A Murine chiuso del torace modello di ischemia miocardica e riperfusione

Riepilogo

Trauma chirurgico induce una risposta infiammatoria. Citochine e ligandi endogeni sono noti per modulare dimensione miocardio a seguito di ischemia e riperfusione. Vi presentiamo una versione modificata del chiuso petto modello di ischemia e di riperfusione murino con pesi appesi per minimizzare gli effetti di toracotomia.

Abstract

Trauma chirurgico in toracotomia a torace aperto modelli di legatura coronarica induce una risposta immunitaria che modifica differenti meccanismi di ischemia e riperfusione. Risposta immunitaria comprende l'espressione di citochine e il rilascio o la secrezione di ligandi endogeni dei recettori del sistema immunitario innato. L'attivazione dell'immunità innata sono potenzialmente in grado di modulare le dimensioni dell'infarto. Noi abbiamo modificato uno esistente topo chiuso del torace modello con pesi pendenti che potrebbero essere utili per lo studio del miocardio pre-e postconditioning e il ruolo dell'immunità innata nei ischemia miocardica e riperfusione. Questo modello consente agli animali di recuperare dal trauma chirurgico prima della comparsa di ischemia miocardica.

Anestetici volatili sono stati studiati intensamente e loro effetto condizionamento per il cuore ischemico è ben noto. Tuttavia, questo effetto protettivo preclude l'uso di modelli in torace aperto di legatura dell'arteria coronarica. Così, un altro vantaggio potrebbe essere l'uso di secolole e ben controllabili anestetici volatili per la strumentazione in una malattia cronica chiuso del torace modello, dal momento che il loro effetto di precondizionamento dura fino a 72 ore. Malattie cardiache croniche con ischemia intermittente e modelli più colpite sono altre possibili applicazioni di questo modello.

Per la cronica chiuso del torace modello, intubato e ventilato topi sottoposti a una toracotomia laterale ottuso attraverso il quarto spazio intercostale. A seguito della identificazione discendente anteriore sinistra una legatura viene passata sotto l'imbarcazione e entrambe le estremità di sutura vengono fatti passare lungo un occlusore. Quindi, entrambe le estremità di sutura vengono fatti passare attraverso la parete toracica, annodato per formare un anello e lasciato nel tessuto sottocutaneo. Dopo la chiusura del torace e di recupero per 5 giorni, i topi sono anestetizzati ancora una volta, la pelle del torace viene riaperto e pesi appesi sono collegati al circuito ECG sotto controllo.

Alla fine del ischemia / riperfusione protocollo, cuori possono essere colorati con TTC per infartodimensioni valutazione o sottoposti a perfusione fissazione per consentire gli studi morfometrici oltre alla istologia e di immunoistochimica.

Protocollo

1. Induzione dell'anestesia

1. Per l'induzione con isoflurano, posizionare il mouse in una scatola di induzione che è collegata al set vapore al 3,0% Vol e il flusso di ossigeno di 0,5 L / min.
2. Dopo incoscienza si ottiene con stimolo tattile non aver indurre una risposta e la zampa anteriore o arti posteriori reflex ritiro pedale è assente, posizionare il mouse su una temperatura controllata tavolo operatorio in posizione supina. Mantenere l'anestesia su un cono nasale che è collegato al vapore attraverso la scatola di induzione. Reclinare la testa fissando gli incisivi superiori con una sutura in nylon 5-0 per facilitare l'intubazione.
3. Inserire la sonda rettale temperatura per mantenere temperatura corporea a 37 ° C. Fissare le estremità con del nastro adesivo. Attraversare la parte inferiore della gamba sinistra sopra la gamba destra per aprire il petto a sinistra ed esporre il cuore migliore.
4. Applicare la crema depilatoria al collo e al torace sinistro. Togliere la crema dopo 1 minuto. Applicare povidone-iodio per la pelle localedisinfezione. Iniettare buprenorfina 0,05 mg / kg di peso corporeo per alleviare il dolore per via sottocutanea.
5. Creare una linea mediana incisione cutanea del collo con una piccola forbice. Smussare sezionare le ghiandole e muscoli che coprono la trachea. Accendere il ventilatore. Impostazioni del ventilatore deve essere regolata per parametri fisiologici. Usiamo un Minivent, Hugo Sachs Elektronik, Apparecchi Harvard con una frequenza respiratoria di 105/min e un volume corrente di 200 pl. Tirare la lingua con una pinza e inserire delicatamente un metallo 22 G tubo. Confermare l'intubazione tramite visualizzazione diretta del tubo all'interno della trachea e il movimento del torace.
6. Bypassare l'induzione passando da perdere tubo del gas per evitare la contaminazione dello spazio laboratorio. Regolare vapore 2,0% vol.

2. Toracotomia

1. Eseguire un'incisione cutanea in linea di sinistra medioclavicolare. Smussare sezionare il tessuto sottocutaneo verso l'ascella. Identificare il bordo del muscolo grande pettorale e smussare sezionarlo dal p minoreectoralis muscolo sottostante. Tirare il muscolo piccolo pettorale a destra. Si otterrà una visione diretta della gabbia toracica.
2. Identificare e senza mezzi termini pentetrate lo spazio intercostale quarto con una pinza. Che le punte della pinza coprono lo spazio intercostale per permettere a voi stessi di inserire i divaricatori che sono regolati con degli elastici attaccati al tavolo operatorio. Si dovrebbe avere una visione chiara del cuore tra l'atrio sinistro. Questo accesso è di solito realizzato senza alcuna perdita di sangue e quindi senza necessità di coagulazione elettrica.

3. Preparazione del Cuore

1. Estrarre delicatamente fuori il pericardio senza ferire il cuore.
2. Identificare il dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) per sollevare il padiglione auricolare atriale sinistra dalla parete anteriore del ventricolo sinistro. LAD sarà visto solo su un percorso breve rettilineo con bordi sfumati e di colore rosso brillante rispetto alle vene.

4. Coronary ArteryStrumentazione

1. Preparare una sutura 8-0 prolene con una punta di spillo conico formando in un U-forma. Far passare l'ago attraverso la profondità sufficiente sotto il LAD miocardio.
2. Tagliare l'ago di sutura per avere 1 cm di sutura su ciascun lato.
3. Tagliare a 1 sezione mm tubo PE-10 come un occlusore prevenire gli eventuali spigoli vivi. Lasciare che il occlusore in ammollo in disinfezione alcolica e battere prima dell'uso. Nota: Il tubo dovrebbe essere immersi in etanolo al 100% per 24 ore di sterilizzare in modo appropriato ^4.
4. Filo di sutura, sia attraverso l'estremità occlusore.
5. Usare una dimensione 3 ago di sutura Kalt per guidare entrambe sutura estremità dallo spazio intercostale superiore.

5. Petto di chiusura

1. Tie la nervatura superiore e inferiore del spazio aperto intercostale insieme con una sutura 6-0 prolene. Prima di chiudere la cassa si dovrà procedere per 5,2.
2. Hyperinflate i polmoni per pochi cicli respiratori per aprirefino atelettasia, fissando il tubo espiratorio. Questa manovra può anche dipendere dal tipo di ventilatore utilizzato. Impostare il volume corrente a 300 microlitri fino a quando il torace è chiuso.
3. Impostare la corrente di nuovo volume di ventilatore a 200 microlitri.
4. Tie entrambe le estremità della sutura 8-0 LAD ligazione a farli formare un anello.
5. Collegare un ECG.
6. Agganciare i pesi per il ciclo 8-0 e lasciare che i pesi con attenzione appendere. Si dovrebbe vedere un significativo sopraslivellamento ST nel giro di pochi battiti cardiaci pochi. Rilasciare il peso. Nota: Questi esperimenti utilizzano un totale di 5,5 g di peso, ma il peso può variare in base al ceppo e del peso corporeo dei topi.
7. Posizionare il passante in una tasca sottocutanea e chiudere la pelle con 6-0 punti di sutura singolo nodo.
8. Lasciate il mouse recupero dopo l'estubazione sotto una lampada riscaldante.

6. Ischemia miocardica e riperfusione

1. Dopo un periodo di recupero di almeno 5 giorni indurre l'anestesia con una miscela di ketamina, xilazinae atropina (4 ml / kg di peso corporeo, ketamina 10 mg / ml, xilazina 2 mg / ml, atropina 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intubare e ventilare con aria ambiente per esperimenti di ischemia e di riperfusione.
3. Aprire la pelle suturata del torace. Preparare il ciclo 8-0 sutura. Collegare un ECG.
4. Collegare i pesi e lasciarli appesi. Seguite il vostro protocollo di ischemia. Guarda ECG di scioglimento potenziale di sopraslivellamento ST ^2.
5. Rilasciare i pesi al fine di ischemia. Chiudere la pelle, estubare il mouse e lasciarlo recuperare.

7. Dimensione Assessment infarto con Time riperfusione fino a 3 giorni

1. Anestetizzare e intubare il mouse alla fine del tempo di riperfusione desiderato.
2. Tagliare la pelle del petto sulla linea mediana al xifoideo. Aprire l'addome e tagliare il diaframma sotto la gabbia toracica. Tagliare il torace aperto su entrambi i lati della linea medioclavicolare.
3. Fissare la parete toracica anteriore sbatteva con una sutura per ottenere libero accesso al cuore.
4. Cura preparare il 8-0 ciclo sutura. Tagliare il ciclo e fare un nodo a occludere il LAD.
5. Iniettare 10% Phthalo blu nell'atrio sinistro. Per evitare un sovraccarico cardiaco volume, tingere iniettare lentamente e aspirare di tanto in tanto.
6. Iniettare cloruro di potassio in atrio sinistro. In questo modo arrestare il cuore in diastole per la valutazione uguali dimensioni dell'infarto.
7. Tagliare il cuore, lasciando tanto di tessuto extracardial possibile per facilitare il taglio del cuore.
8. Lavare il cuore in soluzione tampone fosfato.
9. Congelare il cuore in azoto liquido e isopentano. In alternativa, i cuori possono essere inseriti in un congelatore fino leggermente congelato.
10. Tagliare il cuore in fette da 1 mm. Abbiamo un dispositivo di taglio fatta di lamette per tagliare il cuore in fette uguali (figura 4). Assicurarsi che il cuore è correttamente allineata per tagliare perpendicolare all'asse lungo del cuore.
11. Incubare le fette in TTC 1,5% a 37 ° C per 20 min. Noi usiamo una piastra a 96 pozzetti in cuiogni fetta viene messo in un pozzetto. Ciò farà risparmiare TTC e risparmiarvi l'uso di un filtro Whatman per evitare artefatti.
12. Fissare le fette con il 4% di formaldeide durante la notte. Ciò si ridurrà le fette, ma aumenta il contrasto del colorante.
13. Mettete la fetta su un vetrino da microscopio. Coprire con un'altra diapositiva. Utilizzare distanziatori in metallo 1 mm ad ogni estremità della slitta e tenere le diapositive con graffette.
14. Prendete una immagine digitale da entrambi i lati di ogni fetta. Usare sempre le stesse impostazioni e non lo zoom per i più piccoli fette.
15. Utilizzare un software per la planimetria. Usiamo ImageJ dal NIH. Usare sempre gli stessi criteri per le aree infartuati, ad esempio solo le aree bianche sono infartuata. Aree bianche rosate non sono infartuata. Abbiamo accecati investigatori per interventi e planimetrie pure.

8. Cuore di preparazione alternativa per Istologia

1. Seguire i passaggi da 7.1 a 7.2. e procedere alla 8.2. Valutazione infarto affidabile con colorazione TTC può essere fatto entro 72 ore di riperfusione a causa del ritiro della cicatrice.
2. Preparare off qualsiasi tessuto extracardial e smussare sezionare il timo che coprono la radice aortica.
3. Afferra l'aorta ascendente con le pinze e tagliare fuori il cuore con il tessuto meno extracardiache possibile.
4. Lavare e spremere il cuore delicatamente soluzione cardioplegica.
5. Mettere il cuore in un piatto pieno di p35 soluzione cardioplegica.
6. Preparare l'aorta ascendente.
7. Incannulare l'aorta ascendente con una cannula che è preriempita con formaldeide. Usiamo zinco-formalina fissativo e una linea di 24 G iv ^3.
8. Praticare un foro tra l'atrio sinistro e l'atrio sinistro.
9. Inserire un catetere 26 G nell'atrio sinistro con un tubo di 16 cm di lunghezza collegato ad esso. È inoltre possibile utilizzare una tubazione PE50.
10. Perfusione del cuore per dieci minuti con il fissativo formalina.
11. Mettere il cuore in un tubo riempito con fissativo per un massimo di 24 ore a 7 ° C.
12. Continuare con la preparazioneparazione per l'istologia / immunoistochimica.

9. Risultati rappresentativi

Cronica legatura dell'arteria coronarica è una tecnica complessa, con molteplici insidie. Tuttavia, una volta masterizzato può essere eseguita con tassi di mortalità molto bassi e risultati altamente affidabili. Posizionamento ottimale dei topi e l'accesso al cuore sono fondamentali per l'identificazione di successo e strumentazione della LAD. La posizione della legatura ovviamente influenzare le dimensioni dell'infarto, richiedendo così di avere un sito standardizzato ligazione. Inoltre, se i rami settali sono interessati questo potrebbe portare ad un blocco di branca, invece di sopraslivellamento del tratto ST. Sanguinamento da vene epimyocardial o dal ventricolo, se la legatura è troppo profonda, può verificarsi e topi deve essere esclusa se il sanguinamento è eccessivo. Pericard devono essere rimossi il più completamente possibile. Lasciando la pericard aggraverà spingere l'ago nel miocardio per la legatura. Inoltre, esso causerà pericardite, infineindurre adesioni e farà l'esame istologico difficile. Il PE-occlusione dovrebbe essere il più breve possibile e senza spigoli per minimizzare il trauma al miocardio. L'iperinflazione dei polmoni è assolutamente cruciale per evitare pneumotorace iperteso dopo la chiusura del torace. Non c'è bisogno di un drenaggio toracico. Test di una corretta posizione della legatura nel torace aperto tirando le estremità sutura deve essere omessa perché tirando tensione è difficile da controllare. Se la strumentazione della LAD non riesce, ulteriori tentativi dovrebbero essere evitati perché questo si aggiunge il trauma e edema al miocardio.

Al fine di ottenere risultati affidabili, parametri di protocollo dovrebbe essere standardizzata. Pertanto, i topi sono intubato e ventilato con aria ambiente e la temperatura corporea è strettamente controllata con un sistema di feedback. L'utilizzo di pesi sospesi è stato già sottolineato. Altri dispositivi di trascinamento presentano l'inconveniente di perdita di tensione e non standardizzati tensione di tiro. Ischemicaprotocolli pre e postconditioning con cicli multipli di riperfusione e l'occlusione si può eseguire più facilmente con appesi pesi, perché hanno solo bisogno di essere sollevato e lasciare appeso (Figura 1).

Aree di infarto (bianco) deve essere distinguibile dalle aree a rischio (rosso) e la zona non a rischio (blu) (Figura 2A-B). Infarto dimensioni dipendono dalla durata di ischemia. Riperfusione tempo dovrebbe essere almeno 2 ore per consentire successo colorazione TTC (Figura 1 e 2). Soprattutto, citochine espressione dell'RNA è bassa negli animali che avevano sham azionate tutte le procedure chirurgiche non ischemia e riperfusione rispetto agli animali che sono stati sottoposti infarto miocardico (Figura 3A-C).

Figura 1. Infarto dimensione in percentuale di area a rischio (IS /% AAR). I topi sono stati sottoposti ischemia 30 minuti seguito da 120 minuti di riperfusione (I / R, n = 10). IPC: postconditioning ischemica, i topi sottoposti a 30 minuti di ischemia seguiti da 3 cicli di riperfusione / occlusione ogni 20 sec (n = 6, * indica p <0,05).

Figura 2A. Rappresentante TTC-tinto slice cuore. Bianco: area infartuale, Rosso: area a rischio, Blue: non occluso-area.

Figura 2B. Fetta rappresentante di un infartuato (bianco) area. Si noti che grazie alla forma conica del ventricolo sinistro vicino all'apice, il epimyocard apparirà come superficie piana e non deve essere considerato per la misurazione planimetrica (rosa / blu superficie esterna). Rosso = TTC macchiato miocardio vitale.

Figura 3A. Alcuna differenza significativa nella miaocardial TNF-α espressione di mRNA dopo 30 minuti di ischemia e riperfusione 120 minuti. n = 4-6 per gruppo.

Figura 3B. Miocardico IL-1β espressione di mRNA ischemia dopo 30 minuti e 120 minuti di riperfusione (I / R). Non vi è alcuna differenza significativa tra il controllo (senza chirurgia) e sham-operati (senza ischemia / riperfusione) del gruppo. n = 4-6 per gruppo, indica * p <0,05.

Figura 3C. Miocardico IL-6 espressione di mRNA dopo 30 minuti di ischemia e riperfusione 120 minuti (I / R). Non vi è alcuna differenza significativa tra il controllo (senza chirurgia) e sham-operati (senza ischemia / riperfusione) del gruppo. n = 4-6 per gruppo, indica * p <0,05.

Figura 4A-C. Heart dispositivo di taglio. A: si è chiuso con lamette in posizione di taglio. B: aperta, vista laterale. C: aperto, vista frontale. Cuore sarà allineato nella scanalatura del letto di plastica bianca con asse perpendicolare lungo le lamette (freccia).

Discussione

Abbiamo modificato un topo chiuso petto modello di accesso al cuore attraverso una toracotomia laterale sinistra intercostale e che conduce le suture KOP al petto in linea di sinistra medioclavicolare. Lasciando la gabbia toracica ossea intatta sarà minimizzare il trauma, il bisogno di farmaci per il dolore, l'infezione del sito chirurgico e, quindi, facilitare il recupero. Per preservare l'arteria interno mammifero non c'è bisogno di elettrocauterizzazione. Si lascia il ciclo sutura nel tessuto sottocutan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Vapore	Drägerwerk AG	Isoflo
Microscopio	Leica	M80
Sorgente luminosa	Schott	KL 1500 LCD
Omeotermi Blanket Control Unit	Harvard Apparatus
Minivent Type 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6,5 millimetri 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9,3 millimetri 3/8c
Kalt dell'ago sutura 3	FST	12050-03
Trifeniltetrazolio	Sigma Aldrich	93145
Phthalo blu	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments