Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Resumo

Descrevemos uso da tecnologia de ImageStream ( Www.amnis.com), Que combina a citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital, para quantificar os mecanismos celulares primárias de células imunes de coortes bem definidas do paciente. Nossos estudos fornecem um modelo para investigações de translação para quantificar linhagem específica respostas celulares em pequenas amostras de coortes de indivíduos.

Resumo

As variações individuais no estado imunitário determinar as respostas à infecção e contribuir para a gravidade da doença eo resultado. O envelhecimento está associado com um aumento da susceptibilidade a infecções virais e bacterianas e diminuiu a capacidade de resposta para vacinas com um declínio bem documentado na humoral assim como mediada por células ^1,2 respostas imunes. Recentemente, avaliou os efeitos do envelhecimento sobre receptores Toll-like (TLRs), os principais componentes do sistema imune inato que detectar a infecção microbiana e desencadear respostas de acolhimento de defesa antimicrobianos ^3. Em uma grande coorte de doadores humanos saudáveis, nós mostramos que os monócitos do sangue periférico de idosos têm diminuição da expressão e função de determinados TLRs ⁴ e semelhantes níveis reduzidos TLR e respostas de sinalização em células dendríticas (DCs), células apresentadoras de antígeno que são fundamentais na a ligação entre a imunidade inata e adaptativa ^5. Nós mostramos desregulação do TLR3 em macrófagos umad menor produção de IFN por DCs de doadores idosos em resposta à infecção com o vírus do Nilo Ocidental ^6,7.

Primordial para nossa compreensão da imunossenescência e à intervenção terapêutica é um entendimento detalhado dos tipos de células específicos em resposta e do mecanismo (s) de transdução de sinal. Estudos tradicionais de respostas imunes através de imagens de pilhas e marcadores de células de levantamento por FACS ou immunoblot têm avançado significativamente a nossa compreensão, no entanto, estes estudos são geralmente limitados tecnicamente pelo pequeno volume de amostra disponível a partir de pacientes e da incapacidade de realizar técnicas laboratoriais complexas em vários amostras humanas. ImageStream combina citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital e, assim, facilita investigação em populações de células múltiplas contemporaneamente para uma captura eficiente do susceptibilidade do paciente. Aqui temos demonstram o uso de ImageStream em DCs para avaliar TLR7 / 8activação mediada-aumentos na fosforilação e translocação nuclear de um factor de transcrição de chave, NF-kB, a qual inicia a transcrição de numerosos genes que são críticas para as respostas imunes ^8. Usando esta tecnologia, temos também demonstrou recentemente uma alteração previamente não reconhecido de TLR5 sinalização e na via de NF-kB em monócitos de doadores mais velhos que possam contribuir para a resposta imune alterada no envelhecimento ^9.

Protocolo

1. Isolamento e Estimulação de células imunes

1. Obter 10-50 ml de sangue heparinizado de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado por escrito sob as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional locais. Para estudos de envelhecimento ou a doença de exclusão, patogênese e os critérios de inclusão para cada voluntário ou paciente deve ser explicitamente determinada.
2. Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), utilizando tubos de CPT ou Ficoll-Paque Plus acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, NJ) e as experiências de conduta no dia do isolamento ⁷ (Reagentes, Tabela 1).
3. Incubar PBMCs (3 x 10 ⁶ / tubo) em tubos de 1,5 ml em 0,6 ml de meio por si só ou estimuladas com ligandos TLR ou outros agentes de activação, por exemplo, o ligando TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de meio mais 0,6 uL de 10 mM TLR7 / 8 ligando R848 concentração final, 10 uM) a 37 ° C durante 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LabEling de Células

1. Linhagem celular rótulo e outros marcadores de superfície sobre a suspensão de células vivas utilizando anticorpos fluorescente-conjugados. Etiqueta 3 x 10 ⁶ PBMCs de 20 min a 4 ° C em 100 ul de PBS / 2% de FBS em um tubo Eppendorf de 1,5 ml com um cocktail de anticorpos específicos da superfície para linhagens de monócitos ou DC (Tabela 2). Diluições de anticorpos óptimo pode ser determinado em experiências preliminares e as amostras devem ser processado em lotes para minimizar de lote para lote-variação. Para o estoque fornecedor de anticorpo de 0,1 mg / ml utilizar 5 uL de anticorpo (diluição 1:20). Use um tubo separado de células marcadas com apenas um conjugado de cor única para definir os canais fluorescentes no instrumento.
2. Após a marcação de superfície, fixar as células em 4% PFA / PBS durante 10 min à TA. Para armazenamento até ao momento da análise, as células de centrifugação a 500 xg e Ressuspender as células em tampão de congelação (90% de FBS contendo DMSO a 10%) a -80 ° C até que o dia do ensaio.
3. Para avaliação, processo de lotes of células não tratadas e estimuladas a partir de um grupo de dadores em conjunto para minimizar a variabilidade. No dia da análise, as células descongelamento rapidamente em 37 ° C banho de água, de centrifugação a 500 xg para remover o tampão de congelação.
4. Para permeabilizar as células para a detecção de citocinas intracelulares ou outros marcadores, suspensões de células Ressuspenda em 100 uL de tampão BD Perm / Wash (BD Biosciences, NJ). Rótulo para intracelulares componentes de sinalização com, por exemplo, diluição 1:20 de coelho anti-NF-kB anticorpo (p65) (concentração final 10 ug / ml, Santacruz Biotechnology, CA) durante 20 min a RT, de centrifugação a 500 xg, o sobrenadante aspirado e Ressuspender as células em 100 uL Perm BD / Tampão de lavagem contendo 1:250 de diluição de cabra anti-IgG de coelho-Alexa647 (Invitrogen, CA) e incubar durante 20 min à TA.
5. Imediatamente antes de imagiologia, contracoloração núcleos com DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) ou iodeto de propídio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. Análise ImageStream

1. Conduzir imagem por ImageStream em amostras de lote para reduzir a variabilidade entre amostras humanas. As definições do aparelho para alimentação dos lasers eram como se segue: 200 mW para 488 nm, 10 mW para 658 nm e 250 mW para 405 nm.
2. Para analisar os arquivos de dados (Fig. 1), em primeiro lugar, portão em eventos com intensidade PI normal e alta relação de aspecto PI (largura: relação da altura) para distinguir células individuais (R1) de detritos (PI intensidade baixa) ou multi-celulares (eventos PI intensidade alta e baixa relação de aspecto). Os monócitos são dentro de um portão de células CD14 positivas. mDCs estão dentro de uma porta para as células que são altos para CD11c e de baixo para CD4 (R2) e também para baixo Lin-1 marcadores (R3).
3. Use IDEAS software (Amnis, WA) para fornecer uma medida eficaz quantitativa do grau de activação de cada célula. Determinar semelhança (ou co-localização) do factor de transcrição NF-kB citoplasmática com corante nuclear PI para indicar translocação para o núcleo (R4). A alta correlação de NF-κB/PI localização reflecte-se numa pontuação de semelhança elevado e indica o grau de activação ^10.
4. Comparar os índices de similaridade entre os grupos de tratamento diferentes ou populações de doentes para indicar a eficiência relativa funcional das células. Quantificar os dados entre as amostras através da comparação estatística dos valores absolutos ou diferenças de dobra. Use software IDEAS para exibir imagens de células a partir de segmentos de chaves de histogramas da população (Fig. 2).

4. Os resultados representativos

Temos quantificada vias de sinalização em resposta a um ligando modelo viral, estimulando PBMC com o ligando TLR7 / 8, R848 (Fig. 1). Foram coletadas duas imagens de localização celular e estatísticas populacionais em grupos de nossa amostra (Fig. 2). ImageStream nos permite subpopulações de células porta diretamente de PBMCs e respostas celulares de imagem de populações de células fechadas, mas não classificado. Aqui nós quantificamos o efeito de TLR signaling na localização nuclear do NF-kB (p65) em Lin1, CD4 dim, CD11c + mielóide DCs (mDCs). Na linha de base, observou-se uma percentagem elevada de células não estimuladas com o factor de transcrição NF-kB (p65) no citoplasma. Após a estimulação, as células tratadas têm uma pontuação de semelhança significativamente maior de NF-B (p65) com PI mancha nuclear, indicando que o NF-kB (p65) translocado para o núcleo, após a estimulação (pontuações de similaridade mediana são 1,52 e 3,01, respectivamente, a fig. 2). Resultados semelhantes são observados nas TLR5 monócitos estimulados ^9.

Figura 1. Coloração e Estratégia Gating para quantificar os efeitos da estimulação em mDCs humanos. O factor de transcrição NF-kB regula a expressão de numerosos genes do sistema imunológico. Este estudo mede a localização nuclear de NF-kB (p65) em mDCs de um sujeito representativo após TLR7 / 8 liga estimulação nd. Em foco células individuais foram identificados pela passagem no PI eventos positivos, com altas proporções nucleares (R1). mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) foram fechado em R3. Localização nuclear do NF-kB (p65) é representada em R4. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. . Translocação de NF-kB em mDCs após a estimulação A translocação de NF-kB (p65) para dentro do núcleo após a estimulação (R4) é descrito em populações de mDCs não tratadas e estimuladas; a pontuação de semelhança mediana é 1,52 na amostra não tratada e 3,01 em a amostra estimulado (A). As imagens digitais colhidas simultaneamente das populações de células não tratadas ou R848-estimulado mostram as células representativas e da intensidade do NF-B translocado para o núcleo da célula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

Discussão

Os passos críticos no uso de ImageStream para estudos translacionais são a seleção de grupos de comparação relevantes e otimização e validação da especificidade do anticorpo. As diferenças entre os grupos de indivíduos no alvo marcada serão facilmente aparentes através de histogramas e imagens de células. Em combinação com uma análise aprofundada das alterações nos receptores e vias de sinalização relevantes, estes dados fornecerá informações valiosas sobre os mecanismos que estão subjacentes a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldeído (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
BD Perm / Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Cocktail Lineage 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
de coelho anti-NF-kB (p65)	Santacruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 de cabra anti-IgG de coelho	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Tipo de célula	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monócitos		CD14	NF-kB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-kB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-kB (p65)	CD4