Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

Riepilogo

Descriviamo l'uso della tecnologia ImageStream ( Www.amnis.com), Che combina quantitative citometria di flusso con simultanea alta risoluzione digital imaging, per quantificare i meccanismi cellulari di cellule immunitarie primarie da ben definiti coorti di pazienti. I nostri studi forniscono un modello per le indagini traslazionali quantificare lignaggio risposte specifiche cellulari a piccoli campioni di coorti di soggetti.

Abstract

Variazioni individuali nel determinare le risposte stato immunitario alle infezioni e contribuire alla gravità della malattia e il risultato. L'invecchiamento è associato ad un aumento della suscettibilità alle infezioni virali e batteriche e diminuita capacità di risposta ai vaccini con un ben documentato calo umorale e cellulo-mediata ^1,2 immune risposte. Abbiamo recentemente valutato gli effetti dell'invecchiamento sulla recettori Toll-like (TLR), componenti chiave del sistema immunitario innato che rilevano l'infezione microbica e di trigger antimicrobici risposte di difesa dell'ospite ^3. In un'ampia coorte di donatori umani sani, abbiamo dimostrato che i monociti di sangue periferico di pazienti anziani hanno una ridotta espressione e la funzione di alcuni TLR ⁴ e simili livelli di TLR ridotti e le risposte di segnalazione nelle cellule dendritiche (DC), cellule presentanti l'antigene che sono fondamentale nella il collegamento tra immunità innata e adattativa ^5. Abbiamo dimostrato di disregolazione TLR3 nei macrofagi unod minore produzione di IFN da parte di DCS donatori anziani in risposta ad infezione da West Nile virus ^6,7.

Paramount alla nostra comprensione del immunosenescenza e di intervento terapeutico è una comprensione dettagliata di specifici tipi cellulari che rispondono e il meccanismo di (s) di trasduzione del segnale. Gli studi tradizionali di risposte immunitarie, attraverso l'imaging di cellule primarie e marcatori cellulari di rilevamento di FACS o immunoblot hanno avanzato la nostra comprensione significativo, tuttavia, questi studi sono generalmente limitati tecnicamente dal volume piccolo campione a disposizione di pazienti e l'incapacità di condurre complesse tecniche di laboratorio su più campioni umani. ImageStream combina citometria a flusso con quantitativa simultanea digitale ad alta risoluzione di immagini e quindi facilita indagine in popolazioni di cellule multiple contemporaneamente per una acquisizione efficace della sensibilità del paziente. Qui si dimostra l'uso di ImageStream nei PVS per valutare TLR7 / 8attivazione-mediate aumento nella fosforilazione e traslocazione nucleare di un fattore di trascrizione chiave, NF-KB, che inizia la trascrizione di numerosi geni che sono critici per le risposte immunitarie ^8. Grazie a questa tecnologia, abbiamo anche recentemente dimostrato una alterazione precedentemente non TLR5 di segnalazione e il pathway NF-kB nei monociti da donatori anziani, che possono contribuire a una risposta immunitaria alterata nell'invecchiamento ^9.

Protocollo

1. L'isolamento e la stimolazione delle cellule immunitarie

1. Ottenere 10-50 ml di sangue eparinizzato da volontari sani, dopo consenso informato scritto in base alle direttive del consiglio locale Institutional Review. Per gli studi di invecchiamento o di malattia patogenesi, criteri di esclusione e di inclusione per ciascun volontario o il paziente deve essere esplicitamente determinato.
2. Isolate cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che utilizzano tubi o CPT Ficoll-Paque Inoltre secondo le istruzioni del produttore (GE Healthcare, NJ) e condurre esperimenti nel giorno di isolamento ⁷ (reagenti, Tabella 1).
3. Incubare PBMC (3 x 10 ⁶ / provetta) in provette da 1,5 ml a 0,6 ml di mezzo da solo o stimolate con ligandi TLR o agenti attivanti, quali per esempio la TLR7 / 8 ligando R848 (0,6 ml di terreno più 0,6 microlitri di 10 mM TLR7 / 8 ligando R848, concentrazione finale 10 uM) a 37 ° C per 10-60 minuti (InvivoGen, CA) ^9.

2. LaboratorioEling delle cellule

1. Etichetta linea cellulare e altri marcatori di superficie sulle sospensioni di cellule in vivo utilizzando anticorpi coniugati fluorescenza. Etichetta 3 x 10 ⁶ PBMC per 20 min a 4 ° C in 100 pl di PBS / 2% FBS in una provetta Eppendorf da 1,5 ml con un cocktail di anticorpi specifici di superficie per lignaggi monociti o DC (Tabella 2). Diluizioni ottimali di anticorpo può essere determinata in esperimenti preliminari ei campioni devono essere trattati in lotti per ridurre al minimo da lotto a lotto variazione. Per magazzino anticorpi fornitore di 0,1 mg / ml utilizzare 5 microlitri di anticorpo (diluizione 1:20). Utilizzare un tubo separato di cellule marcate con un solo coniugato singolo colore per impostare i canali fluorescenti sullo strumento.
2. Dopo l'etichettatura di superficie, fissare le cellule in 4% PFA / PBS per 10 min a RT. Per la conservazione fino al momento dell'analisi, cellule centrifugare a 500 xg e risospendere le cellule in tampone di congelamento (90% FBS contenente il 10% DMSO) a -80 ° C fino al giorno di dosaggio.
3. Per la valutazione, il processo batch of cellule non trattate e stimolato da un gruppo di donatori insieme per minimizzare la variabilità. Il giorno di analisi, cellule scongelamento rapidamente a 37 ° C bagnomaria, centrifugare a 500x g per rimuovere buffer di congelamento.
4. Per permeabile celle per il rilevamento di citochine intracellulari o altri indicatori, le sospensioni cellulari risospendere in 100 pl BD Perm / tampone di lavaggio (BD Biosciences, NJ). Etichetta per i componenti di segnalazione intracellulare con ad esempio, 1:20 diluizione di coniglio anti-NF-kB (p65) di anticorpi (concentrazione finale 10 pg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) per 20 minuti a RT, centrifugare a 500 xg, Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 Perm BD pl / Tampone di lavaggio contenenti la diluizione 1:250 di capra anti-IgG di coniglio-Alexa647 (Invitrogen, CA) e incubare per 20 minuti a RT.
5. Immediatamente prima di imaging, di contrasto nuclei con DAPI (0,2 pg / ml, Invitrogen, CA) o ioduro di propidio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. Analisi ImageStream

1. Condurre imaging ImageStream su campioni in batch per ridurre la variabilità tra i campioni umani. Impostazioni dello strumento di potenza del laser sono state le seguenti: 200 mW per 488 nm, 10 mW per 658 nm e 250 mW per 405 nm.
2. Per analizzare i file di dati (Fig. 1), in primo luogo, Porta a eventi con intensità PI normale e alto rapporto di aspetto PI (larghezza: rapporto di altezza) per distinguere le singole cellule (R1) da detriti (bassa intensità PI) o multi-cellulari (eventi PI alta intensità e basso rapporto d'aspetto). I monociti sono all'interno di un cancello per CD14 cellule positive. MDC sono all'interno di un cancello per cellule che sono alta e bassa per CD11c per CD4 (R2) e bassa anche per Lin-1 marcatori (R3).
3. Utilizzare IDEE software (Amnis, WA) per fornire una misura efficace quantitativa del grado di attivazione di ciascuna cella. Determinare la similarità (o co-localizzazione) del fattore di trascrizione NF-kB citoplasmatico nucleare con colorante PI per indicare traslocazione nel nucleo (R4). Una correlazione elevata NF-κB/PI Localizazione si riflette in un punteggio di somiglianza elevata e indica il grado di attivazione ^10.
4. Confronta i rapporti di somiglianza tra i diversi gruppi di trattamento o popolazioni di pazienti per indicare relativa efficienza funzionale delle cellule. Quantificare i dati tra i campioni attraverso il confronto statistico dei valori assoluti o differenze piega. Utilizzare il software IDEAS per visualizzare le immagini di cellule provenienti da segmenti chiave di istogrammi della popolazione (Fig. 2).

4. Risultati rappresentativi

Abbiamo quantificato pathway del segnale in risposta ad un ligando modello virale stimolando PBMC con il TLR7 / 8 ligando, R848 (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia le immagini di localizzazione cellulare e statistiche della popolazione nei nostri gruppi del campione (Fig. 2). ImageStream ci permette di sottoinsiemi di cellule cancello direttamente da PBMC e le risposte cellulari immagini da popolazioni di cellule chiuse, ma non differenziati. Qui abbiamo quantificato l'effetto di TLR signaling sulla localizzazione nucleare di NF-kB (p65) in Lin1-, CD4 dim, CD11c + DC mieloidi (MDC). Al basale, abbiamo osservato una percentuale elevata di cellule non stimolate con il fattore di trascrizione NF-kB (p65) nel citoplasma. Dopo la stimolazione, le cellule trattate hanno un punteggio di somiglianza significativamente più alta di NF-B (p65) con nucleare PI macchia, indicando che NF-kB (p65) traslocata nel nucleo dopo stimolazione (punteggio di somiglianza medi sono 1,52 e 3,01, rispettivamente, fig. 2). Risultati simili sono noti in TLR5 monociti stimolati ^9.

Figura 1. La colorazione e la strategia di gating per quantificare gli effetti di stimolazione sul MDC umani. Il fattore NF-kB trascrizione regola l'espressione di numerosi geni del sistema immunitario. Questo studio misura la localizzazione nucleare di NF-kB (p65) in MDC da un soggetto rappresentante dopo TLR7 / 8 Liga ND stimolazione. In-fuoco cellule singole sono stati identificati mediante gating il PI eventi positivi ad alta proporzioni nucleari (R1). MDC (Lin1-, CD4dim, CD11c +) erano gated in R3. Localizzazione nucleare di NF-kB (p65) è tracciata in R4. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. . Traslocazione di NF-kB in MDC dopo la stimolazione La traslocazione di NF-kB (p65) nel nucleo dopo la stimolazione (R4) è raffigurata in popolazioni di MDC non trattati e stimolato, il punteggio di similitudine mediana è 1,52 nel campione non trattato e 3,01 in il campione stimolata (A). Le immagini digitali raccolte contemporaneamente delle popolazioni di cellule non trattate o R848-stimolato presentano cellule rappresentative e l'intensità del NF-B traslocata nel nucleo della cellula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

Discussione

I passaggi critici in uso di ImageStream per gli studi traslazionali sono la selezione dei gruppi di confronto rilevanti e l'ottimizzazione e la convalida delle specificità anticorpale. Le differenze tra i gruppi di soggetti nel bersaglio marcato saranno subito evidenti attraverso istogrammi e le immagini di cellule. In combinazione con un'analisi approfondita dei cambiamenti nei recettori rilevanti e vie di segnalazione, questi dati forniranno informazioni preziose sui meccanismi che sono alla base disregolazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Ficoll-Paque Plus.	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldeide (16%)	Scienze della microscopia elettronica	15710
BD Perm / Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
coniglio anti-NF-kB (p65)	Santacruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 di capra anti-IgG di coniglio	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Tipo di cella	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monociti		CD14	NF-kB (p65)
mDC	Lin1	CD11c	NF-kB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-kB (p65)	CD4