الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Summary

وصفنا استخدام التكنولوجيا ImageStream ( www.amnis.com)، والذي يجمع بين كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، لتحديد الآليات الخلوية لخلايا المناعة الأولية من الأفواج المريض واضحة المعالم. دراستنا توفر نموذجا للتحقيقات لتحديد نسب متعدية الاستجابات الخلوية محددة في عينات صغيرة من الأفواج الموضوع.

Abstract

الاختلافات الفردية في الحالة المناعية تحديد الردود على العدوى والمساهمة في شدة المرض والنتيجة. ويرتبط الشيخوخة مع زيادة الحساسية للالتهابات الفيروسية والبكتيرية وانخفاض القدرة على الاستجابة للقاحات مع انخفاض الموثقة توثيقا جيدا في الخلطية فضلا عن الخلية التي تتوسط فيها ^1،2 الاستجابات المناعية. لقد قمنا بتقييم مؤخرا من آثار الشيخوخة على الرقم مثل مستقبلات (TLRs)، والمكونات الرئيسية للنظام المناعة الفطرية التي تكشف عن العدوى الميكروبية والزناد دفاع المضيف مضادات الميكروبات ردود ^3. في لفيف كبير من الجهات المانحة البشرية الصحية، ونحن أظهرت أن حيدات الدم المحيطي من كبار السن قد انخفضت التعبير وظيفة TLRs معينة ⁽⁴⁾ ومستويات مماثلة TLR انخفاض والاستجابات يشير في الخلايا الجذعية (DCS)، مستضد تقديم الخلايا التي تقوم بدور محوري في الربط بين الحصانة الفطرية والتكيفية ^5. لقد أظهرنا dysregulation من TLR3 في الضامة 1د انخفاض إنتاج الإنترفيرون من قبل البلدان النامية من الجهات المانحة المسنين في استجابة للإصابة بعدوى فيروس غرب النيل ^6،7.

قصوى في فهمنا للتشيخ مناعي والتدخل العلاجي هو فهم مفصل لأنواع معينة من الخلايا الاستجابة وآلية (ق) من نقل الإشارة. لقد تقدمت الدراسات التقليدية من الاستجابات المناعية من خلال التصوير من الخلايا الأولية وعلامات الخلية المسح من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أو طخة مناعية فهمنا بشكل كبير، ومع ذلك، وتقتصر هذه الدراسات بشكل عام من الناحية الفنية من خلال حجم عينة صغيرة المتاحة من المرضى وعدم القدرة على إجراء تقنيات مختبرية معقدة على عدة الإنسان العينات. ImageStream يجمع كمية التدفق الخلوي في وقت واحد مع عالية الدقة التصوير الرقمي، وبالتالي يسهل تحقيق في السكان الخلية متعددة متزامنة لالتقاط كفاءة قابلية المريض. نحن هنا لشرح استخدام ImageStream في البلدان النامية لتقييم TLR7 / 8تفعيل بوساطة الزيادات في الفسفرة وإزفاء النووية عامل النسخ مفتاح، NF-κB، الذي يبدأ النسخ من الجينات العديدة التي تعتبر بالغة الأهمية بالنسبة الاستجابات المناعية ^8. باستخدام هذه التكنولوجيا، ونحن كما أظهرت مؤخرا تغيير غير المعترف بها من قبل من TLR5 إشارات والمسار NF-κB في حيدات من أقدم الجهات المانحة التي قد تسهم في الاستجابة المناعية المعدلة في الشيخوخة ^9.

Protocol

1. العزلة وتنشيط الخلايا المناعية

1. الحصول على 10-50 مل من الدم heparinized متطوعين أصحاء بعد الموافقة المسبقة عن كتابي في إطار المبادئ التوجيهية للمجلس مراجعة المؤسسية المحلية. يجب أن لدراسات الشيخوخة أو المرض يمكن المرضية والاستبعاد ومعايير الاشتمال لكل متطوع أو المريض تحدد بشكل واضح.
2. عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) باستخدام أنابيب لجنة مناهضة التعذيب أو Ficoll Paque زائد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية، ونيو جيرسي) وإجراء التجارب في يوم من العزلة ⁷ (الكواشف، الجدول 1).
3. احتضان PBMCs (3 × 10 ⁶ / أنبوب) في 1.5 مل أنابيب في المتوسط ​​0.6 لتر وحده أو مع حفز يغاندس TLR أو وكلاء تفعيل أخرى، مثل يجند TLR7 / 8 R848 (0.6 مل المتوسط ​​زائد 0،6 ميكرولتر من 10 ملي TLR7 / 8 يجند R848، تركيز نهائي 10 ميكرومتر) في 37 درجة مئوية ل10-60 دقيقة (InvivoGen، كاليفورنيا) ^9.

2. مختبرنحمل من خلايا

1. تسمية نسب الخلية وعلامات أخرى على سطح الخلية الحية الايقاف باستخدام الاجسام المضادة fluorescently مترافق. ملصق 3 × 10 ⁶ PBMCs لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في 100 ميكروليتر من PBS FBS 2٪ / في أنبوب 1،5 مل إيبندورف مع مزيج من الاجسام المضادة المحددة لسطح الأنساب الوحيدات أو العاصمة (الجدول 2). ويمكن تحديد التخفيفات الضد الأمثل في التجارب الأولية والعينات وينبغي أن تتم معالجتها على دفعات لتقليل الكثير إلى الكثير الاختلاف. بالنسبة لمخزون الجسم المضاد بائع من 0.1 ملغ / مل استخدام 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة (1:20 تخفيف). استخدام أنبوب منفصل من الخلايا المسمى مع واحد فقط المتقارن لون واحد لإعداد القنوات فلوري على الصك.
2. بعد وضع العلامات السطحية، وإصلاح الخلايا في 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. لتخزين حتى وقت التحليل، وخلايا للطرد المركزي في 500 XG والخلايا resuspend في تجميد عازلة (90٪ FBS التي تحتوي على 10٪ DMSO) في -80 درجة مئوية حتى يوم الفحص.
3. لتقييم عملية دفعات، سو الخلايا غير المعالجة، وحفزت من مجموعة من المانحين معا للحد من التقلبات. في يوم من التحليل، وذوبان الخلايا بسرعة في درجة حرارة 37 م حمام الماء، الطرد المركزي في ز 500x لإزالة تجميد عازلة.
4. إلى permeabilize الخلايا للكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا أو علامات أخرى، تعليق خلية resuspend في 100 ميكروليتر العازلة بيرم / غسيل دينار بحريني دينار بحريني (العلوم الحيوية، ونيو جيرسي). تسمية الخلايا المكونات مع الإشارة على سبيل المثال، 1:20 التخفيف من الأجسام المضادة أرنب (P65) المضادة للNF-κB (تركيز نهائي 10 ميكروغرام / مل، وسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، كاليفورنيا) لمدة 20 دقيقة على RT، الطرد المركزي في 500 XG، وطاف نضح خلايا resuspend في 100 دينار بحريني بيرم ميكروليتر / غسل العازلة التي تحتوي على 1:250 تخفيف المضادة للأرنب الماعز مفتش-Alexa647 (إينفيتروجن، كاليفورنيا)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
5. مباشرة قبل التصوير، ملون مباين نوى مع دابي (0.2 ميكروغرام / لتر، إينفيتروجن، CA) أو propidium يوديد (PI، و 20 نانوغرام / مل، إينفيتروجن، كاليفورنيا).

3. ImageStream التحليل

1. إجراء التصوير بواسطة ImageStream على عينات مجمعة في حزم للحد من التباين بين العينات البشرية. وكانت وسيلة لضبط قوة الليزر على النحو التالي: 200 ميغاواط عن 488 نانومتر، 10 ميغاواط عن 658 نانومتر و 250 ميغاواط ل405 نانومتر.
2. لتحليل ملفات البيانات (الشكل 1)، أولا، بوابة على الأحداث مع كثافة PI طبيعية وارتفاع نسبة الارتفاع PI (عرض: نسبة الارتفاع) للتمييز بين الخلايا واحد (R1) من الحطام (الأقل كثافة PI) أو أحداث متعددة الخلايا ( ارتفاع وانخفاض كثافة PI نسبة الارتفاع). حيدات هي ضمن بوابة لخلايا CD14 إيجابي. mDCs من خلال بوابة للخلايا التي هي عالية ومنخفضة لCD11c لCD4 (R2)، وانخفاض أيضا عن علامات-1 لين (R3).
3. استخدام أفكار البرامج (Amnis، WA) لتوفير تدبيرا فعالا الكمي لدرجة من تفعيل كل خلية. تحديد التشابه (أو شارك في التعريب) من عامل النسخ حشوية NF-κB النووية مع صبغ PI للإشارة إلى إزفاء داخل النواة (R4). وهناك ارتباط كبير من locali NF-κB/PIوينعكس الأسلحة سواء في درجة تشابه عالية ويدل على درجة من التنشيط ^10.
4. مقارنة نسب التشابه بين الجماعات المختلفة أو علاج المريض السكان تشير إلى كفاءة وظيفية النسبي للخلايا. تحديد البيانات من خلال مقارنة بين عينات إحصائية من القيم المطلقة أو الاختلافات أضعاف. استخدام أفكار البرامج لعرض الصور من الخلايا من قطاعات رئيسية من المدرج الاحصائي عدد السكان (الشكل 2).

4. ممثل النتائج

وكميا نحن مسارات إشارات استجابة ليجند نموذج الفيروسية من خلال تحفيز PBMCs مع يجند TLR7 / 8، R848 (الشكل 1). جمعنا كل الصور توطين الخلوية والإحصاءات السكانية في مجموعات لدينا عينة (الشكل 2). ImageStream يسمح لنا فرعية خلية بوابة مباشرة من PBMCs والاستجابات الخلية صورة من سكان الخلية المغلقة، ولكن لم يتم فرزها. هنا نحن كميا تأثير TLR قignaling على توطين النووية من NF-κB (P65) في Lin1، CD4 خافت، CD11c + النخاعي البلدان النامية (mDCs). في الأساس، لاحظنا على نسبة عالية من الخلايا unstimulated مع عامل النسخ NF-κB (P65) في السيتوبلازم. بعد التحفيز، الخلايا المعالجة يكون على درجة التشابه أعلى بكثير من NF-B (P65) مع PI صمة عار النووية، مشيرا إلى أن NF-κB (P65) translocated الى نواة بعد التحفيز (درجات التشابه وسيطة هي 1.52 و 3.01، على التوالي، الشكل. 2). وأشارت نتائج مماثلة في حيدات، TLR5 حفز ^9.

الشكل 1. تلطيخ والاستراتيجية المحاصرة لتحديد الآثار المترتبة على التحفيز على mDCs الإنسان. عامل النسخ NF-κB ينظم التعبير عن العديد من الجينات جهاز المناعة. هذه الدراسة تقيس توطين النووية من NF-κB (P65) في موضوع mDCs من ممثل واحد بعد TLR7 / 8 ليغا الثانية والتحفيز. في تركيز وقد تم تحديد الخلايا واحد من قبل المعزولة في الأحداث الإيجابية PI مع ارتفاع نسب النووية (R1). وكانت mDCs (Lin1، CD4dim، CD11c +) بوابات في R3. يتم رسم توطين النووية من NF-κB (P65) في R4. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. . إزفاء من NF-κB في mDCs بعد التحفيز ويظهر إزفاء من NF-κB (P65) في نواة بعد التحفيز (R4) في السكان من mDCs غير المعالجة، وحفزت، ودرجة التشابه وسيطة 1.52 في العينة غير المعالجة و 3،01 في العينة حفز (A). الصور الرقمية التي تم جمعها في وقت واحد من السكان خلية غير المعالجة أو حفز R848-إظهار الخلايا ممثل وشدة NF-B translocated إلى نواة الخلية (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

Discussion

الخطوات الحاسمة في استخدام ImageStream للدراسات متعدية هي اختيار مجموعات المقارنة ذات الصلة، والتحسين والتحقق من نوعية الأجسام المضادة. والفروق بين الجماعات موضوع في الهدف المسمى يكون واضحا من خلال رسوم بيانية وصور الخلية. بالاشتراك مع تحليل دقيق للتغيرات في مستقبلات ذ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
Ficoll-Paque زائد	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
لامتصاص العرق (16٪)	علوم المجهر الإلكتروني	15710
دينار بحريني بيرم / اغسل	العلوم البيولوجية دينار بحريني	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	دينار بحريني Pharmingen	68436
كوكتيل النسب 1 (لين 1)، FITC	العلوم البيولوجية دينار بحريني	340546
CD11c-PE	العلوم البيولوجية دينار بحريني	347637
CD123-PE	العلوم البيولوجية دينار بحريني	340545
أرنب المضادة للNF-κB (P65)	سانتا كروز	SC-372
Alexa647 F ('أ ب) 2 الماعز المضادة للأرنب مفتش	إينفيتروجن	A21246
دابي	إينفيتروجن	D21490
ImageStream X	Amnis

خلية نوع	FITC	PE	اليكسا 647	PacBlue
الوحيدات		CD14	NF-κB (P65)
حركة التغيير الديمقراطي	Lin1	CD11c	NF-κB (P65)	CD4
PDC	Lin1	CD123	NF-κB (P65)	CD4