Imagerie quantitative de Lineage spécifiques Toll-like Receptor la signalisation médiée par les monocytes et les cellules dendritiques à partir de petits échantillons de sang humain

Résumé

Nous décrivons l'utilisation de la technologie ImageStream ( Www.amnis.com), Qui combine la cytométrie en flux quantitative simultanée à haute résolution d'imagerie numérique, de quantifier les mécanismes cellulaires de cellules immunitaires primaires de cohortes de patients bien définis. Nos études fournissent un modèle pour les recherches translationnelles de quantifier la lignée spécifiques des réponses cellulaires dans de petits échantillons à partir de cohortes soumises.

Résumé

Les variations individuelles dans l'état immunitaire de déterminer les réponses à l'infection et de contribuer à la gravité des maladies et des résultats. Le vieillissement est associé à une susceptibilité accrue aux infections virales et bactériennes et une diminution de la réactivité aux vaccins avec un déclin bien documenté dans humorale ainsi que ^1,2 à médiation cellulaire réponses immunitaires. Nous avons récemment évalué les effets du vieillissement sur ​​récepteurs Toll-like (TLR), les composants clés du système immunitaire inné qui permettent de détecter l'infection microbienne et de déclenchement des réponses antimicrobiens défense de l'hôte ^3. Dans une large cohorte de donneurs humains sains, nous avons montré que les monocytes du sang périphérique de personnes âgées ont diminué expression et la fonction des TLR ⁴ et certains niveaux similaires TLR réduits et les réponses de signalisation dans les cellules dendritiques (CD), cellules présentatrices d'antigène qui sont déterminant dans le lien entre l'immunité innée et adaptative ^5. Nous avons montré une dérégulation du TLR3 dans les macrophages uned baisse de la production d'IFN par les DC provenant de donneurs âgés en réponse à l'infection par le virus West Nile ^6,7.

Paramount à notre compréhension de immunosénescence et à l'intervention thérapeutique est une compréhension détaillée des types de cellules spécifiques répondant et le mécanisme (s) de la transduction du signal. Les études traditionnelles de réponses immunitaires à travers l'imagerie de cellules primaires et des marqueurs de cellules d'arpentage par FACS ou immunoblot ont fait avancer notre compréhension de manière significative, cependant, ces études sont généralement limitées techniquement par le faible volume d'échantillon disponible pour les patients et l'incapacité de procéder à des techniques de laboratoire complexes sur de multiples échantillons humains. ImageStream combine la cytométrie en flux quantitative simultanée imagerie à haute résolution numérique et facilite ainsi l'enquête dans des populations cellulaires multiples simultanément pour une capture efficace de la susceptibilité du patient. Ici, nous montrent l'utilisation de ImageStream dans les PED afin d'évaluer TLR7 / 8activation à médiation augmentation de la phosphorylation et la translocation nucléaire d'un facteur de transcription clé, NF-kB, qui déclenche la transcription de nombreux gènes qui sont essentiels pour les réponses immunitaires ^8. Grâce à cette technologie, nous avons aussi récemment démontré une altération précédemment non reconnu de TLR5 signalisation et de la voie NF-kB dans les monocytes de donneurs âgés qui peuvent contribuer à la réponse immunitaire altérée au cours du vieillissement ^9.

Protocole

1. L'isolement et la stimulation des cellules immunitaires

1. Obtenir 10-50 ml de sang hépariné des volontaires sains après consentement éclairé écrit en vertu des lignes directrices de l'Institutional Review Board locale. Pour les études de vieillissement ou la maladie de la pathogenèse, l'exclusion et les critères d'inclusion pour chaque volontaire ou le patient doit être explicitement déterminée.
2. Isoler les cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) en utilisant des tubes ou CPT Ficoll-Paque Plus conformément aux instructions du fabricant (GE Healthcare, NJ) et mener des expériences sur le jour de l'isolement ⁷ (réactifs, tableau 1).
3. Incuber PBMC (3 x 10 ⁶ / tube) dans des tubes de 1,5 ml à 0,6 ml de milieu seul ou stimulés par les ligands de TLR ou des agents d'activation d'autres, par exemple le ligand TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de milieu plus 0,6 ul de 10 mM TLR7 / 8 ligand R848, la concentration finale de 10 pM) à 37 ° C pendant 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LaboratoireEling des cellules

1. Lignée cellulaire d'étiquettes et d'autres marqueurs de surface sur les suspensions de cellules vivantes en utilisant des anticorps par fluorescence-conjugués. Label 3 x 10 ⁶ PBMC pendant 20 min à 4 ° C dans 100 ul de PBS / 2% SVF dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec un cocktail d'anticorps spécifiques de surface pour les lignées de monocytes ou DC (tableau 2). Dilutions d'anticorps optimales peuvent être déterminées dans des expériences préliminaires et les échantillons doivent être traités par lots pour réduire lot à lot de variation. Pour le stock d'anticorps vendeur de 0,1 mg / ml utiliser 5 pi d'anticorps (dilution 1:20). Utilisez un tube séparé de cellules marquées avec un seul conjugué seule couleur pour mettre en place les canaux de fluorescence sur l'instrument.
2. Après marquage de surface, fixer les cellules dans 4% PFA / PBS pendant 10 min à température ambiante. Pour le stockage jusqu'à ce moment de l'analyse, les cellules centrifuger à 500 xg et remettre les cellules dans un tampon de gel (90% de FBS contenant 10% de DMSO) à -80 ° C jusqu'à ce que le jour de test.
3. Pour l'évaluation, le processus de lots of cellules non traitées et stimulé à partir d'un groupe de bailleurs de fonds ainsi que pour minimiser la variabilité. Le jour de l'analyse, les cellules dégel rapidement à 37 ° C bain-marie, centrifugeuse à g 500x à éliminer le tampon de congélation.
4. Pour perméabiliser les cellules pour la détection des cytokines intracellulaires ou d'autres marqueurs, les suspensions cellulaires remettre en suspension dans 100 BD Perm / Wash pi de tampon (BD Biosciences, NJ). Label pour intracellulaires de signalisation avec des composants par exemple, dilution 1:20 de lapin anti-NF-kB (p65) antibody (concentration finale de 10 pg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) pendant 20 min à température ambiante, centrifuger à 500 xg, Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 100 ul Perm BD / tampon de lavage contenant de dilution 1:250 de chèvre anti-IgG de lapin-Alexa647 (Invitrogen, CA) et incuber pendant 20 min à température ambiante.
5. Immédiatement avant l'imagerie, recolorer noyaux au DAPI (0,2 pg / ml, Invitrogen, CA) ou l'iodure de propidium (PI, 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. Analyse ImageStream

1. Mener l'imagerie par ImageStream sur des échantillons dosés à réduire la variabilité entre les échantillons humains. Réglages de l'instrument pour pouvoir les lasers étaient comme suit: 200 mW pour 488 nm, 10 mW pour 658 nm et 250 MW pour 405 nm.
2. Pour analyser les fichiers de données (figure 1), d'abord, porte sur les événements avec une intensité normale et élevée PI ratio d'aspect PI (largeur: hauteur) pour distinguer les cellules simples (R1) à partir de débris (de faible intensité PI) ou multi-cellulaires des événements ( haute intensité PI et un ratio faible). Les monocytes sont dans une grille pour CD14 des cellules positives. PID sont dans une grille de cellules qui sont élevés pour CD11c et faible pour CD4 (R2) et également faible pour Lin-1 marqueurs (R3).
3. Utilisez le logiciel IDEAS (Amnis, WA) pour fournir une mesure efficace quantitative du degré d'activation de chaque cellule. Déterminer similitude (ou co-localisation) du facteur de transcription NF-kB cytoplasmique avec des armes nucléaires colorant PI pour indiquer la translocation dans le noyau (R4). Une forte corrélation entre NF-κB/PI localisation se traduit par un score de similarité élevé et indique le degré d'activation ^10.
4. Comparer les ratios de similitude entre les différents groupes de traitement ou de populations de patients d'indiquer par rapport efficacité fonctionnelle des cellules. Quantifier des données entre les échantillons grâce à la comparaison statistique des valeurs absolues ou des différences de pliage. Utilisez un logiciel IDEAS pour afficher des images de cellules à partir de segments clés de la population histogrammes (Fig. 2).

4. Les résultats représentatifs

Nous avons quantifié les voies de signalisation en réponse à un ligand modèle viral en stimulant les PBMC avec le ligand TLR7 / 8, R848 (Fig. 1). Nous avons recueilli les deux images de localisation cellulaire et statistiques sur la population dans nos groupes de l'échantillon (Fig. 2). ImageStream nous permet de sous-ensembles de cellules de grille directement à partir de PBMC et les réponses de cellules d'image à partir de populations de cellules gated, mais non triés. Ici, nous avons quantifié l'effet de TLR signaling sur la localisation nucléaire de NF-kB (p65) dans Lin1-, CD4 faible, CD11c + myéloïde PED (MDC). Au départ, nous avons observé un pourcentage élevé de cellules non stimulées avec le facteur de transcription NF-kB (p65) dans le cytoplasme. Après la stimulation, les cellules traitées ont un score significativement plus élevé de similitude NF-B (p65) avec PI colorant nucléaire, indiquant que le NF-kB (p65) transloqué dans le noyau après stimulation (scores de similarité médianes sont 1,52 et 3,01, respectivement, Fig. 2). Des résultats similaires sont notés dans TLR5 des monocytes stimulés ^9.

Figure 1. Coloration et de la stratégie d'ouverture de porte pour quantifier les effets de la stimulation sur MDC de l'homme. Le facteur de transcription NF-kB régule l'expression de nombreux gènes du système immunitaire. Cette étude mesure la localisation nucléaire de NF-kB (p65) dans MDC d'un sujet représentant après TLR7 / 8 liga la stimulation ème. De mise au point des cellules individuelles ont été identifiés par le déclenchement PI événements positifs avec des ratios élevés de l'aspect nucléaire (R1). MDC (Lin1-, CD4dim, CD11c +) étaient fermée dans R3. La localisation nucléaire de NF-kB (p65) est tracée sur la R4. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. . La translocation de NF-kB dans les pays plus développés après la stimulation de la translocation de NF-kB (p65) dans le noyau après stimulation (R4) est représenté dans les populations de MDC non traités et stimulé; le score de similarité médiane est de 1,52 dans l'échantillon non traité et 3,01 en l'échantillon stimulée (A). Les images numériques collectées simultanément sur les populations de cellules non traitées ou R848-stimulé montrent des cellules représentatives et l'intensité de la norme NF-B transloqué dans le noyau de la cellule (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Discussion

Les étapes essentielles de l'utilisation de ImageStream pour les études translationnelles sont la sélection des groupes de comparaison appropriés et l'optimisation et la validation de la spécificité des anticorps. Les différences entre les groupes de sujets dans la cible marqué sera évidente par le biais des histogrammes et des images de cellules. En combinaison avec une analyse approfondie de l'évolution des récepteurs concernés et les voies de signalisation, ces données fourniront des renseign...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldéhyde (16%)	Sciences Electron Microscopy	15710
BD Perm / Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
1 cocktail de Lineage (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
de lapin anti-NF-kB (p65)	Santacruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 de chèvre anti-IgG de lapin	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
X ImageStream	Amnis

Type de cellule	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monocyte		CD14	NF-kB (p65)
mDC	Lin1	CD11c	NF-kB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-kB (p65)	CD4