والفئران مغلقة الصدر نموذج نقص التروية القلبية وإعادة إشباع الخلايا

Summary

صدمة جراحية يدفع استجابة التهابية. ومن المعروف السيتوكينات ويغاندس الذاتية لتعديل حجم عضلة القلب بعد احتشاء الإسكيمية وضخه. نحن تقديم تعديل المغلقة الصدر نموذج من نقص التروية الفئران وضخه باستخدام أوزان شنقا للحد من آثار بضع الصدر.

Abstract

صدمة جراحية بواسطة بضع الصدر في صدره المفتوح نماذج من ربط الشرايين التاجية يدفع استجابة مناعية الذي يعدل الآليات المختلفة المشاركة في نقص التروية وضخه. استجابة جهاز المناعة ويشمل التعبير خلوى وإطلاق أو إفراز يغاندس الذاتية للمستقبلات المناعة الفطرية. ويمكن تنشيط المناعة الفطرية تعدل يحتمل حجم احتشاء. عدلت نحن موجود الفئران المغلقة الصدر نموذج باستخدام الأوزان المعلقة التي يمكن أن تكون مفيدة لدراسة عضلة القلب قبل وpostconditioning ودور المناعة الفطرية في نقص تروية عضلة القلب وضخه. هذا النموذج يسمح للحيوانات على التعافي من الصدمات الجراحية قبل ظهور نقص تروية عضلة القلب.

وقد تم تخدير متقلبة درس بشكل مكثف وكما هو معروف جيدا تأثيرها شروط مسبقة لنقص تروية القلب. ومع ذلك، هذا التأثير الوقائي يحول دون استخدامها في نماذج الصدر المفتوح للربط الشريان التاجي. وبالتالي، يمكن أن تكون ميزة أخرى لاستخدام اله التخدير المتطايرة يمكن السيطرة عليها بشكل جيد لأجهزة القياس في نموذج مغلقة الصدر المزمنة، منذ تأثيرها شروط مسبقة تستغرق ما يصل الى 72 ساعة. أمراض القلب المزمنة مع نقص التروية متقطعة ونماذج متعددة من التطبيقات ضربة محتملة أخرى من هذا الطراز.

لنموذج مغلقة الصدر المزمنة، والفئران، ومدخل أنبوب التهوية الخضوع لبضع الصدر الجانبي حادة عبر الفضاء وربي 4. يتم تمرير تحديد التالية من اليسار الأمامي النازل رباط تحت السفينة وهي الخيوط طرفي الخيط من خلال occluder. ثم، يتم تمرير طرفي الخيط من خلال جدار الصدر، معقود على شكل حلقة وغادرت في النسيج تحت الجلد. بعد إغلاق الصدر وانتعاش لمدة 5 أيام، هي تخدير الفئران مرة أخرى، يتم فتح الصدر والجلد ومدمن مخدرات شنقا أوزان تصل إلى حلقة تحت مراقبة تخطيط القلب.

في نهاية البروتوكول نقص التروية / ضخه، ويمكن ملطخة قلوب مع TTC لاحتشاءتقدير حجم أو الخضوع لتثبيت نضح للسماح للدراسات المورفومترية بالإضافة إلى الأنسجة والمناعية.

Protocol

1. التخدير

1. لتحريض مع isoflurane، ضع الماوس في مربع الاستقراء وهذا مرتبط إلى مجموعة بخار إلى المجلد٪ 3.0 وتدفق الأوكسجين من 0.5 لتر / دقيقة.
2. بعد أن يتحقق اللاوعي مع التحفيز عن طريق اللمس للحث على عدم استجابة وانسحاب دواسة forelimb أو hindlimb منعكس غيابها، ضع الماوس على طاولة العمليات في درجة الحرارة التي تسيطر عليها في موقف ضعيف. الحفاظ على تخدير أكثر من مخروط الأنف الذي يرتبط الى بخار عبر صناديق الاستقراء. أحنى رأسه من خلال تحديد القواطع العلوية مع خاط النايلون 5-0 لتسهيل التنبيب.
3. إدراج تحقيق درجة حرارة الجسم للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية. تحديد الحدود القصوى مع الشريط. عبر الجزء الأسفل من الساق اليسرى فوق الساق اليمنى لفتح صدره الأيسر وفضح قلب أفضل.
4. تطبيق كريم مزيل الشعر في الرقبة والصدر اليسار. يمسح كريم بعد 1 دقيقة. تطبق البوفيدون-اليود للبشرة المحليةالتطهير. حقن البوبرينورفين وزن الجسم 0.05 ملغم / كغم لتخفيف الألم تحت الجلد.
5. جعل جلد العنق شق المنتصف مع مقص صغير. تخفف من حدة تشريح الغدد والعضلات التي تغطي القصبة الهوائية. بدوره على جهاز التنفس الصناعي. وينبغي تعديل إعدادات جهاز التنفس الصناعي إلى المعلمات الفسيولوجية. نستخدم Minivent، هوغو الكترونيك ساكس، جامعة هارفارد جهاز مع معدل التنفس من 105/min وحجم المد والجزر من 200 ميكروليتر. سحب اللسان مع ملقط وضعه بلطف معدن مجموعة ال 22 أنبوب. تأكيد التنبيب بواسطة رؤية مباشرة من أنبوب داخل القصبة الهوائية وحركة الصدر.
6. تجاوز مربع الاستقراء عن طريق التحول إلى إضاعة أنابيب الغاز لمنع تلوث الفضاء المختبر. ضبط بخار إلى المجلد٪ 2.0.

2. بضع الصدر

1. جعل شق الجلد في خط منتصف الترقوة اليسرى. تخفف من حدة تشريح الأنسجة تحت الجلد نحو الإبط. تحديد الحدود من العضلة الصدرية الكبرى وتخفف من حدة تشريح من ف قاصرتحت ectoralis العضلات. سحب العضلات الصدرية طفيفة على حق. سوف تكسب أنت حسنات وجهة نظر مباشرة من القفص الصدري.
2. تحديد وpentetrate بصراحة مساحة 4 وربي مع الملقط. السماح للنصائح من ملقط تمتد على مساحة وربي لتسمح لنفسك لإدراج المكتبية التي يتم تعديلها مع الأربطة المطاطية التي تعلق على طاولة العمليات. وينبغي أن يكون لديك رؤية واضحة للقلب بما في ذلك الأذن اليسرى. وعادة ما يتحقق هذا الوصول من دون أي خسارة في الدم، وبالتالي دون الحاجة إلى وتخثر كهربائي.

3. التحضير للقلب

1. برفق قبالة تأمور دون إصابة القلب.
2. التعرف على اليسار الأمامي الشريان النازل (LAD) من خلال رفع قبالة الأذن اليسرى الأذيني من الجدار الأمامي من البطين الأيسر. سيتبين LAD فقط على مسار مستقيم قصير مع عدم وضوح الحدود ولون أحمر فاتح بالمقارنة مع الأوردة.

4. الشريان التاجيالأجهزة

1. تعد خياطة البرولين 8-0 مع طرف إبرة مدبب من قبل تشكيلها في شكل-U. تمرير إبرة من خلال عضلة القلب عميقا بما فيه الكفاية تحت الفتى.
2. قطع نهاية إبرة لخياطة أن يكون 1 سم من الخيط في كل جانب.
3. قطع جزء 1 مم PE-10 أنابيب باعتبارها occluder منع أي زوايا حادة. السماح للoccluder لنقع في تطهير الكحولية والاستفادة من قبل استخدام ملاحظة: الأنابيب يجب أن نقع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 24 ساعة لتعقيم بشكل مناسب ^4.
4. الموضوع على حد سواء خياطة تنتهي خلال occluder.
5. استخدام حجم خياطة Kalt 3 إبرة لتوجيه كل من خاط ينتهي من الفضاء وربي الأعلى.

5. اختتام الصدر

1. ربط الضلع العلوي والسفلي من المساحة الوربية فتح جنبا إلى جنب مع خياطة البرولين 6-0. قبل إغلاق الصدر يجب المضي قدما إلى 5.2.
2. Hyperinflate الرئتين لدورات 1 الجهاز التنفسي قليلة لفتححتى انخماص بواسطة تحامل على أنبوب الزفير. ربما هذه المناورة تعتمد أيضا على نوع من التنفس الصناعي الذي تستخدمه. تعيين حجم المد والجزر إلى 300 ميكروليتر حتى يتم إغلاق الصدر.
3. تعيين جهاز التنفس الصناعي مرة أخرى حجم المد والجزر الى 200 ميكروليتر.
4. ربط طرفي الخيط LAD ربط 8-0 ليكون لهم شكل حلقة.
5. إرفاق تخطيط القلب.
6. عقف الأوزان إلى حلقة 8-0، والسماح للأوزان شنق بعناية. يجب أن تشاهد كبيرة ST-ارتفاع في غضون بضع ضربات القلب. الافراج عن الأوزان ملاحظة: هذه التجارب استخدام ما مجموعه 5.5 غرام من الوزن، ولكن الوزن يمكن أن تختلف على أساس السلالة ووزن الجسم في الفئران.
7. وضع حلقة في جيب تحت الجلد وإغلاق الجلد مع خيوط عقدة واحدة 6-0.
8. السماح للفأرة على التعافي بعد نزع الأنبوب تحت مصباح الاحتباس الحراري.

6. إقفار عضلة القلب وإعادة إشباع الخلايا

1. بعد فترة نقاهة لا تقل عن 5 أيام لحث التخدير مع خليط من الكيتامين، زيلازينوالأتروبين (4 مل / كجم من وزن الجسم، الكيتامين 10 ملغ / مل، زيلازين 2 ملغ / مل، الأتروبين 0.06 ملغم / لتر، ^1.
2. Intubate وتهوية مع هواء الغرفة للتجارب نقص التروية وضخه.
3. فتح خياطة الجلد من الصدر. إعداد حلقة خياطة 8-0. إرفاق تخطيط القلب.
4. عقف الأوزان والسماح لهم معطلا. تتبع بروتوكول الخاص الإسكيمية. مراقبة تخطيط القلب لانحلال المحتملة لارتفاع ^ST-2.
5. الافراج عن الأوزان في نهاية نقص التروية. إغلاق الجلد، ينزع الأنبوب الماوس والسماح لها على التعافي.

7. احتشاء تقييم الحجم مع الوقت إعادة إشباع الخلايا تصل إلى 3 أيام

1. تخدير وintubate الماوس في نهاية الوقت المطلوب ضخه.
2. قطع الجلد الصدر في خط الوسط إلى سيفي الشكل. فتح البطن وقطع الحجاب الحاجز أسفل القفص الصدري. قطع الصدر مفتوحة على كل من جانبي خط منتصف الترقوة.
3. إصلاح خافق جدار الصدر الأمامي مع خياطة للوصول دون عائق الى القلب.
4. تعد بعناية حلقة خياطة 8-0. قطع حلقة وربط عقدة على حبس الفتى.
5. حقن 10٪ phthalo الزرقاء في الأذين الأيسر. لمنع الحمل الزائد حجم القلب، حقن صبغ ببطء ونضح من وقت لآخر.
6. حقن كلوريد البوتاسيوم في الأذين الأيسر. وهذا الاعتقال القلب في انبساط لتقييم حجم احتشاء متساوية.
7. قطع القلب، وترك أكبر قدر من أنسجة خارج القلب ممكن للتخفيف من قطع القلب.
8. يغسل القلب في حل العازلة الفوسفات.
9. تجمد القلب في النيتروجين السائل وisopentane. بدلا من ذلك، يمكن وضع قلوب في الثلاجة حتى تجمد طفيفة.
10. خفض القلب في شرائح 1 مم. لدينا جهاز التقطيع المصنوعة من شفرات الحلاقة لخفض القلب في شرائح متساوية (الشكل 4). تأكد من محاذاة بشكل صحيح القلب لخفض عمودي على محور طويل من القلب.
11. احتضان الشرائح في TTC 1.5٪ في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. نحن نستخدم لوحة 96 جيد حيثيتم وضع كل شريحة في واحدة أيضا. وهذا سيوفر TTC وتجنيب لك استخدام مرشح Whatman لمنع القطع الأثرية.
12. تحديد شرائح مع الفورمالديهايد 4٪ بين عشية وضحاها. وهذا تقليص شرائح ولكن على النقيض يعزز من الصبغة.
13. وضع شريحة على شريحة المجهر. تغطية مع شريحة أخرى. استخدم 1 الفواصل المعدنية ملم في نهاية كل من الشريحة وعقد الشرائح جنبا إلى جنب مع لقطات ورقة.
14. أخذ صورة رقمية من كلا الجانبين من كل شريحة. دائما استخدام نفس الإعدادات وليس لتكبير لأصغر شرائح.
15. استخدام البرمجيات لplanimetry. نحن نستخدم يماغيج بواسطة المعاهد الوطنية للصحة. دائما استخدام نفس المعايير بالنسبة للمناطق احتشاء، ومحتشى؛ مصاب بالاحتشاء المناطق مثل أبيض فقط. لا محتشى؛ مصاب بالاحتشاء المناطق ردي أبيض. لقد أعمى نحن المحققين للتدخلات وplanimetry كذلك.

8. البديل تحضير القلب للعلم الأنسجة

1. اتبع الخطوات من 7،1-7،2. والمضي قدما إلى 8.2. ويمكن أن يتم تقدير موثوق احتشاء مع تلطيخ TTC في غضون 72 ساعة من ضخه بسبب انكماش الندبة.
2. إعداد إيقاف أي نوع من الأنسجة خارج القلب وتخفف من حدة تشريح الغدة الصعترية التي تغطي جذر الأبهر.
3. الاستيلاء على الشريان الأبهر الصاعد مع ملقط وقطع القلب مع الأنسجة كما extracardiac أقل وقت ممكن.
4. غسل وتضغط على القلب بلطف في حل شلل القلب.
5. وضع القلب في طبق P35 مليئة حل شلل القلب.
6. تعد الشريان الأبهر الصاعد.
7. يقني؛ يدخل القنية الشريان الأبهر الصاعد مع قنية أن مملوءة مسبقا مع الفورمالديهايد. نحن نستخدم الزنك الفورمالين تثبيتي، وعلى مدار 24 خط الرابع G ^3.
8. قطع حفرة بين الأذن اليسرى والأذين الأيسر.
9. ادخال قسطرة G 26 في الأذين الأيسر مع أنبوب طويل 16 سم المرتبطة به. يمكنك أيضا استخدام أنابيب PE50.
10. يروي القلب لمدة عشر دقائق مع مثبت الفورمالين.
11. وضع القلب في أنبوب مملوء مثبت لمدة أقصاها 24 ساعة في 7 درجة مئوية.
12. تواصل مع الإعداديةaration عن الأنسجة / المناعية.

9. ممثل النتائج

مزمن ربط الشريان التاجي هو تقنية معقدة مع مطبات متعددة. ومع ذلك، بمجرد أن يتقن لا يمكن أن يؤديها مع معدلات الوفيات المنخفضة جدا ونتائج موثوق بها للغاية. تحديد المواقع المثلى من الفئران، والوصول إلى قلب حاسمة لتحديد نجاح والأجهزة من الفتى. والموقف من عملية ربط التأثير الواضح حجم احتشاء، مما يتطلب أن يكون لها موقع ربط موحدة. أيضا، إذا تتأثر فروع الحاجز وهذا يمكن أن يؤدي إلى حزمة كتلة فرع بدلا من ارتفاع ST. نزيف من عروق epimyocardial أو من البطين، إذا ربط عميق جدا، يمكن أن يحدث وينبغي استبعاد الفئران إذا كان النزيف المفرط. وينبغي إزالة بريكأرد تماما بقدر الإمكان. وسوف يغادر بريكأرد تفاقم دفع الإبرة في myocard للربط. أيضا، فإن ذلك سيكون سببا التامور، في نهاية المطافحث الالتصاقات وسيجعل من الصعب الفحص النسيجي. يجب أن PE-occluder تكون قصيرة قدر الإمكان من دون أي زوايا حادة للتقليل من صدمة إلى myocard. التضخم الجامح في الرئتين أمر جوهري للغاية لمنع التوتر بعد إغلاق استرواح الصدر. ليست هناك حاجة لتصريف المياه في الصدر. وينبغي حذف اختبار موقف الصحيح للربط في صدره المفتوح عن طريق سحب طرفي الخيط لسحب التوتر من الصعب السيطرة عليها. إذا الأجهزة من الفتى فشل، يجب تجنب محاولات أخرى لأن هذا سيضيف الصدمة وذمة لعضلة القلب.

من أجل تحقيق نتائج يمكن التعويل عليها، وينبغي أن المعلمات بروتوكول تكون موحدة. ولذلك، فإن مدخل أنبوب الفئران والتهوية مع هواء الغرفة، وتخضع لسيطرة محكمة درجة حرارة الجسم مع نظام التعليق. وقد تم استخدام الأوزان وشدد معلق بالفعل. غيرها من أجهزة سحب يكون في غير صالح فقدان التوتر وغير موحدة، سحب التوتر. الدماغيةوبشكل أكثر سهولة تنفيذ البروتوكولات السابقة وpostconditioning مع دورات متعددة من ضخه وانسداد مع شنقا الأوزان لأنها تحتاج فقط إلى أن يرفع وترك معلقا (الشكل 1).

وينبغي أن المناطق احتشاء (أبيض) تكون مميزة عن المناطق المعرضة للخطر (أحمر) ومنطقة غير في المخاطر (الأزرق) (الشكل 2A-B). احتشاء الأحجام تعتمد على مدة من نقص التروية. وينبغي أن يكون وقت ضخه على الأقل 2 ساعة للسماح ناجح TTC تلطيخ (الشكل 1 و 2). الأهم من ذلك، خلوى RNA التعبير منخفضة في الحيوانات الشام التي كانت تعمل كل العمليات الجراحية ما عدا نقص التروية وضخه بالمقارنة مع الحيوانات التي خضعت لاحتشاء عضلة القلب (الشكل 3A-C).

الشكل 1. احتشاء في حجم النسبة المئوية للمنطقة معرضة للخطر (هو٪ AAR /). خضعت الفئران 30 دقيقة الإسكيمية تليها 120 دقيقة من ضخه (I / R، ن = 10). التصنيف الدولي للبراءات: postconditioning الدماغية، والفئران وخضع 30 دقيقة من نقص التروية تليها 3 دورات من ضخه / انسداد كل 20 ثانية (ن = 6، * يشير P <0.05).

2A شخصية. الممثل شريحة قلب TTC الملطخة. أبيض: منطقة، احتشاء الأحمر: منطقة معرضة للخطر، الأزرق: غير المغطي المنطقة.

2B شخصية. شريحة الممثل لمنطقة (أبيض) احتشاء. لاحظ أنه نظرا لشكل مخروطي من وثيقة البطين الأيسر للقمة، وepimyocard سوف تظهر منطقة طائرة، وينبغي ألا ينظر لقياس planimetric (الوردي / الزرقاء منطقة الخارجي). ملطخة أحمر = TTC myocard قابلة للحياة.

3A الشكل. هناك اختلاف كبير في بلديocardial TNF-α التعبير مرنا بعد نقص التروية 30 دقيقة و 120 دقيقة ضخه. ن = 4-6 في المجموعة.

3B شخصية. عضلة القلب التعبير مرنا IL-1β الإسكيمية بعد 30 دقيقة و 120 دقيقة ضخه (I / R). ليس هناك فرق كبير بين السيطرة (أي عملية جراحية) والشام التي تديرها (أي نقص التروية / ضخه) مجموعة. ن = 4-6 في المجموعة، * يشير P <0.05.

الرقم 3C. عضلة القلب IL-6 التعبير مرنا بعد نقص التروية 30 دقيقة و 120 دقيقة ضخه (I / R). ليس هناك فرق كبير بين السيطرة (أي عملية جراحية) والشام التي تديرها (أي نقص التروية / ضخه) مجموعة. ن = 4-6 في المجموعة، * يشير P <0.05.

رقم 4A-C. إسمعتي قطع الجهاز. ج: مغلق مع شفرات الحلاقة في موقف القطع. (ب): مفتوح، عرض الجانب. C: مفتوحة، أمام. وسيجري التوفيق القلب في أخدود من السرير والبلاستيك الأبيض مع عمودي على محور طويل لشفرات الحلاقة (السهم).

Discussion

عدلت لدينا الفئران المغلقة الصدر نموذج عن طريق الوصول إلى قلب من خلال بضع الصدر اليسار وربي الجانبية والتي تؤدي للخروج من الغرز LAD في الصدر في خط منتصف الترقوة اليسرى. وسوف يغادر القفص الصدري عظمي سليم تقليل الصدمات النفسية، وبحاجة لعلاج الألم، وعدوى موقع الجراحية، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
بخار	Drägerwerk AG	Isoflo
مجهر	لايكا	M80
مصدر الضوء	شوت	كوالا لمبور 1500 شاشات الكريستال السائل
Homeothermic وحدة تحكم غطاء	هارفارد جهاز
MiniVent نوع 845	هوغو ساكس الكترونيك
8-0 البرولين	Ethicon	BV130-5 6.5mm 3/8c
6-0 البرولين	Ethicon	BV-1 9.3 مم 3/8c
Kalt حجم إبرة خياطة 3	FST	12050-03
Triphenyltetrazolium	سيجما ألدريتش	93145
Phthalo الزرقاء	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments