ヒト血液の小さなサンプルから単球および樹状細胞のlineage特異的Toll様受容体を介するシグナル伝達の定量的イメージング

要約

我々は（のImageStream技術の使用を記述する www.amnis.com）、これは明確に定義された患者のコホートからの主な免疫細胞の細胞メカニズムを定量化するために、同時高解像度のデジタル画像で定量的なフローサイトメトリーを組み合わせたものです。我々の研究は、対象のコホートから少量のサンプルで系統特異的な細胞応答を定量化するためのトランスレーショナル研究のための青写真を提供しています。

要約

免疫状態の個々の変動が感染症への対応を決定し、疾患の重症度および予後に貢献しています。エージングは、ウイルスおよび細菌感染症に対する感受性の上昇と関連付けられ、体液によく文書化減少と同様に細胞性免疫応答の^1,2のワクチンに反応性を減少させる。我々は最近、Toll様受容体（TLR）は、微生物感染およびトリガ抗菌宿主の防御応答^3を検出する自然免疫系の主要なコンポーネントでエージングの効果を評価しています。健康な人間のドナーの大規模コホートでは、我々は、高齢者の末梢血単球は、抗原提示において重要であるセルを特定のTLRは⁴と同様の削減TLRレベルと樹状細胞のシグナル伝達応答（DCS）の発現と機能が低下している示した自然免疫と獲得免疫の⁵との間のリンケージ。我々は、マクロファージではTLR3の調節不全を示しているウエストナイルウイルス^6,7の感染に応答して、高齢者ドナーからの樹状細胞によるIFNのd低い生産。

免疫老化の我々の理解および治療的介入へのパラマウントは、特定の細胞応答の種類とシグナル伝達の機構（s）の詳細な理解です。 FACSまたはイムノブロットによって初代培養細胞や測量細胞マーカーのイメージングを介して免疫応答の従来の研究では、しかしながら、これらの研究は一般の患者から入手可能な少量のサンプル量と複数の複雑な実験技術を実施することができないことに技術的に制限され、大幅に我々の理解を進めてきたヒトサンプル。のImageStreamは、同時高解像度のデジタル画像の定量的なフローサイトメトリーを組み合わせたため、患者の感受性の効率的な捕獲のための同時期に複数の細胞集団の調査を容易にします。ここでは、TLR7 / 8を評価するために、樹状細胞でのImageStreamの使用方法を示していますリン酸化と免疫応答⁸の重要な多数の遺伝子の転写を開始する重要な転写因子、NF-κBの核移行の活性化を介する増加します。この技術を用いて、我々はまた、最近では⁹高齢化で変更された免疫応答性に貢献するかもしれない古いドナーから単球におけるTLR5シグナリングとNF-κB経路の以前に認識されていない変化を示している。

プロトコル

1。免疫細胞の単離と刺激

1. 地元の施設内倫理委員会のガイドラインの下で書かれたインフォームドコンセントの後に健康なボランティアから10〜50ミリリットルヘパリン添加血液を取得します。老化や病気の病因の研究については、各ボランティアや患者のための排除と選択基準は明示的に決定する必要があります。
2. ヒト末梢血単核細胞（PBMC）CPT管またはをFicoll-Paque Plusを使用し、製造元の指示に従って（GEヘルスケア、NJ）分離し、分離⁷日（試薬、 表1）の実験を実施しています。
3. インキュベートしたPBMC（3×10 ⁶ /チューブ）を単独で0.6mlの培地に1.5 mlチューブまたはTLRリガンドまたは他の活性剤、例えばで刺激TLR7 / 8リガンドR848（0.6 mlの培地を加えた10mMのTLR7 / 8リガンドの0.6μL 10〜60分（InvivoGen、カリフォルニア州^）9の37℃でR848、最終濃度10μM）を。

2。研究室セルのeling

1. ラベルの細胞系譜と蛍光標識抗体を用いて生細胞懸濁液の他の表面マーカー。ラベル3×10 4で20分⁶ PBMCを°単球またはDC系統（ 表2）比表面積抗体のカクテルと1.5mlのエッペンドルフチューブにPBS / 2％FBSを100μlのC。最適な抗体の希釈は、ロット間のばらつきを最小限に抑えるためにバッチで処理する必要があり、予備実験やサンプルで決定することができます。ベンダーの抗体を0.1 mg / mlの株は、抗体5μlの（1:20希釈）を使用します。楽器の蛍光チャネルを設定するだけで一つのカラーコンジュゲートで標識した細胞の別々のチューブを使用しています。
2. 表面標識した後、室温で10分間、4％PFA / PBSで細胞を固定します。ストレージの分析の時まで、検定の日まで-80℃で凍結バッファで500×gで再懸濁した細胞（90％FBSはDMSOの10％を含む）°Cで遠心し細胞。
3. アセスメント、プロセスバッチoのfのばらつきを最小限に抑えるために一緒にドナーのグループからの未処理と刺激した細胞。分析の日に、融解細胞をすばやく37℃の水浴、凍結バッファを削除する500分の1 gで遠心する。
4. 100μlのBDパーマ/ Wash Bufferで（BD Biosciences社、NJ）で、細胞内のサイトカインや他のマーカーの検出のために再懸濁し、細胞懸濁液を、細胞を透過します。例の細胞内シグナル伝達コンポーネントのラベルを、RTで20分間ウサギ抗NF-κB（p65の）抗体（最終濃度10μg/ mlで、サンタクルーズバイオテクノロジー、CA）の1:20希釈、500 xgで遠心し、上清を吸引し、 100μlのBDパーマに再懸濁した細胞は、/ヤギ​​抗ウサギIgG-Alexa647（Invitrogen社、カリフォルニア州）の1:250希釈を含むバッファを洗浄し、室温で20分間インキュベートします。
5. イメージングの直前に、DAPI（0.2μg/ mlで、Invitrogen社、CA）またはヨウ化プロピジウム（、20 ng / mlで、Invitrogen社、CA PI）で核を対比染色。

3。のImageStream分析

1. 人間のサンプル間のばらつきを低減するためにバッチ処理されたサンプルでのImageStreamでイメージングを行っています。 488 nmの、658 nmと405 nmでの250 mWで10 mWの200 mWを次のようにレーザーの電源の機器の設定であった。
2. データファイル（ 図1）を分析するには、通常のPI強度と高いPIのアスペクト比（幅：高さ比）のイベントの最初のゲートは、単一の破片の細胞（R1）（低PI強度）または多細胞イベント（区別するために高いPI強度と低アスペクト比）。単球はCD14陽性細胞のゲート内にあります。 MDCはLIN-1マーカー（R3）のCD11cは、低CD4（R2）のために、また、低い高である細胞のゲート内にあります。
3. 各細胞の活性化の程度の効果的な定量的尺度を提供するためにIDEASソフトウェア（Amnis、WA）を使用します。核への移行を示すために、核の色素PI（R4）と細胞質の転写因子NF-κBの類似性（あるいは共局在）を決定します。 NF-κB/PIlocaliの高い相関zationは高い類似度スコアに反映され、アクティベーション¹⁰の程度を示しています。
4. 細胞の相対的な機能の効率性を示すために、異なる治療群または患者集団間の類似性の比を比較する。絶対値または倍の差の統計的比較によりサンプル間でデータを定量化する。人口ヒストグラムのキーセグメント（ 図2）からの細胞の画像を表示するためのアイデアソフトウェアを使用します。

4。代表的な結果

我々は、TLR7 / 8リガンド、R848（ 図1）PBMCを刺激することにより、モデルウイルスのリガンドに応答してシグナル伝達経路を定量化しています。我々は、サンプルのグループ（ 図2）細胞内局在の画像や人口統計の両方を収集しました。のImageStreamは、末梢血単核球とイメージ細胞応答ゲートからではなく、ソートされていない細胞集団から直接ゲート細胞サブセットに私たちをことができます。ここでは、TLRの効果を定量-LIN1でNF-κBの核局在化（P65）にignaling CD11cは、薄暗いCD4 +骨髄系樹状細胞（MDC）が。ベースライン時、我々は細胞質内転写因子NF-κB（p65の）を持つ非刺激細胞の割合が高いを観察した。刺激した後、処理した細胞は、NF-κB（p65の（）の中央値の類似度スコアは、それぞれ1.52と3.01であり、 図刺激後に核内へ移行することを示し、核染色PIとNF-Bの有意に高い類似性スコア（P65）を持っています。 2）。同様の結果がTLR5刺激単球⁹に記載されています。

図1。染色と人間の樹状に刺激の効果を定量化するためのゲーティング戦略 。 NF-κB転写因子は、数多くの免疫系遺伝子の発現を調節する。本研究では、TLR7 / 8リーガ後の代表的な一主題から樹状にお​​けるNF-κB（p65の）の核局在化を測定する ND刺激。合焦単一細胞は、高い核のアスペクト比（R1）とPI陽性のイベントにゲーティングによって同定した。 MDCは（LIN1-、CD4dimは、CD11c +）R3のゲートであった。 NF-κB（p65の）の核局在化はR4にプロットされます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。 。刺激後の樹状におけるNF-κBの移行 NF-κB（p65の）の転座核への刺激後（R4）が未処理と刺激樹状の集団に描かれている中央値の類似性のスコアは、未処理サンプルでは1.52および3.01です。刺激されたサンプル（A）。未処理またはR848刺激の細胞集団を同時に収集したデジタル画像は代表的な細胞や細胞核（B）に転NF-Bの強度を示しています。_upload/3741/3741fig2large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

トランスレーショナル研究のためのImageStreamの使用における重要なステップは、関連する比較グループと抗体特異性の最適化と検証の選択です。標識した標的の対象群間の差は、ヒストグラムとセル画像を介して容易に明らかになるであろう。関連する受容体とシグナル伝達経路の変化の徹底的な分析と組み合わせることで、これらのデータは、専門的なコホートで免疫不全の根底にあるメ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
をFicoll-Paqueプラス	GEヘルスケア	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
パラホルムアルデヒド（16％）	電子顕微鏡学	15710
BDはペルミ/洗浄	BDバイオサイエンス	554723
CD14-PE	ベイバイオサイエンス	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen社	68436
リネージュカクテル1（LIN 1）-FITC	BDバイオサイエンス	340546
CD11cは-PE	BDバイオサイエンス	347637
CD123-PE	BDバイオサイエンス	340545
ウサギ抗NF-κB（p65の）	サンタクルス	SC-372
Alexa647のF（ab '）2ヤギ抗ウサギIgG	インビトロジェン	A21246
DAPI	インビトロジェン	D21490
のImageStream X	Amnis

細胞型	FITC	PE	アレクサ647	PacBlue
単球		CD14	NF-κB（p65の）
MDC	LIN1	CD11cは	NF-κB（p65の）	CD4
pDCで	LIN1	CD123	NF-κB（p65の）	CD4