JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لفهم كيفية تحقيق الأشكال الخلية المعقدة ، مثل التشعبات العصبية ، خلال التنمية ، فمن المهم أن تكون قادرة على فحص دقيق أنيبيب المنظمة. نحن هنا وصف طريقة قوية لفحص العلامات immunohistological منظمة أنيبيب من التشعبات شجيري الخلايا العصبية الحسية تشجر والقصبة الهوائية ، والعضلات ، وغيرها ذبابة الفاكهة أنسجة الجسم الجدار اليرقة.

Abstract

لفهم كيفية تحقيق اختلافات في أشكال معقدة الخلية ، فمن المهم أن تتبع بدقة أنيبيب المنظمة. يرقات ذبابة الفاكهة الجسم جدار الخلية يحتوي على أنواع عدة نماذج لدراسة الخلايا والأنسجة التشكل. على سبيل المثال تستخدم الرغامى لدراسة التشكل أنبوب 1 ، وتشجر شجيري (DA) الخلايا العصبية الحسية لليرقة ذبابة الفاكهة قد أصبح النظام الأساسي لاستجلاء هذه الخلايا العصبية عموما والطبقة آليات محددة من 2-5 تمايز الشجيرية وتنكس 6 .

لا يمكن للشكل فروع تغصن تتفاوت تفاوتا كبيرا بين الطبقات الخلايا العصبية ، وحتى بين فروع مختلفة من الخلايا العصبية واحدة 7،8. الدراسات الوراثية في الخلايا العصبية DA تشير إلى أن تنظيم هيكل الخلية التفاضلية تكمن وراء الاختلافات المورفولوجية يمكن في شكل فرع شجيري 4،9-11. ونحن نقدم وضع العلامات المناعية قوية لأسلوبssay في المؤسسة أنيبيب المجراة في جذع تغصن DA الحسية العصبية (الشكلان 1 و 2 ، أفلام 1). هذا البروتوكول يوضح تشريح وimmunostaining يرقة من طور مرحلي الأولى ، مرحلة نشطة عندما الخلايا العصبية الحسية تغصن ثمرة وتنظيم المتفرعة يحدث 12،13.

بالإضافة إلى تلوين الخلايا العصبية الحسية ، وهذه الطريقة تحقق العلامات قوية للتنظيم أنيبيب في العضلات (أفلام 2 ، 3) ، والقصبة الهوائية (الشكل 3 ، الفيلم 3) ، وغيرها من أنسجة الجسم الجدار. ومن المفيد بالنسبة للمحققين الذين يرغبون في تحليل منظمة أنيبيب في موقعها الأصلي في جدار الجسم عند التحقيق في الآليات التي تحكم النسيج وشكل الخلية.

Protocol

1. إعداد الكواشف

وتنفذ تشريح وتلطيخ المناعى في غرفة المغناطيسي ودبس اليرقة أسفل باستخدام دبابيس للحشرات على شكل خصيصا : ملاحظات قبل البداية. ويمكن الاطلاع على تعليمات مفصلة حول بناء غرفة المغناطيسي ، وإعداد هذه المسامير في المراجع ذات الصلة 14،15. باختصار ، هو قطع حفرة مربعة 1x1cm في ورقة المغناطيسي وساترة الملصقة على الجزء الخلفي من ورقة لجعل غرفة صغيرة. وختم جانبي الغرفة مع الغراء الايبوكسي ، وبعد هذا الغراء وضعت تغسل الغرفة عدة مرات مع الايثانول 70 ٪ قبل الاستخدام. مستعدون دبابيس تشريح الحشرات عن طريق الانحناء إلى الشكل المطلوب ثم لصقها على علامة تبويب المعدن 14،15. بدلا من ذلك إلى علامة تبويب المعدن ، وقد استخدمنا مقلوب الرسم الصلب المسطح رأس دبوس مع مقبض مصنوع من طرف قطع صفراء. استخدام هذا الترتيب يتيح التحكم المغناطيسي غرفة قريبة الامدص دبوس لتحديد المواقع والأنسجة التي تمتد خلال التشريح.

ربما لدفع مراسل التعبير الجيني في مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا العصبية DA المحققين استخدام عدة خطوط مختلفة Gal4 (تلخيصها شيمونو وزملاؤه 16). كثير من هذه الخطوط المتوفرة من مراكز مساهمة عامة. في هذا البروتوكول ممثل ، نقوم بتنفيذ خط immunostaining التي فئتين متباينة من الخلايا العصبية هي DA المشترك المسمى : أبسط من الطراز الأول والأكثر تعقيدا من الدرجة الرابعة (P10 - Gal4 17،18 ، UAS - mCD8 : : Kusabira - أورانج (KO)).

  1. يعد الكالسيوم + + خالية HL3.1 المالحة
    1. في ملي : 70 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 20 MgCl 2 ، 10 NaHCO 3 و 5 HEPES ، والسكروز 115 ، وطرهالوز 5 ؛ 7.2 درجة الحموضة 19. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية. ملاحظة : الكالسيوم + + خالية حل يمنع تقلص العضلات أثناء تشريح.
  2. إعداد 2X PHEM العازلة
    1. في ملي : 130 أنابيب (60 عاما) HEPES ، 20 EGTA ، 4 MgSO4 ؛ 7،0 درجة الحموضة. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.

      ملاحظة : هذه المواد لن يحل حتى يقترب الأس الهيدروجيني 7.0.

  3. إعداد تثبيتي طازجة مباشرة قبل التثبيت.
    1. من أجل إعداد حل 25ml ، أولا بارافورمالدهيد 2G المزيج ، 100μl هيدروكسيد الصوديوم 1M والماء في أنبوب 10ML فالكون 50ml.
    2. هزة تثبيتي في درجة حرارة 55 مئوية مع حمام الماء شاكر حتى حل واضح. (سوف يكون الحجم الكلي حوالي 11.5 مل).
    3. بارد مثبت على الجليد.
    4. إضافة 12.5ml العازلة PHEM 2X.
    5. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك 1M.
    6. ملء حل مع الماء حتى وحدة التخزين 25ml.
    7. تصفية حل به Whatman الورق.

2. اليرقات تشريح

ملاحظة قبل البداية : شبكات أنيبيب ، وخصوصا تلك الموجودة في التشعبات الحسية ، وانهيار بسرعة بعد بدء تشريح. ميلانhieving تشريح سريع في أقل من خمس دقائق تليها تثبيت الفورية هي العوامل الرئيسية في نجاح هذا البروتوكول.

  1. غسل يرقة في الماء وتتحرك بسرعة في هذا الانخفاض لهم باستخدام حلقة من الشعر.
  2. توجيه تصل اليرقة الجانب الظهري والجانب البطني على الزجاج. ملاحظة : هذا التوجه هو دراسة الخلايا العصبية الكتلة البطنية. لفحص الخلايا العصبية الكتلة الظهرية ، عكس الاتجاه.
  3. استخدام مركز الحشرات دبوس دبوس إلى نهاية الأمامي بالقرب من السنانير الفم. وضع دبوس على مقربة من نهاية للحصول على أفضل النتائج.
  4. ضع قطرة من HL3.1 المالحة في غرفة التشريح.
  5. قطع رأس الخلفي للغاية من الخروج مع microscissors اليرقة. ملاحظة : هذه الخطوة يفتح كوة في نهاية الخلفي لليرقة التي تتيح الوصول للmicroscissors (الخطوة 2.7).
  6. انتزاع مع ملقط منطقة القناة الهضمية التي بدس الآن للخروج من فتحة في نهاية الخلفي من اليرقة. برفق خارج القناة الهضمية ككل.
  7. ضعغيض من شفرة واحدة من microscissors من خلال الفتحة وقطع على طول خط الوسط بطني نحو الأمامي.
  8. باستخدام دبابيس الزاوية ، دبوس الزوايا ، الخطوط الخلفية الآن أولا ، ثم الأمامية. في وقت واحد تمتد برفق فتح فيليه اليرقات.

3. التثبيت ، وعرقلة ، وتلطيخ ، وتركيب شرائح اليرقات

وتتم جميع الخطوات تثبيت وتلوين في غرفة التشريح : ملاحظات قبل البداية. خلال هذه العملية ، يجب الحرص على عدم ضرب المسامير الحشرات عقد اليرقة لأن هذا قد يؤدي إلى تلف الأنسجة. لمنع التجربة من الجفاف ، نفذ جميع الخطوات تلطيخ في وعاء صغير محاط تثبرور الأنسجة مبلل.

  1. نضح في + + كا خالية HL3.1 العازلة باستخدام تلميح الصفراء. إضافة على الفور مثبت به آخر pipetteman.
  2. ماصة بلطف صعودا ونزولا لخلط تثبيتي ، مع ما تبقى من آثار الكالسيوم HL3.1 عازلة خالية + +في الغرفة. نضح على الفور ومن ثم إضافة مثبت جديدة في الغرفة.
  3. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  4. يغسل 10mins 6X في PBST (0.1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني).
  5. كتلة مع مصل الماعز 5 ٪ في PBST عن 20 دقيقة في RT.
  6. حظر حل محل مع الأجسام المضادة في مصل الدم الأولية المخففة 5 ٪ في الماعز PBST. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة الماوس المضادة للα - تويولين (DM1A) والفئران لمكافحة CD8 (5H10) على حد سواء المخفف 1 / 1000.

    ملاحظة : المحقق قد ترغب في استبدال الماوس المضادة للα - تويولين (DM1A) مع الماوس المضادة للFutsch (22C10) 20،21 المخفف 1 / 1000 في بعض الظروف (انظر المناقشة).

  7. احتضان بين عشية وضحاها (على الأقل 16H) في 4 درجات مئوية.
  8. يغسل 10mins 6X في PBST.
  9. إضافة الثانوية حل الأجسام المضادة في مصل الماعز المخفف 5 ٪ في PBST. الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة اليكسا فلور 488 الماعز المضادة IgG و الفأر Cy3 حمار مفتش مكافحة الفئران. الحفاظ على عينة مغطاة لمنع fluorophoreالصور تبيض 22.
  10. إما في احتضان RT لمدة ساعتين ، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  11. يغسل 10mins 6X في PBST.
  12. وضع فيليه اليرقات على الشريحة إهاب من جانب إلى أسفل ، في جبل الجلسرين 80 ٪ ، وختم على جانبي مع طلاء الأظافر ساترة لجبل 'سريع'.
    ملاحظة : للحصول على إزالة الأنسجة المحسنة ، وعينة دائمة مستقرة ، في جبل DPX كما هو موضح سابقا 23.

4. ممثل النتائج :

تم فحص الفلورسنت تلطيخ تحت المجهر متحد البؤر. في أرقام 1-2 ، والفروع المختلفة داخل جذع تغصن وتنظيم هيكل الخلية المختلفة. الشكل 1 يبين منطقة جذع الخلية العصبية فئة DA الرابع في المرحلة الحادية و1 اليرقات طور مرحلي. يتم وضع علامة على الشجرة كلها مع mCD8 : KO والكشف عن ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة CD8 الفلورسنت والثانوية (Cy3). تم الكشف عن استخدام الألغام المضادة تويولين α - تويولين الأضداد وفلورescent الثانوية (اليكسا فلور 488). الفروع الرئيسية للتويولين إيجابية ، وبعض فروع هي رقيقة الجانب تويولين سلبية. 1 الفيلم عبارة عن مجموعة من مقاطع المسلسل من خلال تلطيخ مماثلة من الخلايا العصبيه فئة دا أنا. ويبين الشكل 2 منطقة من جذع الخلية العصبية DA الطبقة الرابعة ملطخة أجسام مضادة ضد Futsch وCD8 في المرحلة الحادية و1 اليرقات طور مرحلي. الفروع الرئيسية هي Futsch إيجابية ، وبعض فروع هي رقيقة الجانب Futsch سلبية. الشكل 3. الرغامى في جدار الجسم اليرقات تظهر منظمة أنيبيب المعقدة. 2 و 3 أفلام تظهر مقاطع من المسلسل من خلال تلوين الجسم وعضلات جدار القصبة الهوائية.

figure-protocol-8934
الشكل 1. التين. 1 يبين منطقة من جذع الخلية العصبية فئة DA الرابع في المرحلة الحادية و1 اليرقات طور مرحلي. يتم وضع علامة على الشجرة كلها مع mCD8 : KO والكشف عن استخدام الألغام المضادة للCD8 الأضداد والثانوية الفلورية (Cy3). تم الكشف عن استخدام الألغام المضادة للتويولين و- النبيبات ن الأجسام المضادة والثانوية الفلورية (اليكسا 488). لوحات متتابعة AC مبائر ض المقاطع (0.5μm) ، C' - C "، واحدة من تلطيخ الأضداد مثال جيم مع فريق من فروع (رأس السهم الأصفر) أو بدون (رأس السهم الأرجواني) ويسلط الضوء على ميكروتثبول. تسليط الضوء على النصال الأحمر ميكروتثبول الكامنة في طلائي الخلايا.

figure-protocol-9687
الشكل 2. التين. 2 يبين منطقة مماثلة في جذع الخلية العصبية دا الطبقة الرابعة ملطخة أجسام مضادة ضد Futsch وCD8 في المرحلة الحادية و1 اليرقات طور مرحلي. يتم وضع علامة على الشجرة كلها مع mCD8 : KO والكشف عن استخدام الألغام المضادة للCD8 الأضداد والثانوية الفلورية (Cy3). تم الكشف عن استخدام الألغام المضادة للFutsch Futsch الأضداد والثانوية الفلورية (اليكسا 488). الفروع الرئيسية هي Futsch إيجابية ، وبعض فروع هي رقيقة الجانب Futsch سلبية. ويسلط الضوء على سبيل المثال من الفروع مع (رأس السهم الأصفر) أو بدون (رأس السهم الأرجواني) Futsch.

= "jove_content"> figure-protocol-10396
الشكل 3. ملطخة القصبة الهوائية باستخدام بروتوكول مكافحة تويولين المذكورة أعلاه. هذا هو طور مرحلي اليرقة الثالثة وتشريح كما هو موضح سابقا 23،24. يظهر الفيلم 3 أجزاء المسلسل الموسع من حقل تميزت مربع.

فيلم 1. أقسام المسلسل تتبع تلطيخ تويولين طوال جذع شجيري من الدرجة الأولى الخلايا العصبية. يتم وضع علامة على الشجرة كلها مع mCD8 : KO (أرجواني) ، والكشف عن استخدام الألغام المضادة للجسم وCD8 الفلورسنت الثانوية (Cy3). تويولين (الأخضر) تم الكشف عن ان استخدام أجسام مضادة لمكافحة α - تويولين الفلورسنت والثانوية (اليكسا فلور 488). الحجم : جانب واحد من صورة الفيديو يناظر 46.88μm في المقطع. انقر هنا لعرض الفيلم.

الفيلم 2. أقسام المسلسل تتبع في تلطيخ تويولين بودذ عضلات جدار اليرقة طور مرحلي الثالثة. تم الكشف عن استخدام الألغام المضادة للتويولين α - تويولين الضد الفلورسنت والثانوية (اليكسا فلور 488). الحجم : جانب واحد من صورة الفيديو يناظر 46.88μm في المقطع. انقر هنا لعرض الفيلم.

الفيلم 3. أقسام المسلسل تتبع تلطيخ تويولين في الجسم جدار القصبة الهوائية ليرقة طور مرحلي الثالث ، مع وضع علامة في مربع Figure.3. تم الكشف عن استخدام الألغام المضادة للتويولين α - تويولين الضد الفلورسنت والثانوية (اليكسا فلور 488). الحجم : جانب واحد من صورة الفيديو يناظر 46.88μm في المقطع. انقر هنا لعرض الفيلم.

Discussion

لفهم مدى تعقيد الأشكال الخلية تتحقق من المهم أن تكون قادرة على فحص دقيق أنيبيب المنظمة. نحن هنا وصف طريقة قوية لتنظيم وضع العلامات immunohistological أنيبيب مقايسة من التشعبات العصبية شجيري تشجر الحسية. بالاضافة الى الخلايا العصبية الحسية تلوين ، وهذه الطريقة تحقق تلطيخ immunoh...

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

نشكر بتبريد للتمويل. وكان P10 - Gal4 هدية عينية فنسنت ألان (جامعة بول ساباتتيه ، تولوز ، فرنسا).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم الكاشف شركة كتالوج
عدد 		تعليقات
(اختياري)
ملقط دومون 11251-20
Microscissors FST 15000-08
الماوس المضادة للα - تويولين (استنساخ : DM1A) سيغما T9026 التخفيف 1 / 1000
الماوس المضادة للFutsch (استنساخ : 22C10)
طاف 		التنموية
دراسات
ورم هجين الضفة 		22C10 التخفيف 1 / 1000
مكافحة الفئران CD8 (استنساخ : 5H10) Caltag MCD0800 التخفيف 1 / 1000
الكسا فلور 488 المضادة للمفتش الماوس Invitrogen A - 11001 التخفيف 1 / 500
Cy3 مكافحة فأر مفتش جاكسون Immunoresearch 712-166-150 التخفيف 1 / 200

References

  1. Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
  3. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  4. Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
  5. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  6. Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
  7. Ramon y Cajal, S. . Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , (1911).
  8. London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  9. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  10. Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
  11. Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
  12. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
  13. Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  14. Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
  15. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
  16. Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
  17. Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
  18. Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
  19. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
  20. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
  21. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
  22. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
  24. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
  25. Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
  26. Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
  27. Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
  28. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
  29. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

57

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved