), frontal korteks (FC), hipotalamus (HT) ve hipokampus (HC) dahil 5 sıçan beyin dokularında türetilmiştir 64 genleri eksprese. Renkli harita d kat değişiklikleri gösterirkendi-(yeşil) ve yukarı (kırmızı) ifade genler. Bu beş beyin dokuları için 15 mikro deneylerden elde edilen 64 genlerinin her biri için 9 ölçüm normalize edilmiş sinyal yoğunlukları (A) ve küme heatmap. Her gen ekspresyonu teknik kopyaların ve deneysel triplicates ölçüldü. (B) 64 genlerinin her biri, bu 9 ölçümün ortalaması RNA seviyelerinin küme ve ısı haritası. Bu sonuçlar mitokondriyal gen ekspresyonu belirgin farklılıklar ve beynin farklı bölgelerinde farklı enerji talepleri var hipotezini desteklemektedir nedenle ilgili fonksiyonları göstermek. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

RMNChip ve biyoinformatik araçlar Bizim uygulama serebellum (CL), beyin (CR), frontal korteks (FC), hypotha dahil 5 sıçan beyin dokularında türetilmiştir Farklı olarak ifade RNA ile 64 gen küme ve heatmap tanımlanmasına yol açmıştırLamus (HT) ve hipokampus (HC) (Şekil 4). Bu veriler mitokondriyal gen ekspresyonu ve bu nedenle ilgili fonksiyonları belirgin farklılıklar göstermektedir. Sonuçları beynin farklı bölgelerinde gelen beyin fonksiyonları yürüten amacıyla farklı enerji miktarı talep olduğunu göstermektedir.

Tartışmalar

TSSB tanısı potansiyel denekler tarafından bildirilen kendi kendine psikiyatrik belirtiler (DSM IV) dayanmaktadır. Hiç iyi tanımlanmış biyolojik anda potansiyel TSSB hastalarının patofizyolojik durumu erişmek için kullanılabilir. TSSB yaşamı travmatik olaylar tehdit ve ana psikiyatrik belirtilerin ilk olaylardan sonra aylar ve hatta yıllarca kurtulan hayatında bugünkü kalır kışkırttığı bir hastalıktır. TSSB olan hastalarda ortaya en belirgin ve inatçı belirtileri hipervijilans, gecikmiş aşırı irkilme tepkisi ^{14, 15, 16} ve HPA ekseninin belirgin bir uzlaşma vardır. Travmatik stres ²⁴ kesildikten sonra, insanlarda bu belirtiler kalır, ya da üç aylık bir gecikme ile görünür. 150 gram ağırlığındaki sıçanlarda kaçınılmaz kuyruk şok modeli (ITS) - TSSB biyomarkeri çalışmaları için Bizim şimdiki model sağduyuya ve üç sürekli gün (40, 2 mA tailshocks 2 saatlik oturumlar) için tekrarlanır kuyruk şoklara kullanır. Bu ITS modeli vardırönemli ölçüde PTSD ^{17 patofizyolojisi, 7, 4, 10} taklit etmek için gösterilmiştir. Bizim laboratuvar ve diğer laboratuarları sıçanlarda stres ITS modeli TSSB vakalarında ^{17, 7, 10, 9} bulunanlara benzer davranışsal ve nörobiyolojik değişiklikler neden olduğunu doğruladılar. Özellikle, bu gerilmiş sıçanlar (1) ile karşılaştırıldığında insanlarda sıçan yaşamının sıkıştırılmış zaman ölçeği belirli bir stres bırakıldıktan sonra birkaç gün görünen bir gecikmeli ve aşırı irkilme yanıtı, TSSB hastada semptomların 1-3 ay geciktirme ile karşılık gelen gösterirler (DSM-IV-TR TSSB Criterian D / E ^13), (2) gonadotropin (HPA) arasında uzlaşma gösteren birçok (10) gün, ve (3) engelli vücut ağırlık artışı için geliştirilmiş plazma kortikosteron (CORT) sonrası stres TSSB metabolik düzenleme disfonksiyon karşılık bırakma. Tilki koku, yırtıcı maruz kalma veya potentiation irkilme tepkisi, exhi korktuğu literatürde hiçbir kanıt yokturBiraz bu kalıcı davranışsal ve nöroendokrin fenotipleri TSSB ile ilişkili.

Tek bir stres oturumu (1DS) maruz Sıçanlar geçici sergiledik, ama 3DS sıçanlar ¹⁷ tarafından görüntülenen kalıcı anormallikler mevcut deney 3DS ve 1DS sıçan 4, 7, ve stresör kesildikten sonra 10 gün irkilme tepkisi göre değil. Önceki çalışmaları ile uyumlu olarak, sıçanlarda artmış bazal plazma CORT seviyeleri ilk gün sonrası stres ¹⁷ sergiledi vurguladı. Bu CORT miktar 1DS grubundaki sıçanlardan daha 3DS sıçanlarda CORT daha yüksek seviyeleri ile bir stres poz sayısını duyarlı idi. Irkilme sensitizasyon sadece 3DS sıçanlara 10 gün sonrası stres, belirgin olur, oysa irkilme yanıtı için olduğu gibi, 1DS sıçanlar, bir aşırı irkilme yanıtı 7 gün sonrası stres, sergilerler. Böylece, tetikleyici kesilmesinden sonra bir aşırı irkilme yanıtı ortaya gerilme oturum poz sayısı ile ilgili olduğu görülmektedir. 3DS stresli modeli görünüyorTSSB belirtileri ve stres bırakılmasını takiben zamanlama ile ilişkili anahtar ölçülebilir davranışsal fenotipleri ile ilişkili biyobelirteçlerin değişmiş ifadesini anlamak için yararlı olabilir. Genomik sonuçlar büyük ölçüde TSSB dahil kompleks ve multifaktöryel nörolojik bozukluklar, altta yatan moleküler mekanizmalar sistemleri-biyolojik çalışma ve anlaşılmasını kolaylaştıracak diferansiyel yolları, gen ve protein belirteçler, tespit etmek rMNChip ve biyoinformatik araçlar uygulamak için prensip kanıtı sundu.

Bizim paradigma bilişsel ve TSSB daha karmaşık davranışsal yönleri dalmak değil, biz ITS modeli ¹ o değişmiş uyku alışkanlıkları zorluk düşme ve uykuda kalmak ve TSSB hastalarında ¹¹ (DSM-IV-TR TSSB kabuslar karşılık unutmayın Kriter D ^13), ve kaçış / kaçınma ITS modeli öğrenme ve iştahlı görevin öğrenme eksiklikleri 5 (DSM-IV-TR TSSB Kriterleri C ¹³⁾ hafıza noksanlığı> 12 karşılık gelir. Şimdiki model TSSB karakteristik anahtar semptomları ile ilişkilidir ve merkezi, mekanistik biyobelirteçler, hastaların alınabilir TSSB periferik biyobelirteçleri arasında ilişki için iyi bir model, yapamam ^6. sağlar.