הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Summary

אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream ( Www.amnis.com), המשלבת cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, לכמת המנגנונים התאיים של תאים חיסוניים ראשוניים של קבוצות מוגדרות היטב המטופל. המחקרים שלנו לספק תכנית לחקירות של תרגום לכמת ספציפיים השושלת התגובות הסלולר בדגימות קטנות מקבוצות הנושא.

Abstract

וריאציות אישיות במעמד החיסון לקבוע התגובות זיהום ולתרום חומרת המחלה ואת התוצאה. הזדקנות קשורה לרגישות מוגברת לזיהומים ויראליים וחיידקים וירידה ההיענות לחיסונים עם ירידה מתועד היטב על הלחות כמו גם התא בתיווך החיסונית ^1,2 התגובות. יש לנו העריכו לאחרונה את השפעות ההזדקנות על חיוג כמו קולטנים (TLRs), רכיבים מרכזיים של מערכת החיסון המולדת, כי לזהות זיהום מיקרוביאלי ו מיקרוביאלית טריגר מארח הגנה התגובות ^3. בכל קבוצה גדולה של תורמים אנושיים בריאים, הראינו כי מונוציטים בדם הפריפרי של הקשישים ירדו ביטוי ותפקוד של TLRs מסוימים דומים רמות ⁴ ו TLR מופחת ותגובות איתות תאים דנדריטים (DCS), אנטיגן, הצגת תאים שהם מרכזי הקשר בין חסינות מולד אדפטיבית ^5. הראינו dysregulation של TLR3 ב מקרופאגיםד ייצור נמוך של אינטרפרון על ידי DCS מתורמים קשישים בתגובה לזיהום עם וירוס הנילוס המערבי ^6,7.

Paramount להבנת immunosenescence כדי התערבות טיפולית היא הבנה מפורטת של סוגי תאים מסוימים להגיב מנגנון (ים) של התמרה האות. מחקרים המסורתיים של התגובה החיסונית באמצעות הדמיה של תאים ראשוניים סמנים תא מדידות על ידי FACS או immunoblot קידמו את ההבנה שלנו באופן משמעותי, לעומת זאת, מחקרים אלה מוגבלים בדרך כלל טכנית, על פי היקף המדגם הקטן זמינים חולים וחוסר יכולת לבצע טכניקות מעבדה מורכבות על מספר רב של אדם דגימות. ImageStream משלב cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, ובכך מקלה על החקירה אוכלוסיות תאים מרובים ההתרחשויות ללכוד יעיל של רגישות החולה. כאן אנו מדגימים את השימוש ImageStream ב DCS להעריך TLR7 / 8הפעלת בתיווך עליות זירחון ו טרנסלוקציה הגרעין של גורם שעתוק מפתח, NF-κB, אשר יוזם שעתוק של גנים רבים הם קריטיים עבור המערכת החיסונית ^8. באמצעות טכנולוגיה זו, יש לנו גם הפגינו לאחרונה שינוי מוכרים קודם לכן של TLR5 איתות מסלול NF-κB ב מונוציטים מתורמים מבוגרים שעשוי לתרום התגובה החיסונית להשתנות ההזדקנות ^9.

Protocol

1. בידוד וגירוי של תאים חיסוניים

1. להשיג 10-50 מ"ל דם heparinized ממתנדבים בריאים לאחר הסכמה מדעת בכתב לפי הנחיות הדירקטוריון סקירה מקומית המוסדי. ללימודים של הזדקנות או מחלות, הפתוגנזה הדרה קריטריוני ההכללה של כל מתנדב או המטופל חייב להיקבע במפורש.
2. לבודד את האדם כדוריות דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות צינורות או CPT-Ficoll Paque פלוס על פי הוראות היצרן (GE Healthcare, ניו ג'רזי) וניסויים התנהגות ביום בידוד ⁷ (ריאגנטים, טבלה 1).
3. דגירה PBMCs (3 x 10 ⁶ / גליל) ב 1.5 צינורות מ"ל בינוני 0.6 מ"ל לבד או מגורה עם ligands TLR או סוכנים ההפעלה של אחרים, למשל ליגנד TLR7 / 8 R848 (0.6 מ"ל בינוני פלוס 0.6 μl של 10 mM TLR7 / 8 ליגנד R848, הריכוז הסופי 10 מיקרומטר) על 37 מעלות צלזיוס במשך 10-60 דקות (InvivoGen, CA) ^9.

2. מעבדהeling של תאים

1. תא תווית שושלת וטושים פני אחרים השעיות תא חי באמצעות נוגדנים fluorescently-מצומדות. לייבל 3 x 10 ⁶ PBMCs של 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ב 100 μl של PBS / 2% FBS של צינור 1.5 Eppendorf מ"ל עם קוקטייל של נוגדנים ספציפיים על פני השטח שושלות מונוציטים או DC (טבלה 2). דילולים נוגדנים אופטימליים ניתן לקבוע בניסויים דגימות ראשוניות אמורה להתבצע בקבוצות כדי למזער הרבה-to-הרבה וריאציה. עבור המניות הספק נוגדנים של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​להשתמש 5 μl של נוגדנים (01:20 דילול). השתמש בצינור נפרד של תאים תווית עם הצמוד רק צבע אחד יחיד כדי להגדיר את ערוצי ניאון על המכשיר.
2. לאחר תיוג פני השטח, לתקן תאים 4% PFA / PBS 10 דקות ב RT. לאחסון עד למועד הניתוח, תאים צנטריפוגות ב XG 500 ותאי resuspend במאגר קפוא (90% FBS המכיל 10% DMSO) ב -80 ° C עד היום של assay.
3. במשך התהליך, הערכת קבוצות oפריץ בתאים שלא טופלו ועורר מתוך קבוצה של תורמים יחד כדי לצמצם את השונות. ביום של הניתוח, תאים ההפשרה במהירות 37 ° C אמבט מים, צנטריפוגה ב g 500X להסיר חיץ ההקפאה.
4. כדי permeabilize התאים לצורך זיהוי של ציטוקינים תאיים או סמנים אחרים, השעיות סלולריים resuspend ב 100 חיץ μl BD פרם / Wash (BD Biosciences, NJ). תווית עבור רכיבים איתות תאיים עם למשל, 1:20 דילול של נוגדן ארנבת (p65) נגד NF-κB (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ"ל, SantaCruz ביוטכנולוגיה, קליפורניה) במשך 20 דקות ב RT, צנטריפוגות ב XG 500, aspirate supernatant ו תאים resuspend פרם ב 100 BD μl / לשטוף מאגר המכיל דילול של 1:250 נגד ארנב עז IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) ואת דגירה של 20 דקות ב RT.
5. בסמוך לפני הדמיה, counterstain גרעינים עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / מ"ל, Invitrogen, CA) או יודיד propidium (לצרכן: 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. ImageStream ניתוח

1. לבצע הדמיה של ImageStream על דגימות ליכלכה להפחית שונות בין דגימות אנושיות. הגדרות מכשיר הכוח של לייזרים היו כדלקמן: 200 mW של 488 nm, 10 mW של 658 ננומטר ו 250 מגוואט עבור 405 ננומטר.
2. כדי לנתח את קבצי הנתונים (איור 1), השער הראשון, על אירועים בעוצמה לצרכן רגיל יחס גבוה לצרכן היבט (רוחב: היחס בין גובה) כדי להבחין בין תאים בודדים (R1) מתוך פסולת (נמוך עוצמה PI) או רב תאיים אירועים ( בעוצמה גבוהה לצרכן ואת יחס גובה נמוך). מונוציטים הם בתוך השער של CD14 בתאים חיוביים. mDCs הם בתוך השער של תאים הנמצאים גבוה CD11c נמוך עבור CD4 (R2) נמוך גם לין -1 סמנים (R3).
3. להשתמש ברעיונות תוכנה (Amnis, וושינגטון) כדי לספק מדד כמותי יעיל של מידת ההפעלה של כל תא. לקבוע דמיון (או שיתוף לוקליזציה) של גורם השעתוק NF-κB cytoplasmic עם הגרעין צבע לצרכן לציון טרנסלוקציה לתוך הגרעין (R4). מתאם גבוה של יישובים NF-κB/PIלאספקת בא לידי ביטוי הדמיון ציון גבוה מעיד על מידת ההפעלה ^10.
4. השווה את יחס הדמיון בין קבוצות הטיפול השונות או אוכלוסיות חולים כדי להצביע על יעילות תפקודית יחסית של התאים. לכמת נתונים בין דגימות באמצעות השוואה סטטיסטית של ערכים מוחלטים או ההבדלים לקפל. השתמש בתוכנה רעיונות כדי להציג תמונות של תאים חלקים מרכזיים של היסטוגרמות האוכלוסייה (איור 2).

4. נציג תוצאות

יש לנו לכמת במעברי האותות בתגובה ליגנד מודל ויראלי ידי גירוי PBMCs עם ליגנד TLR7 / 8, R848 (איור 1). אספנו את שתי התמונות לוקליזציה הסלולר וסטטיסטיקות האוכלוסייה בקבוצות של הדוגמה שלנו (איור 2). ImageStream מאפשר לנו תת סלולריים השער ישירות PBMCs תא תגובות תמונה אוכלוסיות תאים סגורות, אבל הרגיל. כאן אנו לכמת את ההשפעה של TLR שלignaling על לוקליזציה הגרעין של NF-κB (p65) ב-Lin1, CD4 עמום, CD11c + מיאלואידית DCS (mDCs). בתחילת המחקר, צפינו אחוז גבוה של תאים unstimulated עם גורם השעתוק NF-κB (p65) בציטופלסמה. לאחר גירוי, תאים שטופלו יש ציון גבוה משמעותית הדמיון של NF-B (p65) עם PI כתם גרעינית, המציין כי NF-κB (p65) translocated לתוך הגרעין לאחר גירוי (עשרות דמיון החציוני הם 1.52 ו 3.01, בהתאמה, איור. 2). תוצאות דומות ציין TLR5 למוצרי מגורה מונוציטים ^9.

באיור 1. מכתים ואסטרטגיה gating לכמת תופעות של גירוי על mDCs אדם. גורם השעתוק NF-κB מסדיר הביטוי של גנים רבים של המערכת החיסונית. המחקר מודד את הלוקליזציה הגרעין של NF-κB (p65) ב mDCs מנושא לנושא נציג לאחר TLR7 / 8 ליגה ND גירוי. ב-להתמקד תאים בודדים זוהו על ידי gating על אירועים חיוביים לצרכן גבוהה היבט ratios גרעיני (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) היו מגודרת ב R3. לוקליזציה הגרעין של NF-κB (p65) הוא להתוות R4. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 2. . טרנסלוקציה של NF-κB ב mDCs לאחר גירוי טרנסלוקציה של NF-κB (p65) לתוך הגרעין לאחר גירוי (R4) מתואר אוכלוסיות של mDCs שלא טופלו ולא מגורה, ציון הדמיון החציוני הוא 1.52 במדגם מטופלים ו 3.01 ב מדגם מגורה (א '). תמונות דיגיטליות שנאספו בו זמנית של אוכלוסיות תאים שלא טופלו או R848-מגורה להראות תאים מייצגים ואת עוצמת NF-B translocated לתוך גרעין התא (ב ')._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Discussion

השלבים הקריטיים השימוש ImageStream ללימודים של תרגום הם הבחירה של קבוצות השוואה רלוונטיות אופטימיזציה ואימות של סגוליות נוגדנים. הבדלים בין קבוצות נושא היעד שכותרתו תהיה ברורה ממבט ראשון באמצעות היסטוגרמות ותמונות סלולריים. בשילוב עם ניתוח מעמיק של שינויים הקולטנים רל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Ficoll-Paque פלוס	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%)	מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים	15710
BD פן / לשטוף	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
קוקטייל השושלת 1 (לין 1), FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
הארנב נגד NF-κB (p65)	SantaCruz	SC-372
Alexa647 F ('א.ב.) 2 עז נגד ארנב IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

סוג התא	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
מונוציטים		CD14	NF-κB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-κB (p65)	CD4
PDC	Lin1	CD123	NF-κB (p65)	CD4