Un murin à thorax fermé Modèle d'ischémie myocardique et la reperfusion

Résumé

Un traumatisme chirurgical induit une réponse inflammatoire. Les cytokines et les ligands endogènes sont connus pour moduler la taille infarctus du myocarde après une ischémie et la reperfusion. Nous présentons une version modifiée à thorax fermé modèle murin d'ischémie et la reperfusion en utilisant les pondérations suspendus pour minimiser les effets de la thoracotomie.

Résumé

Un traumatisme chirurgical par thoracotomie à thorax ouvert dans les modèles de la ligature coronaire induit une réponse immunitaire, ce qui modifie différents mécanismes impliqués dans l'ischémie et la reperfusion. La réponse immunitaire comprend l'expression des cytokines et la libération ou la sécrétion de ligands endogènes de récepteurs immunitaires innées. L'activation de l'immunité innée peut potentiellement moduler taille de l'infarctus. Nous avons modifié un existant murin à thorax fermé modèle en utilisant les pondérations suspendus qui pourraient être utiles pour l'étude du myocarde avant et postconditionnement et le rôle de l'immunité innée dans l'ischémie myocardique et la reperfusion. Ce modèle permet aux animaux de récupérer d'un traumatisme chirurgical avant l'apparition de l'ischémie myocardique.

Les anesthésiques volatils ont été intensément étudiés et leur effet de préconditionnement pour la cardiopathie ischémique est bien connu. Cependant, cet effet protecteur empêche son utilisation dans les modèles à thorax ouvert de ligature de l'artère coronaire. Ainsi, un autre avantage pourrait être l'utilisation d'ee bien contrôlables anesthésiques volatils pour l'instrumentation dans une chronique à thorax fermé modèle, puisque leur effet de préconditionnement dure jusqu'à 72 heures. Les maladies cardiaques chroniques présentant une ischémie intermittente et les modèles touchés sont multiples autres applications possibles de ce modèle.

Pour la chronique à thorax fermé modèle, les souris intubés et ventilés subir une thoracotomie latérale émoussée par l'intermédiaire du 4eme espace intercostal. Identification à la suite de l'descendante antérieure gauche d'une ligature est passé en dessous de la cuve et les deux extrémités de suture sont enfilés à travers un obturateur. Puis, les deux extrémités de suture sont passés à travers la paroi thoracique, noué à former une boucle et à gauche dans le tissu sous-cutané. Après la fermeture du thorax et de récupération pour 5 jours, les souris sont anesthésiées à nouveau, la peau du thorax est rouvert et le poids suspendus sont accrochés à la boucle sous contrôle ECG.

A la fin du protocole d'ischémie / reperfusion, le cœur peut être teinté avec TTC pour l'infarctusl'évaluation de taille ou de subir fixation par perfusion afin de permettre des études morphométriques en plus de l'histologie et l'immunohistochimie.

Protocole

1. L'induction de l'anesthésie

1. Pour l'induction de l'isoflurane, placer la souris dans une boîte d'induction qui est relié à l'ensemble de vapeur à 3,0% vol et le débit d'oxygène de 0,5 L / min.
2. Après une perte de conscience est réalisé avec stimulus tactile ne pas induire une réponse et le réflexe des membres antérieurs ou postérieurs retrait pédale étant absent, placez la souris sur une table d'opération à température contrôlée dans une position couchée. Maintenir une anesthésie sur un cône nasal qui est reliée à la vapeur par l'intermédiaire du boîtier d'induction. Inclinez la tête en fixant les incisives supérieures avec une suture 5-0 en nylon pour faciliter l'intubation.
3. Insérez la sonde de température par voie rectale pour maintenir la température centrale du corps à 37 ° C. Fixer les extrémités avec du ruban adhésif. Traverser le bas de la jambe gauche au-dessus la jambe droite pour ouvrir la poitrine gauche et exposer le cœur de mieux.
4. Appliquer la crème dépilatoire sur le cou et la poitrine gauche. Essuyez la crème après 1 minute. Appliquer povidone-iode pour la peau localedésinfection. Injecter la buprénorphine 0,05 poids corporel mg / kg pour soulager la douleur sous-cutanée.
5. Faire une incision ligne médiane du cou la peau avec des ciseaux petite. Blunt disséquer les glandes et les muscles qui couvrent la trachée. Allumez le ventilateur. Réglages du ventilateur doit être ajusté à des paramètres physiologiques. Nous utilisons un Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Harvard Apparatus avec une fréquence respiratoire de 105/min et un volume courant de 200 pi. Tirez la langue avec une pince et insérer délicatement un tube métallique 22 G. Confirmer l'intubation par la visualisation directe du tube intérieur de la trachée et le mouvement thoracique.
6. Contourner la boîte de l'induction par commutation à perdre tuyau de gaz pour éviter la contamination de l'espace de laboratoire. Réglez la vapeur à 2,0% vol.

2. Thoracotomie

1. Faire une incision de la peau dans la ligne médio-claviculaire gauche. Blunt disséquer le tissu sous-cutané vers l'aisselle. Identifier la frontière du muscle grand pectoral et émousser le disséquer de la p mineureau-dessous du muscle ectoralis. Tirez le muscle petit pectoral vers la droite. Vous allez acquérir une vue directe sur la cage thoracique.
2. Identifier et carrément pentetrate du 4eme espace intercostal avec une pince. Que les conseils de la pince couvrent l'espace intercostal de vous permettre d'insérer les écarteurs qui sont ajustés avec des bandes en caoutchouc attachés à la table d'opération. Vous devriez avoir une vision claire du cœur, y compris l'oreillette gauche. Cet accès est réalisé généralement sans perte de sang et donc sans la nécessité de la coagulation électrique.

3. Préparation du Cœur

1. Retirez délicatement le péricarde sans blesser le cœur.
2. Identifier la gauche artère interventriculaire antérieure (AIA) en soulevant l'oreillette gauche auriculaire de la paroi antérieure du ventricule gauche. DAL ne sera vu que sur un parcours court et droit avec des frontières floues et lumineux de couleur rouge par rapport aux veines.

4. L'artère coronaireInstrumentation

1. Préparer une suture 8-0 prolène avec une pointe d'aiguille effilée en le formant en forme de U. Passez l'aiguille à travers la profondeur suffisante sous le DAL myocarde.
2. Couper la pointe d'aiguille de la suture d'avoir de 1 cm de fil de suture de chaque côté.
3. Coupez une section de 1 mm PE-10 tubulure comme un obturateur empêchant toute angles vifs. Permettre à l'occlusion à tremper dans la désinfection alcoolique et taper avant de l'utiliser. Remarque: Le tube doit être trempé dans de l'éthanol à 100% pendant 24 heures pour le stériliser correctement ^4.
4. Discussion à la fois de suture se termine par l'intermédiaire du dispositif d'occlusion.
5. Utilisez une taille de 3 aiguilles de suture Kalt pour guider à la fois de suture se termine hors de l'espace intercostal supérieure.

5. La fermeture du thorax

1. Attacher la nervure supérieure et inférieure de l'espace ouvert intercostale avec un fil de suture 6-0 prolène. Avant de fermer le coffre, vous devez procéder à 5.2.
2. Hyperinflate les poumons pendant quelques cycles respiratoires pour ouvrirjusqu'à atélectasie par serrage du tube d'expiration. Cette manœuvre peut aussi dépendre du type de ventilateur que vous utilisez. Réglez le volume courant à 300 pi jusqu'à ce que la caisse est fermée.
3. Réglez le volume à l'arrière ventilateur de marée à 200 pi.
4. Attacher les deux extrémités de la suture 8-0 DAL ligature de les faire former une boucle.
5. Fixer un ECG.
6. Accrochez les poids à la boucle 8-0 et laisser les poids attentivement pendre. Vous devriez voir une importante élévation du segment ST dans les quelques battements de cœur peu. Relâchez le poids. Note: Ces expériences utilisent un total de 5,5 g de poids, mais le poids peut varier en fonction de la souche et le poids corporel des souris.
7. Placez la boucle dans une poche sous-cutanée et fermer la peau avec des sutures 6-0 nœuds simples.
8. Laissez la souris de récupérer après l'extubation sous une lampe chauffante.

6. Ischémie myocardique et reperfusion

1. Après une période de recouvrement d'au moins 5 jours induire une anesthésie d'un mélange de kétamine, la xylazineet de l'atropine (4 ml / kg de poids corporel, la kétamine 10 mg / ml, la xylazine 2 mg / ml, l'atropine 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intuber et ventiler avec l'air ambiant pour les expériences d'ischémie et la reperfusion.
3. Ouvrez la peau suturée de la poitrine. Préparer la boucle 8-0 suture. Fixer un ECG.
4. Accrochez les poids et les laisser pendre. Suivez votre protocole d'ischémie. Regarder ECG pour la dissolution potentiel de élévation du segment ST ^2.
5. Libérer les poids à l'extrémité de l'ischémie. Fermez la peau, l'extubation de la souris et le laisser récupérer.

7. Évaluation taille de l'infarctus avec délai de reperfusion jusqu'à 3 jours

1. Anesthésier et intuber la souris à la fin de temps de reperfusion désiré.
2. Couper la peau du thorax sur la ligne médiane de la xiphoïde. Ouvrez l'abdomen et couper la membrane sous la cage thoracique. Couper la poitrine ouverte sur les deux côtés de la ligne médio-claviculaire.
3. Fixer la paroi thoracique antérieure battait avec un fil de suture pour gagner un accès libre au cœur.
4. Préparez soigneusement la boucle 8-0 suture. Coupez la boucle et faire un nœud pour occlure l'artère interventriculaire antérieure.
5. Injecter 10% phtalo bleu dans l'oreillette gauche. Pour éviter la surcharge de volume cardiaque, injecter un colorant lentement et aspirer de temps à autre.
6. Injecter le chlorure de potassium dans l'oreillette gauche. Ce sera d'arrêter le cœur en diastole pour l'évaluation des infarctus taille égale.
7. Découpez le coeur, laissant autant de tissu extracardial que possible pour faciliter la coupe du coeur.
8. Lavez le cœur dans une solution tampon phosphate.
9. Geler le coeur dans l'azote liquide et l'isopentane. Alternativement, les cœurs peuvent être placés dans un congélateur jusqu'à ce que légèrement gelé.
10. Couper le cœur en tranches de 1 mm. Nous avons un dispositif de coupe en lames de rasoir pour couper le coeur en tranches égales (figure 4). Assurez-vous que le cœur est correctement aligné pour couper perpendiculairement à l'axe longitudinal du cœur.
11. Incuber les tranches dans 1,5% TTC à 37 ° C pendant 20 min. Nous utilisons une plaque à 96 puits oùchaque tranche est mis dans un puits. Cela permettra d'économiser TTC et vous épargner l'utilisation d'un filtre Whatman pour éviter les artefacts.
12. Fixer les tranches avec du formaldéhyde 4% pendant la nuit. Ce sera rétrécir les tranches, mais améliore le contraste de la teinture.
13. Mettez la tranche sur une lame de microscope. Couvrir avec une autre diapositive. Utilisez 1 entretoises métalliques mm à chaque extrémité de la lame et maintenez les diapositives avec des trombones.
14. Prendre une image numérique à partir des deux côtés de chaque tranche. Toujours utiliser les mêmes paramètres et ne pas faire un zoom avant pour les petites tranches.
15. Utilisez un logiciel pour la planimétrie. Nous utilisons ImageJ par le NIH. Toujours utiliser les mêmes critères pour les zones infarcis, par exemple les zones blanches ne sont infarci. Zones blanches rosées ne sont pas infarci. Nous avons aveuglé enquêteurs pour les interventions et la planimétrie ainsi.

8. Préparation coeur Alternative pour l'histologie

1. Suivez les étapes 7.1 à 7.2. et procéder à 8,2. Évaluation fiable du myocarde avec une coloration TTC peut être fait dans les 72 heures de reperfusion en raison de la cicatrice. Retrait
2. Préparer hors tout tissu extracardial et émousser disséquer les thymus couvrant la racine de l'aorte.
3. Prenez l'aorte ascendante avec les pinces et couper le coeur avec le tissu comme moins extracardiaque que possible.
4. Laver et presser le coeur en douceur dans une solution de cardioplégie.
5. Placez le coeur dans un plat rempli de p35 solution de cardioplégie.
6. Préparer l'aorte ascendante.
7. Cathétériser l'aorte ascendante avec une canule qui est pré-rempli avec du formaldéhyde. Nous utilisons du zinc-formol fixateur et un 24 G iv ligne ^3.
8. Coupez un trou entre l'oreillette gauche et l'oreillette gauche.
9. Insérer un cathéter 26 G dans l'oreillette gauche avec un tube de 16 cm de longueur qui s'y rattachent. Vous pouvez également utiliser un tube PE50.
10. Perfuser le coeur pendant dix minutes avec le fixateur de formol.
11. Placez le cœur dans un tube rempli d'un fixateur pour un maximum de 24 heures à 7 ° C.
12. Continuer avec prépparation pour l'histologie / immunohistochimie.

9. Les résultats représentatifs

Chronique ligature de l'artère coronaire est une technique complexe d'embûches multiples. Cependant, une fois qu'il est maîtrisé, il peut être effectué avec les taux de mortalité très faible et les résultats très fiables. Le positionnement optimal de la souris et l'accès au cœur sont cruciales pour l'identification réussie et l'instrumentation de la DAL. La position de la ligature sera bien évidemment influencer taille de l'infarctus, ce qui nécessite d'avoir un site de ligature normalisée. En outre, si des branches septales sont touchés ce qui pourrait conduire à un bloc de branche au lieu de élévation du segment ST. Saignement de veines epimyocardial ou du ventricule, si la ligature est trop profonde, peut se produire et la souris doivent être exclues si le saignement est excessif. Péricard doivent être retirés aussi complètement que possible. En quittant le péricarde va aggraver pousser l'aiguille dans le myocarde pour la ligature. En outre, il fera une péricardite, éventuellementinduire des adhérences et procéder à l'examen histologique difficile. Le PE-occlusion doit être aussi courte que possible, sans aucun angle vif pour minimiser les traumatismes de myocarde. L'hyperinflation des poumons est absolument crucial pour prévenir un pneumothorax sous tension après la fermeture du thorax. Il n'est pas nécessaire pour un drainage thoracique. Test d'une position correcte de la ligature dans la poitrine ouverte en tirant sur les extrémités de suture devraient être supprimées car tirant la tension est difficile à contrôler. Si l'instrumentation de la DAL échoue, d'autres tentatives doit être évitée car cela va ajouter un traumatisme et un oedème du myocarde.

Afin d'obtenir des résultats fiables, les paramètres du protocole devrait être normalisé. Par conséquent, les souris sont intubés et ventilés avec l'air ambiant et la température du corps est étroitement contrôlé par un système de rétroaction. L'utilisation des poids suspendus a été déjà souligné. Autres dispositifs de traction ont l'inconvénient de la perte de tension et non-standardisée tension de traction. Ischémiqueprotocoles pré-et postconditionnement avec de multiples cycles de reperfusion et l'occlusion sont plus facile à réaliser avec accrochant des poids parce qu'ils ne doivent être levées et laisser accroché (Figure 1).

Zones du myocarde (blanc) doit être distinguée de zones à risque (rouge) et la zone non à risques (bleu) (Figure 2A-B). Infarctus tailles sont fonction de la durée de l'ischémie. Temps de reperfusion doit être d'au moins 2 heures pour permettre à succès coloration TTC (Figure 1 et 2). Plus important encore, cytokine expression de l'ARN est faible chez les animaux une opération fictive qui avaient toutes les interventions chirurgicales à l'exception ischémie et la reperfusion par rapport aux animaux qui ont subi un infarctus du myocarde (figure 3A-C).

Figure 1. Taille de l'infarctus en pourcentage de la zone à risque (EST /% AAR). Souris ont subi une ischémie de 30 minutes, suivie d'une20 minutes de reperfusion (I / R, n = 10). CIB: postconditionnement ischémique, les souris ont subi 30 minutes d'ischémie suivie par 3 cycles de reperfusion / l'occlusion 20 sec chacune (n = 6, * indique p <0,05).

La figure 2A. Tranche représentant coeur TTC teinté. Blanc: zone de l'infarctus, rouge: zone à risque, Bleu: non-occlus région.

La figure 2B. Tranche représentant d'un infarctus (blanc) zone. Notez qu'en raison de la forme conique de la clôture du ventricule gauche à l'apex, le epimyocard apparaîtra comme surface plane et ne devrait pas être considérée pour la mesure planimétrique (rose / bleu zone extérieure). Rouge = TTC colorées myocarde viable.

La figure 3A. Aucune différence significative dans maexpression de l'ARNm du TNF-α ocardial après une ischémie de 30 minutes et 120 reperfusion minutes. n = 4-6 par groupe.

La figure 3B. Du myocarde expression de l'ARNm de l'IL-1β, après une ischémie de 30 minutes et 120 minutes de reperfusion (I / R). Il n'y a pas de différence significative entre le contrôle (sans chirurgie) et opérés de manière fictive (absence d'ischémie / reperfusion) du groupe. n = 4-6 par groupe, * indique p <0,05.

Figure 3C. Du myocarde IL-6 expression de l'ARNm après une ischémie de 30 minutes et 120 minutes de reperfusion (I / R). Il n'y a pas de différence significative entre le contrôle (sans chirurgie) et opérés de manière fictive (absence d'ischémie / reperfusion) du groupe. n = 4-6 par groupe, * indique p <0,05.

Figure 4A-C. Écoutezt le dispositif de coupe. Un: fermée avec les lames de rasoir dans la position de coupe. B: ouvert, vue de côté. C: ouvert, vue de face. Coeur sera aligné dans la rainure du lit plastique blanc avec son axe perpendiculaire à long des lames de rasoir (flèche).

Discussion

Nous avons modifié un murin à thorax fermé modèle en accédant au cœur par une thoracotomie gauche intercostal latéral et conduisant les sutures DAL à la poitrine dans la ligne médio-claviculaire gauche. En sortant de la cage thoracique osseuse intacte sera de minimiser les traumatismes, le besoin de médicaments contre la douleur, infection du site opératoire et donc, de faciliter la récupération. En préservant la gauche carotide interne des mammifères il n'est pas nécessaire pour l'électrocauté...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Vapeur	Drägerwerk AG	Isoflo
Microscope	Leica	M80
Source de lumière	Schott	KL 1500 LCD
Homéotherme Control Unit Blanket	Harvard Apparatus
Type de Minivent 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolène	Ethicon	BV130-5 6.5mm 3/8c
6-0 Prolène	Ethicon	BV-1 de 9,3 mm 3/8c
Taille Kalt aiguille de suture 3	FST	12050-03
Triphényltétrazolium	Sigma-Aldrich	93145
Bleu phtalo	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments