סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Summary

אנו מתארים מודל עכברים של הפרעת פוסט טראומטית (PTSD) החושפת את השינויים המתמשכים בתפקוד נוירואנדוקריניים ותגובה המאוחרת לטווח ארוך, המוגזמת פחד, אופייניים לחולי PTSD. מודל החיה ושיטות שתוארו כאן הם שימושיים עבור correlating סמנים ביולוגיים בגרעיני מוח, שהם מכאניים אך לא ניתן למדוד בחולים, עם סמנים ביולוגיים בתאי דם לבן בפריפריה, שיכול.

Abstract

זיהוי סמנים ביולוגיים המייצגים את האבולוציה של הפתופיזיולוגיה של הפרעת דחק פוסט טראומטית (PTSD) הוא חשוב וחיוני, לא רק לאבחון אובייקטיבי, אלא גם להערכת יעילות וחוסן טיפולי לטראומה. מחקר מתמשך מכוון זיהוי סמנים מולקולריים לתסמונת פוסט טראומטית, כוללים חלבונים טראומתיים מושרים, transcriptomes, סטיות גנטיות ומאפננים גנטיים, באמצעות דגימות ביולוגיות מהדם של הנבדקים, הרוק, שתן ורקמות מוח לאחר מוות. עם זאת, המתאם של מולקולות אלה סמנים ביולוגיים בדגימות היקפיות או נתיחה שלאחר מוות לתפקודי מוח המיוחסים עם תסמינים פסיכיאטריים בתסמונת פוסט טראומטי אינו פתור. כאן, אנו מציגים מודל חיה של PTSD שבשניהם סמני דם היקפי ומרכזיים במוח, כמו גם פנוטיפ התנהגותי, יכולים להיות שנאספו ונמדדו, וכך לספק את צורך המתאם של הסמנים הביולוגיים המרכזיים של PTSD, שהם מכניסטית וpathognoלא יכול להיות שנאסף דמוני אלא מאנשים, עם סמנים ההיקפיים ופנוטיפים התנהגותיים, שיכול.

מודל החיה שלנו של PTSD מעסיק איפוק וזעזועים חוזרים ונשנים זנב במשך שלושה ימים רצופים - מודל שאין מנוס מן הזנב ההלם (ITS) בחולדות. מודל שלה זה מחק הפתופיזיולוגיה של PTSD ^{17, 7, 4, 10.} אנחנו ואחרים וידאנו שהמודל שלה גורם לשינויים דומים לאלה שנמצאו ^ב17 נושאים ^{PTSD, 7, 10, 9} והתנהגותיות הנוירוביולוגי. באופן ספציפי, חולדות לחוצות אלה תערוכה (1) תגובה מאוחרת ומוגזמת הלה מופיעה מספר ימים לאחר הפסקת לחץ, אשר בהתחשב בקנה מידת הזמן הדחוס של החיים של החולדה בהשוואה לבני אדם, מתאימה ל02:59 עיכוב החודשים של תסמינים בחולי תסמונת פוסט טראומתיים (DSM-IV-TR-PTSD Criterian D / E ^13), (2) corticosterone המשופר הפלזמה (CORT) במשך כמה ימים, מה שמצביע פשרה של ציר hypothalamopituitary (HPA), ו (3) בו מפגררווח dy משקל לאחר הפסקת לחץ, המציין חוסר תפקוד של ויסות חילוף חומרים.

הפרדיגמות הניסיוניות המועסקות עבור דגם זה הן: (1) הפרדיגמה חוסר אונים נלמד בחולדת assayed על ידי מדידה של תגובה בהלה אקוסטי (ASR) ומיפוי של מסת גוף, (2) microdissection של מוח החולדה לאזורים וגרעינים; ( 3) assay אנזים צמוד immunosorbent (ELISA) לרמות בדם של CORT; (4) microarray ביטוי גנים הקשורים בתוספת ביואינפורמטיקה כלי ^18. microarray זה, המכונה rMNChip, מתמקד בגנים גרעיניים המיטוכונדריה ומיטוכונדריה הקשורה בחולדה, כדי לטפל באופן ספציפי bioenergetics העצבי המשוער להיות מעורב בתסמונת פוסט טראומטי.

Protocol

1. מודל התנהגות בעלי חיים של PTSD

1. נושאים: חולדות זכר בקנים ספרג Dawley (חוות Taconic, Derwood, MD) משמשות, שקלול 150-200 גרמו בזמן ממשלו של פרוטוקול הלחץ.
2. מדידה של מזון, צריכת מים ועלייה במשקל גוף: על הגעתו בחולדות המעבדה במשקל 100 ± 25 גרם שוכנת 2 לכלוב (גודל כלוב: 45x24x20 סנטימטר). מצע ריפוד כלוב (נסורת) משתנה פעמים בשבוע. בעלי חיים נשמרים באור מחזור הפוך 12-שעה (אורות על: 1800/0600 וכבויים: 0600-1800) בטמפרטורה (22 ± 4 מעלות צלזיוס) - הסביבה ולחות יחסית (30-70%)-מבוקרת שבוע אחד לפני ניסויים. מים וסטנדרטיים pelleted צ'או (הרלן (2018) 18% דיאטת חלבון מכרסם, דיאטות גלובליות, הרלן Teklad) זמינים באופן חופשי בכלובים הביתיים וbodyweights נרשמים ביום לפני 3 ימים, 3 ימים וב3 ימים לאחר הפסקת המתח .
3. הסתגלות: חולדות התאקלמו לשלושה ימים לboה מתקן החיה וחדר אקוסטי בהלה. כדי לסגל אותם לתא הלה אקוסטי, חי המטופלות בלמשך 5 דקות בכל יום במשך שלושה ימים שקדמו למדידות הראשוניות רצופים.
4. הדגיש פרוטוקול: החיות מוקצות באופן שווה על כל קבוצה מתבססת על משקל גופם והתגובה בלה בתחילת מחקר. אבחון נעשה בשתי קבוצות של בעלי חיים; כל קבוצה בהיקף של 16 בעלי חיים. הקבוצה 1 מקבלת את פרוטוקול לחץ, והקבוצה 2 היא השליטה.
   פרוטוקול החשיפה ללחץ הוא הליך מתמשך 2-HR, שבו כל מפגש מורכב מאיפוק ("אין מנוס ממנו") וזנב זעזועים, חזר פעם ביום במשך 3 ימים רצופים. הדגשה נעשית בבוקר (בתוך החלון של 0800 ו1200). בעלי חיים מרוסנים על ידי שמשותק בצינור פרספקס מאוורר. ארבעים מכות חשמל (2 מיליאמפר, 3 שניות משך; Shocker בעלי חי המבחן קייג' גריד הקומה, Coulbourn מכשירים, ארה"ב) מועברות לזנבותיהם במרווחים למחצה אקראיים של 150 to 210 שניות (תוכנה גרפית מדינת רישום, קישור יוניברסל Habitest, Coulbourn מכשירים, ארה"ב). הגירוי ב2 mA נבחר משום שהוא מרתיע, אבל לא כואב, כאשר פלט המגרה ממוקם על פני אצבעו של הנסיין. ג'ל אלקטרודה מיושם באמצעות Q-טיפ ליצירת שכבה דקה של ג'ל ניצוח בין האלקטרודה והעור של זנבו של העכבר. קליפים אלקטרודה מותאמים ומחוברים לזנב כדי להבטיח חיבור טוב מבלי להשפיע על זרימת הדם של הזנב.
5. תגובה בהלה אקוסטית (ASR): מדידת תגובה בהלה אקוסטית נערכה עם מערכת רתיעת תגובה אקוסטית מבחן (Coulbourn מכשירים, קולומבוס, אוהיו, ארה"ב) ^3. מערכת זו מורכבת מפלטפורמות משקל רגישים בתא קול מוחלש. המתמר, שהוא מד לחץ, בכל אחת מהפלטפורמות להקפיץ דורש כיול לפני השימוש. ראשית, המצמד חייב להיות במצב מצמידי DC לכיול. במצב זה, הפלט של מצמד דיעונה ישר כדלקמן הקלט מהפלטפורמה, המצב הנדרש לכיול עם משקולות סטטיים. המתמר הוא עבר למצב המצמיד AC במהלך ניסויים, כך שהשינוי היחיד המהיר בכוח, מה שמצביע על תגובה בהלה, הוא פלט. תנועותיהם של בעלי החיים בתגובה לגירויי קול נמדדות כך כשינוי מתח על ידי מד מתח בתוך כל פלטפורמה ונרשמו כתגובה מרבית המתרחשת בתוך 200 מילישניות של הופעת הגירוי לעורר בהלה-.
   ישנם שישה סוגים של ניסויים בגירוי: 100 dB לבד, 100 dB מראש עם דופק, 110 dB לבד, 110 dB מראש עם דופק, לפני הדופק לבד ואין שליטת גירוי. לכל סוג משפט הוצג שמונה פעמים. סוגי משפט מוצגים בסדר אקראי כדי למנוע תופעות מסדר והתרגלות. מרווחים בין המשפט לנוע באופן אקראי 15-25 שניות. בין שמונה מחקרים רק את הערכים המרביים נאספים בתוצאות ולבסוף מותאמים עם משקל הגוף של בעלי החיים באותו היום. בעלי חיים נבדקים ב יום אחדמתח efore או טיפול אחר כמו קריאה בסיסית ו1, 7, 14 ו 21 ימים לאחר היום האחרון של 3 ימים הרצופים של הליך לחץ או טיפול אחר.
6. ניתוח נתונים:
   1. ASR: המשרעת של תגובה בהלה אקוסטית נבדקה בכל פעם מוצגת כ"% מנקודת ההתחלה ", שמחושב באמצעות משוואה:% מבסיס = (משרעת משרעת / בסיסי מוחלט מוחלט) × 100%. עבור כל יום בדיקה, ANOVAs לצעדים חוזרים ונשנים מבוצעים על אמפליטודות להקפיץ עם גורמי לחץ ומעמד של מינון תרופה באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 16). Tukey, Bonferroni, או Dunnett בדיקות משמשות כדי להעריך הבדלים משמעותיים הפוסט הוק בין קבוצות בודדות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM
   2. צמיחה: משקל גוף וצריכת מזון ומים נמדדים במתח קודם -1 יום ובימים 14, 21 והשלימו בא 30 לפרוטוקול הלחץ. ניתוח סטטיסטי: נתוני צריכת מזון ומים חשופים לאחד-צעדים חוזרים ונשני ניתוח דרך שונה (ANOVA). כדי לנתח את השינויים בקצב צריכת מזון לאורך זמן, את כמות צריכת מזון מחולקת נוספת על ידי משקל גופו של הנושא כדי למזער את השונות במשקל גוף הנגרמות על ידי פרוטוקול המתח וההבדל ראשוני במשקל הגוף בין הקבוצות. כל ההליכים מתבצעים תחת האישור בהתאם לטיפול המוסדי ובעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

2. Dissection המוח

1. מכשירים וחומרים:
   1. צנצנת הרדמה: ". צנצנת תבלין" זה צנצנת זכוכית עם מכסה, מדידת גובה של 6 סנטימטרים וקוטר 5 סנטימטרים ב, כגון "צנצנת רוקחים", "צנצנת כדור צמר גפן", או
   2. גיליוטינה לחולדות, כגון מסופק על ידי קנט מדעי.
   3. Vibratome 1000:
      1. חותך סכין גילוח בחצי longitudinally, לשטוף את שמן עם אלכוהול, הכנס במהדק.
      2. מלא אמבטיה עם קרח מרוסק רגיל.
      3. מקוםמגש longitudinally.
      4. נגב את המגש של לחות לפני נחת טיפת cyanoacrylate.
   4. Rongeurs (דוגמאות לכך הוא מייקר פרידמן rongeur מMiltex, חתול. לא. 17-4801 או rongeur פירסון מחתול כלי המדע פיין. לא 16015-17).
   5. # 3 או # 5 תכשיטנים מלקחיים (חד כדי לשלוף את הדורה).
   6. מספריים קטנים עם נקודות חדות (Vantage V95-304 הוא דוגמה).
   7. (2) מריות שטוחות נירוסטה מינית, כגון משמש להעברת כימיקלי אבקה להיקף מאזן. הקצה הרחב הוא רכן קדימה כדי להתאים בין telencephalon וcalvarium.
   8. כפית להעביר גוש מוח. (כף מרק פלסטיק מהקפיטריה עובדת מצוינת.)
   9. אזמל # 10.
   10. להב כפול קצה תער (פלדת פחמן):
       1. מחצית אחת לvibratome.
       2. מחצית אחת לנתיחה.
   11. שני כלי זכוכית פטרי, ~ 3.5 אינץ ו4 אינץ בקוטר, כך שכל אחת מתאים בתוך השני. קרח מרוסק בבמנת ottom. שני ניירות סינון בצלחת העליונה. העבר פרוסה לתפקידים הנדרשים על ידי הזזת נייר הסינון.
   12. כוס 100 מ"ל.
   13. טפטף עין להשקיית מוח עם קרח צונן CSF. (זכוכית פיפטה פסטר עם קצה צר הוכנס בנורת 1/2 אינץ רחבה לטקס גומי עובדת היטב).
   14. נמחץ מגש קרח: כ 5 סנטימטרי גובו, 20 סנטימטרים, 10 סנטימטרי רוחב. מכיל:
       1. היצמד כל המכשירים בקרח הכתוש.
       2. הסידן נמוך / גבוה aCSF מגנזיום בבקבוק פלסטיק שניתן דפק לרסק את הקרח.
       3. Cyanoacrylate.
   15. הסידן נמוך / גבוה נוזל השדרתי מלאכותי מגנזיום (aCSF):
       1. במ"מ: 125 NaCl, KCl 2.5, 0.5 CaCl ₂ * 2H ₂ O, 2.0 MgCl ₂ * 6H ₂ 0, 1.2 nah ₂ PO ₄ * H ₂ O, 25 NaHCO, 11 גלוקוז.
       2. בבקבוק פלסטיק שניתן דפק לרסק את הקרח.
       3. צינה למשך 20 דקות ב-80 ° C מקפיא כדי להפוך אותו לרפש.
   16. ספוגיות כותנה.
   17. מסנן נייר: 42.5 מ"מ Whatman (חתול לא 1001 042.).
   18. צינורות צנטריפוגות מיני לאסוף חלקים קטנים של רקמה.
   19. ולס צלחת כדי לאסוף מבנים וקטעי הרקמה גדולים יותר.
   20. מגבת נייר.
   21. שקית Biohazard אדומה.
2. הרדמה:
   1. צנצנת הרדמה, פדה גזה, מלקחי isoflurane, מתכת, מוצבת במנדף.
   2. עכברוש שם בצנצנת הרדמה.
   3. לחלח תחבושת עם isoflurane ומקום בצנצנת ההרדמה.
   4. חכה עד הדוושה רפלקס - הנסיגה של הכפה כאשר האינטרנט הוא צבט עם מלקחיים - או רפלקס קרנית נעלם.
   5. לערוף: תפישת חולדה ביד אחת סביב חזה מאחור, לערוף עכברוש עם הגיליוטינה כקרובה לעורף ככל האפשר. האטלס עדיין בדרך כלל יישאר צמוד לגולגולת.
   6. איסוף דם: עכברוש לסחוט בבית החזה כדי למנוע מדם שפרץ מעורקי ראש.בהדרגה להרפות את האחיזה כדי לשלוט בזרימת הדם אל מכל האיסוף.
3. הסרה של המוח:
   1. מהירות לחתוך שרירים וכל חוליות שנותרו מbasiocciput עם המספריים הקטנים.
   2. שימוש rongeur ותחילה בנקב וגוזר את condyles העורפי וbasiocciput.
   3. חתך קו אמצע קרקפת עם אזמל.
   4. שימוש במספריים, לחתוך חתך sagittal אמצע בעצמות העורפיות והקודקודית. לתפוס את השולים החתוכים של הגולגולת עם rongeurs, לשבור אותה כמו קליפת ביצה מקו האמצע, להיות זהיר כדי למזער כל מגע עם המוח. לגזור ופריצת קו האמצע חזרה ניתן לעשות זאת בשלבים.
   5. כמוח חשוף יותר, זה קריטי ליתיז עליה aCSF המצונן קרח כדי לשמור על שלמותה וחיוניותה של הרקמה.
   6. כמו להינתק עצמות הטמפורליות וחזיתיות.
   7. עם מלקחיים עדינים, לקרוע את הדורה, והקפד לקבלtentorum cerebelli.
   8. עם מרית מיני מוכנס מתחת לאונות המצחיות להעלות את המוח מcalvarium פשוט מספיק כדי להכניס מתח על עצבי הגולגולת.
   9. תחצה את עצבי גולגולת עם המספריים.
   10. הרם את המוח כולו מהגולגולת, ושמטת לתוך הכוס של סידן נמוך קר / aCSF מגנזיום הגבוה. השאירו דקה או יותר כדי לקרר כך שהרקמה תהיה מוצקה, את המבנים באופן ברור לעין, והבריאות של הרקמה יישמרו.
   11. עם כפית הפלסטיק, להעביר את המוח על נייר הסינון בצלחת פטרי הקרח הצוננת, בצד גחון למעלה.
4. נתיחה של המוח:
   1. הפוך חיתוך רוחב עטרה עם סכין גילוח בעורק המוח האמצעי (איור 2 א).
   2. שמור אונה קדמית באופן זמני בקרח צונן סידן נמוך / גבוה aCSF מגנזיום בכוס 100 מ"ל.
   3. להעיף מוח, כך שהמשטח הגבה הוא למעלה. חתך גזע המוח בצומת של המוח התיכוןnd diencaphalon. בלוק המוח וכתוצאה נראה באיור 2B.
   4. זרוק את המוח חזרה נחסם לסידן נמוך קר / aCSF מגנזיום הגבוה.
   5. שימוש מריות מיניות, לנתח מוח קטן מלשד / פונס. שמור בתקשורת המתאימה לניתוח מיועד.
   6. להחזיר את המוח נחסם לצלחת פטרי. שימוש בשני ניירות סינון, תרים את המוח על ידי נחת נייר מסנן אחד על ventrum. עם זה, למקם את מטוס העטרה האחורי של המוח הגדול נחסם על קצה נייר הסינון השני. במקום נייר מסנן זה מטוס החתך הקדמי של המוח הגדול נחסם על ירידה של cyanoacrylate על צלחת חיתוך vibratome, קליפה מול הלהב.
   7. עם vibratome, לחתוך אותה מספיק ממוח הזנב כך שמראה hippcampus (האיור 2C).
   8. קח חלק, 2400 μ עבה בעכברוש 125 גרם, 2700 μ עבה בעכברוש 200 גרם. להעביר את הסעיף באמצעות קיסם אוזניים על ניירות שסננו בצלחת פטרי(האיור 2D).
   9. לגזור ולשמור את קליפת cingulate עם סכין הגילוח.
   10. בעזרת מרית שיניים, לדחוף לתוך הקצה הדיסטלי של כפיס המוח לחתוך אותו, ואז לקלף את isocortex.
   11. משולי ventolateral, לקלף את ההיפוקמפוס (2E איור).
   12. שמור את המוח התיכון.
   13. קח חלק שני, 2400 מיקרומטר עבה בעכברוש 120 ג', 2500 מיקרומטר עבה בעכברוש 200 גרם. הנח את הסעיף על ניירות הסינון בצלחת פטרי (התרשים 2F). לחלופין, חמש סעיפים 500 מיקרומטר יכולים להילקח בשלב זה לelectrophysiology.
   14. לגזור ולשמור את קליפת cingulate עם סכין הגילוח.
   15. לבצע חתכי רוחב עם סכין הגילוח בכמוסה הפנימית כדי להסיר isocortex (האיור 2F).
   16. לבצע חתכים אלכסוניים עם סכין הגילוח כדי להסיר amygdali (האיור 2F, G).
   17. הפוך תיבה לחתוך עם סכין הגילוח כדי להסיר את ההיפותלמוס. הרוחבקיצוץ הוא רוחבי לגרעין ventromedial של ההיפותלמוס, שהוא גלוי. אנחנו עושים את החתך הגבה בדיוק מעל החדר השלישי או אזור tegmental גחון (איור 2H).
   18. Push מרית כפיס המוח ולשלוף משם החתיכה הקטנה של isocortex המחוברת ליפוקמפוס. הנח את הקצה הצר של מרית הגחון להשליך י היפוקמפוס ולהעלות dorsally כדי לשלוף את ההיפוקמפוס.
5. שימור של RNA וחלבון בדוגמאות של רקמת מוח ודם:
   1. המדיה עבור assay רנ"א:
      1. מוח: ריאגנט RNAlater רנ"א ייצוב, # 76106 בצינורות Eppendorf.
      2. דם: הדם PAXgene רנ"א Tube (PreAnalytix, Quagen).
   2. מדיה לחלבון assay (CORT) מדם: פתרון d-HBSS, w / o Ca2 + ו Mg 2 +, (איכות ביולוגית, Inc).
   3. אחסון:
      1. רקמת המוח שנאסף מאוחסנת ראשונה בסל של קרח יבש לא יותר מ 12 שעות ולאחר מכן ב° C מקפיא -70לשימוש עד 6 חודשים, משך הזמן של המחקר.
      2. דם נאסף נשמר בטמפרטורת חדר בלילה כדי לאפשר ריאגנטים לחדור, לאחר שהוא מאוחסן במקפיא -70 ° C לשימוש עד 6 חודשים, משך הזמן של המחקר.

3. Microarray הגן של גנים גרעיניים מיטוכונדריאלי & המיטוכונדריה קשורים

ללמוד פונקציות המיטוכונדרי חולדות ברקמות מוח, פתח לאחרונה חולדת mitochondrion-נוירון הממוקד microarray (rMNChip) וכלים לביואינפורמטיקה זיהוי מהיר של מסלולים דיפרנציאלי ברקמות המוח ^18. rMNChip מכיל 1,500 גנים מעורבים בפונקציות המיטוכונדרי, תגובת לחץ, מקצב פעילות והעברת אותות. כלי ביואינפורמטיקה כולל אלגוריתם למחשוב של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי, ומסד נתונים לפרשנות פשוטה ואינטואיטיבית לתוצאות microarray.

1. Purification של רנ"א כלל מרקמות (חתול GPM-Kit # 2011-1, GenProMarkers):
   1. רקמות מוח חולדה של גרעינים מסוימים ברנ"א מאוחר RNA מגיבים ייצוב (Qiagen).
   2. רקמה (30 מ"ג במאגר μl 600 GPM-L / B) הומוגניזציה באמצעות Ultra-T8 Turrax על Dispergierstation (איקא LABORTECHNIK).
   3. צנטריפוגה בצינורות 1.5 מ"ל ב21000 סל"ד Sorvall במשך 15 דקות.
   4. למזוג supernatant לעמודת ספין עם צינור אוסף 2-מ"ל.
   5. צנטריפוגה את עמודת הצינורות ב15000 סל"ד במשך 3 דקות, להשליך זרימה דרך.
   6. הוסף / חיץ μl 700 GPM-B W לכל אחת מעמודות הספין, סרכזת את עמודת צינורות ב16000 סל"ד במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
   7. הוסף 500 חיץ μl GPM-W לכל אחת מעמודות הספין, סרכזת את עמודת צינורות ב16000 סל"ד במשך 15 שניות, חזור פעם אחת.
   8. הנח את עמודת הספין בצינור אוסף חדש 1.5 מ"ל.
   9. הוסף 30 מי μl DEPC טופל לכל אחת מעמודות הספין, צנטריפוגה בסל"ד 16000 עבור1 דקות, חזור פעם אחת.
   10. למדוד את ריכוז רנ"א, להתאים את הריכוז כדי מיקרוגרם 1 / μl עם וDNase מי RNase חינם, הדגימות מוכנות לתיוג microarray.
2. תיוג microarray והכלאה (# מערך חתול 900, Genisphere):
   1. 1.0 מיקרוגרם חולדת הסך רנ"א משמש לסינתזת cDNA ותיוג microarray בעקבות הוראות היצרן.
   2. כלת microarray נערכה על rMNChip על 65 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות כפי שתוארה לעיל. ¹⁸
3. כביסת שקופיות microarray הכלאה (Cat # GPM0101-6, GenProMarkers):

   כביסת פתרון	נפח	20 X SSC	10% SDS	DDH 2 O
   0.5 X SSC/0.01 SDS	500 מ"ל	12.5 מ"ל	0.5 מ"ל	עד 500 מ 'אני
   0.5 X SSC	500 מ"ל	12.5 מ"ל		עד 500 מ"ל
   0.1 X SSC	500 מ"ל	2.5 מ"ל		עד 500 מ"ל
   0.01 X SSC	500 מ"ל	0.25 מ"ל		עד 500 מ"ל

   
   במהלך השטיפה על השקופיות צריכות להיות מוגנות מפני אור. אל תתנה לשקופיות להתייבש בשום שלב.
   1. שטוף את השקופיות בפתרון 250-1 מ"ל בכוס Coplin קנקן (מק"ט: 70312-20, מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים, הטפילד, הרשות פלסטינית) בטמפרטורת חדר על ידי התססת הצנצנת על BioShaker (המולקולרי הטכנולוגיות בע"מ, סנט לואיס, מיזורי ) עד שכל תלושי הכיסוי לנפול על שקופיות הזכוכית (זה לוקח <3 דקות).
   2. שטוף את השקופיות עם פתרון 250-2 מ"ל בצנצנת אחרת על ידי התססת הצנצנת ל3 דקות.
   3. שטוף את השקופיות עם פתרון 250-מיליליטר 3בצנצנת אחרת על ידי ההחלפה של הצנצנת ל3 דקות, חוזר על שלב זה פעמים.
   4. שטוף את השקופיות עם פתרון 250-4 מ"ל בצנצנת נוספת עבור 10 שניות. מייד לייבש את השקופיות על ידי צנטריפוגה את הצנצנות מונחות על הצלחות וPN11779 ST-H750 הרוטור בT21 צנטריפוגה סופר Sorvall ב1000 סל"ד למשך 5 דקות.
   5. הנח את השקופיות השטופות בקופסה לסריקה בהקדם האפשרי.
4. סריקת microarray תמונה וניתוח באמצעות ScanArray Express microarray סורק (PerkinElmer) בעקבות מדריך ההוראות ולהתמקד ב:
   1. סריקת microarray תמונה: סריקה קלה לעומת סריקת פרוטוקול.
   2. אפקטים של ליזר שיטות כוח, PMT ונורמליזציה על תוצאות נתונים.
   3. יישור של קובץ גל גבי תמונה.
   4. מערך של כתמים לרשתות בדיוק.
5. ניתוח נתונים: ההליכים חישוביים אישית עבור ניתוח microarray נתונים כולל הערכת microarray תמונה, נתוני סינון, תיקון גודל נקודה, הכללה, normalization והשוואה כפי שתוארו לעיל ^18. בנוסף, השיטות לניתוח אונטולוגיה, מסלול ורשת הן זהות כפי שתואר לעיל על מנת להבטיח את הדור של תוצאות לשעתק ואימות microarray ^{2, 22, 25, 19, 20, 8, 23, 18.}

4. אוסף דגימת דם ומדידת ריכוז CORT פלזמה

1. דגימות דם זנב לפני או אחרי מתח מחיות מורדמות נאספות ביום-1, 14, 21 ו 30 לתוך צינורות heparinized לקביעת רמות מחזור CORT.
2. דגימות דם Trunk גם נאספות לתוך צינורות heparinized אחרי החיות מורדמות. הפלזמה מופקת ומאוחסנת ב -70 ° C עד ניתוח.
3. מדיה למיצוי פלזמה:
   1. דגימות דם למיצוי RNA נאספות באמצעות דם PAXgene רנ"א צינורות (PreAnalytix, Quagen)
   2. דגימות דם למיצוי DNA נאספות באמצעות צינורות דם DNA PAXgene (PreAnalytix, Quagen).
   3. דגימות דם לצורך ניתוח חלבון נאספות באמצעות צינורית ליתיום הפארין נימי אוסף (200 μl) מMaketLab # ML5601.
4. ריכוז CORT פלזמה נבדק ונותח עם העכברוש פעיל קורט EIA (אבחון מערכות בע"מ המעבדות http://www.beckmancoulter.com/) כדלקמן:
   1. סמן את רצועות microtitration כדי לשמש.
   2. להכין תמיסת אנזים המצומד CORT עכברוש על ידי הדילול יתרכז הצמוד אנזים CORT עכברוש בממס הצמוד.
   3. פיפטה 25 תקני μl, בקרות ונעלם לתוך בארות.
   4. הוסף 100 פתרון μl אנזים המצומד לכל גם באמצעות מתקן אוטומטי למחצה. נוקשים בעדינות את מחזיק שניות 5-10 היטב.
   5. הוסף עכברוש μl 100 CORT Antiserum לכל גם באמצעות מתקן אוטומטי למחצה.
   6. דגירת הבארות בטמפרטורת חדר, 25 מעלות צלזיוס, בסט שייקר ב500-700 סל"ד ל60 דקות.
   7. לשאוב ולרחוץ כל well 5 פעמים עם פתרון לשטוף באמצעות מכונת כביסת microplate אוטומטית. תמחה יבש על ידי צלחת היפוך בחומר סופג.
   8. הוסף 100 μl של פתרון אב צבע TMB לכל גם באמצעות מתקן אוטומטי למחצה.
   9. לדגור על דקות בטמפרטורת חדר 15-20 בהקפת microplate ייקר נקבעו על 500-700 סל"ד. צפה בשינוי הצבע.
   10. הוסף 100 פתרון μl עצירה לכל אחד גם באמצעות מתקן אוטומטי למחצה.
   11. Shake צלחת ביד השניות 5-10.
   12. קראו את הספיגה של הפתרון בגם בתוך 30 דקות.
   13. הסינון מוגדר ב450 ננומטר. * ערכות EIA גם ניתן לרכוש במעבדות Immunobiological (www.ibl-america.com).

5. נציג תוצאות

איור 1. חולדות מאופקות וחשופים להלם זנב. משקל גוף לאחר, ריכוז פלזמת corticosterone, ותגובה בהלה אקוסטית נמדדים:. חשיפה ללחץ: בעלי החיים מרוסנים על ידי שמשותק בצינור פרספקס מאוורר. ארבעים מכות חשמל (2 מיליאמפר, 3 שניות משך ;) מועברים לזנבותיהם במרווחים למחצה אקראיים של 150-210 השניות B ו-C:. רווח מפגרי מתח במשקל גוף במהלך צמיחה: צריכת משקל גוף ומזון ומים נמדדות מייד לפני המתח (יום -3), ביום משלושת הימים של מתח ולאחר מכן בכל יום אחר יש לאחר עד יום 14. חוסר רווח ממשקל הגוף במהלך לחץ הוא מעולם לא פיצה D:.. מגביר את לחץ ריכוז הפלזמה corticosterone E: רתיעה אקוסטית: בעלי חיים נבדקים יום לפני המתח (יום-1) כקריאת תחילת מחקר ולאחר 12 ימים ביום האחרון של 3 הימים הרצופים של המתח. נתונים עבור כל קבוצה - מתח ובקרה - מבוטאים כאחוז מאקוסטיתמבהיל ביום 12 בהשוואה ליום -1. מתח ניכר מגביר את רפלקס הלה אקוסטית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2 Dissection של האמיגדלה, ההיפוקמפוס, וההיפותלמוס מפרוסת המוח:.. מוח חולדה, נוף גחון: חצי נקודה לעורקי המוח האמצעיים B:. בלוק המוח, נוף גחון, הוכן למשלוח לvibratome. C: בלוק המוח הדבוק למגש vibratome, צד זנב למעלה, קליפה מול הלהב. מוח הזנב כבר לחתוך חשיפת היפוקמפוס הזנב. הבלוק מוכן כעת למיקרומטר 2500 פורס המכיל את החלק העיקרי של ההיפוקמפוס להילקח D:. הפרוסה העבה מיקרומטר 2500 המכילה את ההיפוקמפוס זנב E:. Tהוא isocortex (ISO) קילופו מההיפוקמפוס (HC) וההיפוקמפוס קלף מהמוח התיכון F:.. הפרוסה העבה מיקרומטר 2500 המכילה את האמיגדלה וההיפוקמפוס המקורי G: isocortex כבר נכרת והאמיגדלה (Amyg) resected . H:. ההיפותלמוס (HT) הוא נכרת ונעקר לוחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. רמות ביטוי של mRNA של הקולטן glucocorticoid (GR) וקולט minerocorticoid (MR) באמיגדלה, בהיפוקמפוס, בהיפותלמוס, וקליפת המוח קדמי לפני (C, שליטה) ואחרי (רחוב) מתח זנב הלם. יחידות הן חלק מכלל שליטה; ברים SEM: אמיגךלה: מתח מקטין ביטוי mRNA קולט minerocorticoid B: ההיפוקמפוס: increa מתח.ביטוי ses minerocorticoid קולט mRNA C:. היפותלמוס:. מתח מגביר ביטוי mRNA קולט minerocorticoid D: קליפת מוח קדמית: מתח מקטין ביטוי הקולטן glucocorticoid-mRNA, כמו גם ביטוי mRNA קולט minerocorticoid.

(121bp) את primers PCR לGR החולדה הם:	1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC
(99 נקודתי בסיס) PCR primers לעכברוש MR הם:	1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT

איור 4. אשכול וheatmap של RNA מתבטאים באופן דיפרנציאלי מ64 גנים הנגזרים מ5 רקמות מוח חולדה, כולל מוח קטן (CL), מוח גדול (CR), חזיתית קליפה (FC), ההיפותלמוס (HT), וההיפוקמפוס (HC). מפת צבע מציינת שינויים בקיפול דעצמו-(ירוק) ועד-(אדום) גנים הביעו. () אשכול וheatmap של עוצמת האות המנורמלת של 9 מדידות עבור כל אחד 64 גנים הנגזרים מ15 ניסויי microarray לרקמות המוח החמש שנים הללו. הביטוי של כל גן נמדד על ידי triplicates הטכני וtriplicates הניסיוני. (ב) אשכול וheatmap של רמות RNA הממוצעות של 9 מדידות אלה של כל אחד מ64 הגנים. תוצאות אלו מראות הבדלים ברורים בביטוי הגנים המיטוכונדריה ופונקציות לכן קשורות, התומכות בהשערה שלנו כי אזורי מוח שונים יש דרישות אנרגיה שונות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

היישום של rMNChip וכלי bioinformatic הוביל לזיהוי של צביר וheatmap של 64 גנים עם RNA מתבטא באופן דיפרנציאלי, הנגזר מ5 רקמות מוח חולדה כולל מוח קטן (CL), מוח גדול (CR), חזיתית קליפה (FC), hypothalamus (HT), וההיפוקמפוס (HC) (איור 4). נתונים אלה מצביעים על ההבדלים הברורים בביטוי גני המיטוכונדריה ולכן פונקציות נלוות. התוצאות מראות שאזורי המוח השונים דורשים כמות שונה של אנרגיה כדי לבצע את תפקודי מוח מתאימים.

Discussion

האבחנה של תסמונת פוסט טראומטי מתבססת על דיווח עצמי סימפטומים פסיכיאטריים (DSM IV) לפי נושאים פוטנציאליים. אין סמן ביולוגי מוגדר היטב זמין כעת לגשת למעמד pathophysiological של חולי PTSD פוטנציאליים. תסמונת פוסט טראומטי היא הפרעה שעוררה סכנת חי אירועים טראומתיים והתסמינים הפסיכיאטריים הראשיים נשארים נוכחים בחייו של ניצול השואה במשך חודשים ואף שנים לאחר האירועים הראשוניים. התסמינים הבולטים והעקביים ביותר שהתגלו בחולים עם PTSD הם hypervigilance, תגובה מאוחרות מוגזמת הלה ^{14, 15, 16} ופשרה, לכאורה, של ציר HPA. בבני האדם הסימפטומים האלה יישארו, או מופיעים באיחור של שלושה חודשים, לאחר הפסקה של ²⁴ הדחק הטראומתי. המודל הנוכחי שלנו ללימודי סמן ביולוגי של PTSD מעסיק איפוק וזעזועים חוזרים ונשנים זנב במשך שלושה ימים רצופים (מפגשי 2-hr של 40, 2 tailshocks MA) - מודל שאין מנוס מן הזנב ההלם (ITS) בחולדות במשקל 150 גרמו. המודל שלה זו ישהוכח לחקות במידה משמעותית הפתופיזיולוגיה של PTSD ^{17, 7, 4, 10.} המעבדה שלנו והמעבדות אחרות שתוודאנה כי המודל שלה ללחץ בחולדות גורם לשינויים התנהגותיים והנוירוביולוגי שדומה לאלה שנמצאו ^ב17 נושאים ^{PTSD, 7, 10, 9.} באופן ספציפי, חולדות לחוצות אלה תערוכה (1) תגובה מאוחרת ומוגזמת הלה מופיעה מספר ימים לאחר הפסקת לחץ, אשר בהתחשב בקנה מידת הזמן הדחוס של החיים של החולדה בהשוואה לבני אדם, מתאימה ל02:59 עיכוב החודשים של תסמינים בחולי תסמונת פוסט טראומתיים (PTSD-DSM-IV-TR Criterian D / E ^13), (2) corticosterone המשופר הפלזמה (CORT) במשך כמה (10) ימים, המצביעים פשרה של ציר hypothalamopituitary (HPA), ו (3) עלייה במשקל גוף מפגרת אחרי לחץ הפסקה, המקבילה לתפקוד הלקוי של ויסות חילוף חומרים של PTSD. אין כל עדות בספרות שריח שועל, חשיפת טורף, או לחשוש מתגובה בהלה potentiated, exhiקצת פנוטיפים התנהגותיים וneuroendocrinologic המתמשכים אלה הקשורים עם PTSD.

חולדות שנחשפו ללחץ מושב יחיד (1Ds) הפגינו חולפות, אך לא את הליקויים המתמשכים המוצגים על ידי 3DS ¹⁷ חולדות הניסוי הנוכחי לעומת התגובה בלה של 3DS ו1Ds חולדות 4, 7, 10 ימים ולאחר הפסקת דחק. עולה בקנה אחד עם עבודה קודמת, הדגיש חולדות הציגו CORT רמות פלזמה גבוהות basal הדחק פוסט היום הראשון ^17. רמות CORT אלה היו רגישות למספר חשיפות לחץ עם רמות גבוהות יותר בחולדות CORT 3DS מאשר ב1Ds חולדות. באשר לתגובה בהלה, חולדות 1Ds מפגינות 7 ימי דחק פוסט תגובה בהלה מוגזמת, ואילו רגישות הלה מתבררת רק 10 ימי הודעת לחץ בחולדות 3DS. כך, המראה של תגובה בהלה מוגזמת לאחר הפסקה מופיע גורם לחץ להיות קשור למספר החשיפות של הפעלת לחץ. המודל לחוץ 3DS נראהלהיות שימושי כדי לקבל תובנה הביטוי של סמנים ביולוגיים הקשורים השתנה עם הסימפטומים של PTSD ופנוטיפים התנהגותיים המדידים המרכזיים הקשורים לעיתוי לאחר הפסקת המתח. תוצאות הגנומי הציגו לספק הוכחת עיקרון של יישום כלי rMNChip וביואינפורמטיקה לזהות מסלולים דיפרנציאליות, וסמנים גנטיים וחלבון, שייאפשרו לימוד מערכות ביולוגיים והבנת מנגנונים מולקולריים שבבסיס הפרעות נוירולוגיות מורכבות וmultifactorial, כולל PTSD מאוד.

בעוד הפרדיגמה שלנו לא להתעמק הקוגניטיבית והיבטים התנהגותיים מורכבים יותר של PTSD, תציינו, כי דפוסי שינה משתנים במודל ¹ שלו מתאימים לקושי נופל ולהישאר ישנים ואת הסיוטים של ¹¹ (PTSD חולי PTSD-DSM-IV-TR קריטריוני ד ^13), ואת הליקויים בלמידת בריחה / הימנעות ולמידה של משימת אפטטיבית במודל שלה ^{12 מתאימים לריכוזים העניים וחסרי זיכרון של PTSD 5 (DSM-IV-TR-PTSD קריטריוני C 13). המודל הנוכחי קושר היטב עם התסמינים האופייניים של PTSD המפתח ומספק מודל טוב לcorrelating סמנים היקפיים של PTSD, שניתן לאסוף מחולים, עם סמנים מרכזיים, מכניסטית, שלא יכול 6.}