דגם Murine סגור החזה של איסכמיה של שריר הלב reperfusion

Summary

טראומה ניתוחית גורם לתגובה דלקתית. ציטוקינים ligands אנדוגניים ידועים לווסת את גודל האוטם בשריר הלב בעקבות איסכמיה ו reperfusion. אנו מציגים שונה סגור החזה מודל של איסכמיה reperfusion Murine באמצעות משקולות תלויות כדי למזער את ההשפעות של פתיחת בית החזה.

Abstract

הטראומה של פתיחת בית החזה כירורגית ב פתוח החזה דגמים של קשירת כלילית משרה תגובה חיסונית אשר משנה מנגנונים שונים המעורבים איסכמיה ו reperfusion. התגובה החיסונית כוללת ביטוי ציטוקינים ושחרור או הפרשת ligands אנדוגניים של קולטני החיסון המולדת. ההפעלה של חסינות מולדת עלולה לווסת את גודל האוטם. יש לנו שונה המודל הקיים Murine סגור החזה באמצעות משקולות תלויות אשר יכול להיות שימושי עבור לימוד שריר הלב לפני ואחרי postconditioning ואת תפקידו של חסינות מולדת ב reperfusion איסכמיה בשריר הלב. מודל זה מאפשר חיות להתאושש מהטראומה כירורגית לפני תחילתה של איסכמיה בשריר הלב.

הרדמה נדיפים נחקרו מאוד ותוצאה נפשית מראש שלהם ללב איסכמית ידועה. עם זאת, ההשפעה המגנה מונע את השימוש במודלים של החזה הפתוחים של קשירת עורקים כליליים. לכן, יתרון נוסף יכול להיות השימוש הדואר הרדמה נדיפים לשליטה גם על מכשור במודל סגור החזה כרונית, שכן ההשפעה נפשית מראש שלהם נמשך עד 72 שעות. מחלות לב כרונית עם איסכמיה לסירוגין מודלים פגע מספר יישומים אפשריים אחרים של דגם זה.

עבור דגם סגור החזה כרונית, עכברים מחובר לצינור מאוורר לעבור פתיחת בית החזה בוטה לרוחב דרך החלל בין צלעי 4. בעקבות זיהוי של הקדמי השמאלי יורד ליגטורה הוא עבר מתחת הספינה ואת שני הקצוות תפר הם מושחל דרך occluder. לאחר מכן, בשני הקצוות תפר מועברים דרך דופן החזה, קשורה ליצירת לולאה ויצא ברקמה התת עורית. לאחר סגירת החזה ההתאוששות למשך 5 ימים, בעכברים מורדמים שוב, עור החזה נפתח מחדש ומשקולות תלויים הם מחוברת לולאה תחת א.ק.ג. שליטה.

בסופו של פרוטוקול איסכמיה / reperfusion, לבבות ניתן מוכתם TTC של האוטםגודל הערכה או לעבור קיבעון זלוף לאפשר מחקרים morphometric בנוסף היסטולוגיה ו אימונוהיסטוכימיה.

Protocol

1. אינדוקציה של הרדמה

1. לזירוז עם isoflurane, הצב את העכבר לקופסה אינדוקציה אשר מחובר למערכת אדי% בנפח 3.0 וזרימת החמצן של 0.5 ליטר / דקה.
2. לאחר חוסר הכרה מושגת עם גירוי חוש המישוש אי לגרום התגובה רפלקס forelimb או hindlimb דוושת הנסיגה להיות נעדר, הצב את העכבר על השולחן טמפרטורה מבוקרת ההפעלה במצב שכיבה. לשמור על ההרדמה על קונוס האף המחובר אדי דרך תיבת אינדוקציה. להשען על ידי ראש לתקן את החותכות העליונות עם תפר 5-0 ניילון כדי להקל על אינטובציה.
3. הוספת בדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת הליבה טמפרטורת הגוף על 37 ° C. לתקן את הגפיים עם הקלטת. לחצות את הרגל השמאלית התחתונה על רגל ימין כדי לפתוח את בית החזה השמאלי ולחשוף את הלב טוב יותר.
4. למרוח את הקרם מקריח עד הצוואר והחזה השמאלי. לנגב את השמנת אחרי דקה 1. החל povidone-יוד לעור המקומיחיטוי. להזריק עצירות 0.05 מ"ג / ק"ג משקל גוף לשיכוך כאב מתחת לעור.
5. לעשות חתך בעור הצוואר קו האמצע עם מספריים קטנים. להקהות לנתח את בלוטות ושרירים שמכסים את קנה הנשימה. להפעיל את מכונת ההנשמה. הגדרות למאוורר יש להתאים את הפרמטרים הפיסיולוגיים. אנו משתמשים Minivent, הוגו זקס Elektronik, מנגנון הרווארד עם קצב הנשימה של 105/min ואת עוצמת הגאות של μl 200. משוך את הלשון עם מלקחיים כמה בעדינות להכניס צינורית 22 G מתכת. אשר אינטובציה על ידי ראיה ישירה של הצינור בתוך קנה הנשימה והתנועה החזה.
6. לעקוף את תיבת אינדוקציה על ידי מעבר לבזבז צינורות גז על מנת למנוע זיהום של שטח המעבדה. התאם אדי כרך 2.0%.

2. פתיחת בית החזה

1. לעשות חתך בעור בתור midclavicular שמאל. להקהות לנתח את הרקמה התת עורית כלפי השחי. זהה את הגבול של השריר שבית החזה הגדולות להקהות לנתח אותו עמ 'קלהectoralis השריר מתחת. משוך את שריר קטין שבית החזה מימין. תוכלו לקבל תצוגה ישירה של כלוב הצלעות.
2. לזהות באופן בוטה pentetrate החלל בין צלעי 4 עם מלקחיים מספר. בואו קצות מלקחיים את תוחלת רווח בין צלעי כדי לאפשר את עצמך כדי להוסיף את retractors אשר מותאמים עם גומיות המחוברים שולחן הניתוח. אתה צריך לקבל תצוגה ברורה של הלב, כולל אפרכסת שמאל. גישה זו מושגת בדרך כלל ללא כל אובדן הדם ולכן ללא צורך של קרישת חשמלי.

3. הכנה של הלב

1. משוך בעדינות את קרום הלב מבלי לפגוע בלב.
2. זהה את העורק השמאלי הקדמי היורד (LAD) על ידי הרמת את אפרכסת פרוזדורים השמאלי של הקיר הקדמי של החדר השמאלי. LAD יראו רק במהלך ישר קצר עם גבולות מטושטשים וצבע אדום בוהק לעומת הוורידים.

4. העורקים הכלילייםמכשור

1. הכן תפר 8-0 prolene עם קצה מחט קוני על ידי יצירת אותו בצורת U. להעביר את המחט דרך שריר הלב עמוק מספיק מתחת הנער.
2. לקטום את קצה המחט של תפר יש 1 ס"מ של תפר בכל צד.
3. לחתוך בסעיף 1 מ"מ PE-10 צינורות כמו occluder למנוע פינות חדות. אפשר occluder לטבול חיטוי אלכוהולי והקש על הערה לפני השימוש:. צינורות יש טבילה אתנול 100% במשך 24 שעות לחטא אותו כראוי ^4.
4. גם תפר חוט מסתיים דרך occluder.
5. השתמש בגודל 3 Kalt מחט תפר להנחות תפר בשני הקצוות מתוך שטח בין צלעי העליון.

5. החזה סגירה

1. לקשור את הצלע העליון והתחתון של רווח בין צלעי פתח יחד עם תפר 6-0 prolene. לפני שתסגור את החזה אתה צריך להמשיך 5.2.
2. Hyperinflate הריאות במשך כמה מחזורי נשימה כמה לפתוחעד atelectasis ידי לחיצה צינור הנשיפה. תרגיל זה יכול להיות גם תלוי בסוג של מכונת ההנשמה אתה משתמש. להגדיר את עוצמת הגאות כדי μl 300 עד החזה סגור.
3. להגדיר את עוצמת הגאות ההנשמה חזרה μl 200.
4. לקשור את שני הקצוות של תפר 8-0 קשירת LAD לקבל אותם יוצרים לולאה.
5. צרף אק"ג.
6. לחבר את המשקולות כדי לולאה 8-0 ולתת המשקולות בזהירות לתלות. אתה צריך לראות משמעותי ST-העלאת בתוך כמה פעימות לב. שחרר את המשקולות. הערה: בניסויים אלה משתמשים כולל של 5.5 גרם של משקל, אבל המשקל יכול להשתנות בהתאם המתח ואת משקל הגוף של עכברים.
7. מניחים את הלולאה בכיס תת עורית ולסגור את העור עם 6-0 קושר את התפרים בודדים.
8. בואו העכבר להתאושש לאחר האקסטובציה מתחת לפנס ההתחממות.

6. Reperfusion איסכמיה של שריר הלב

1. לאחר תקופת החלמה של לפחות 5 ימים לגרום הרדמה בתערובת של קטמין, xylazineאטרופין ו (4 מ"ל / ק"ג BW, קטמין 10 מ"ג / מ"ל, xylazine 2 מ"ג / מ"ל, אטרופין 0.06 מ"ג / מ"ל, ^1.
2. לצנרר ו לאוורר את החדר באוויר לניסויים איסכמיה ו reperfusion.
3. פתח את העור לצורך איחוי של החזה. הכן את הלולאה 8-0 תפר. צרף אק"ג.
4. לחבר את משקולות ולתת להם להסתובב. עקוב פרוטוקול איסכמיה שלך. צפה ECG לפיזור הפוטנציאל של העלאת-ST ^2.
5. לשחרר את משקולות בסוף איסכמיה. סגור את העור, extubate העכבר ולתת לו להתאושש.

7. הערכת גודל האוטם עם הזמן reperfusion עד 3 ימים

1. להרדים ו לצנרר העכבר בסוף הזמן reperfusion הרצוי.
2. חותכים את עור החזה של קו האמצע כדי xyphoid. פתח את הבטן וחותכים הסרעפת מתחת לכלוב הצלעות. חותכים את החזה פתוח משני צידי הקו midclavicular.
3. לתקן את הקיר נופף החזה הקדמי עם תפר כדי לקבל גישה בלא הפרעה ללב.
4. בזהירות להכין את הלולאה 8-0 תפר. לחתוך את הלולאה ולקשור קשר כדי לחסום LAD.
5. להזריק 10% phthalo כחול אל המבואה שמאל. כדי למנוע עומס נפח הלב, להזריק לצבוע לאט לשאוב מדי פעם.
6. מזריקים אשלגן כלורי אל המבואה שמאל. זה יהיה לעצור את הלב תרויח להערכת גודל האוטם שווה.
7. לחתוך את הלב, משאיר כמה שיותר רקמת extracardial ככל האפשר כדי להקל על חיתוך לב.
8. שטפו את הלב בתמיסת חיץ פוספט.
9. להקפיא את הלב בחנקן isopentane לנוזל. לחלופין, אפשר לשים לב למקפיא עד קפואה קל.
10. חותכים את פרוסות הלב של 1 מ"מ. יש לנו מכשיר חיתוך עשוי סכיני גילוח לחתוך את הלב פרוסות שוות (איור 4). ודא לב מיושר כראוי לחתוך בניצב לציר הארוך של הלב.
11. דגירה הפרוסות 1.5% TTC על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. אנו משתמשים בצלחת 96 גם שםכל פרוסה מוכנס לתוך 1 גם כן. זה יחסוך TTC ו לחסוך ממך את השימוש במסנן Whatman למנוע חפצים.
12. לתקן את פרוסות עם פורמלין 4% בין לילה. זה יכווץ את פרוסות אבל משפר את הניגוד של צבע.
13. לשים פרוסת בשקופית מיקרוסקופ. מכסים שקופית אחר. 1 השתמש מתכת מפרידי מ"מ בכל קצה של השקופית והחזק את השקופיות יחד עם מהדקי נייר.
14. קחו תמונה דיגיטלית משני הצדדים של כל פרוסה. תמיד להשתמש באותן הגדרות ולא להתמקד על פרוסות קטנות יותר.
15. השתמש תוכנה planimetry. אנו משתמשים ImageJ ידי NIH. תמיד להשתמש באותם קריטריונים של אזורי infarcted, בתחומים כגון: לבנים בלבד הם אוטם. אזורים לבנים ורדרדים לא אוטם. יש לנו עיוור חוקרים התערבויות ו planimetry גם כן.

8. הלב הכנה חלופי היסטולוגיה

1. בצע את שלבים 7.1 עד 7.2. והמשך 8.2. הערכה האוטם אמין עם כתמים TTC ניתן לעשות זאת בתוך 72 שעות של reperfusion בגלל התכווצות הצלקת.
2. הכן את כל רקמת extracardial ו להקהות לנתח את בלוטת התימוס המכסים את שורש האאורטה.
3. תפוס את אבי העורקים עולה עם מלקחיים את וחותכים את הלב עם רקמות כמו extracardiac פחות ככל האפשר.
4. לשטוף ולסחוט את הלב בעדינות פתרון cardioplegic.
5. מכניסים את הלב לתוך צלחת P35 מלא פתרון cardioplegic.
6. הכן את אבי העורקים העולה.
7. Cannulate אבי העורקים עולה עם צינורית אשר prefilled עם פורמלדהיד. אנו משתמשים אבץ פורמלין מקבע וקו 24 G ד ^3.
8. חותכים חור בין אפרכסת ימין ועל שמאל אטריום.
9. הכנס קטטר 26 G אל המבואה שמאל עם צינור ארוך 16 ס"מ קשור אליו. אתה יכול גם להשתמש בצינור PE50.
10. Perfuse הלב למשך עשר דקות עם מקבע פורמלין.
11. מכניסים את הלב לתוך צינור מלא מקבע לתקופה מקסימלית של 24 שעות על 7 ° C.
12. המשך הכנהaration עבור היסטולוגיה / אימונוהיסטוכימיה.

9. נציג תוצאות

עורקים כלילית כרונית קשירת היא טכניקה מורכבת עם מכשולים רבים. עם זאת, ברגע שהוא שולט בו ניתן לבצע עם שיעורי תמותה נמוכים מאוד והתוצאות מאוד אמין. מיקום אופטימאלי של עכברים וגישה לב הם בעלי חשיבות קריטית לזיהוי מכשור מוצלח של הנער. המיקום של קשירת יהיה ללא ספק להשפיע על גודל האוטם, וכן הוא מחייב להיות בעל אתר קשירת סטנדרטית. כמו כן, אם סניפים במחיצה הבין מושפעים זה יכול להוביל גוש צרור סניף במקום העלאת ST. דימום ורידים epimyocardial או החדר, אם קשירת הוא עמוק מדי, יכול להתרחש עכברים צריך ייכללו, אם הדימום הוא מוגזם. Pericard יש להסיר בשלמות ככל האפשר. השארת pericard להחמיר דוחף את המחט myocard של קשירת. כמו כן, זה יגרום פריקרדיטיס, בסופו של דברלגרום הידבקויות ויעשה בדיקה היסטולוגית קשה. PE-occluder צריך להיות קצר ככל האפשר, ללא פינות חדות כדי למזער את הטראומה myocard. אינפלציה של הריאות הוא חיוני לחלוטין כדי למנוע pneumothorax המתח לאחר סגירת החזה. אין צורך לניקוז חזה. בדיקה של מיקום נכון של קשירת בחזה פתוח על ידי משיכת קצות תפר צריך להיות מושמט, כי משיכת מתח קשה לשלוט. אם מכשור של הנער נכשל, ניסיונות נוספים יש להימנע כי זה יוסיף טראומה בצקת אל שריר הלב.

על מנת להשיג תוצאות מהימנות, פרמטרים פרוטוקול צריך להיות אחיד. לכן, עכברים הם מחובר לצינור מאוורר עם אוויר החדר טמפרטורת הגוף נשלטת באופן הדוק עם מערכת משוב. השימוש של משקולות תלויות כבר הדגיש כבר. מכשירים המושכים אחרים יש חסרון של אובדן מתח ולא סטנדרטית מתח מושך. איסכמיהפרוטוקולים לפני ואחרי postconditioning עם מחזורים רבים של reperfusion חסימה ו מתבצעות בקלות רבה יותר עם ​​משקולות תלוי כי הם פשוט צריכים להיות תלויים הרים ולתת (איור 1).

באזורים האוטם (לבן) צריך להיות להבחין מאזורים בסיכון (אדום) באזור הלא על הסיכונים (כחול) (איור 2 א ', ב'). האוטם גדלים תלויים משך איסכמיה. זמן reperfusion צריך להיות לפחות 2 שעות כדי לאפשר מוצלח מכתים TTC (איור 1, 2). והכי חשוב, ביטוי RNA ציטוקינים נמוכה אצל בעלי חיים הדמה החדשות המופעלים אשר היה כל הניתוחים, למעט איסכמיה ו reperfusion לעומת בעלי חיים אשר עברו אוטם שריר הלב (איור 3 א, ג).

באיור 1. גודל האוטם בשיעור של האזור בסיכון (IS /% AAR). העכברים עברו 30 דקות איסכמיה ואחריו 120 דקות של reperfusion (I / R, N = 10). IPC: postconditioning איסכמי, עכברים שעברו 30 דקות של איסכמיה ולאחריהם 3 מחזורים של reperfusion / חסימה 20 שניות כל אחד (n = 6, * מציין p <0.05).

איור 2 א. נציג TTC מוכתם פרוסת לב. לבן: אזור האוטם, אדום: אזור בסיכון, כחול: לא occluded באזור.

איור 2 ב. פרוסת נציג שטח (לבן) infarcted. שים לב כי בשל צורת חרוט של קרוב החדר השמאלי כדי איפקס, epimyocard יופיע כאזור המטוס אין לראות למדידת planimetric (ורוד / כחול באזור החיצוני). אדום = TTC מוכתם myocard בת קיימא.

איור 3 א. הבדל משמעותי שליocardial TNF-α-mRNA ביטוי לאחר איסכמיה 30 דקות ו 120 דקות reperfusion. n = 4-6 לכל קבוצה.

איור 3 ב. ביטוי שריר הלב IL-1β mRNA לאחר איסכמיה 30 דקות ו 120 דקות reperfusion (I / R). אין הבדל משמעותי בין הביקורת (ללא ניתוח) ואת דמה המופעל (ללא איסכמיה / reperfusion) בקבוצה. n = 4-6 לכל קבוצה, * מציין p <0.05.

איור 3 ג. שריר הלב IL-6 ביטוי mRNA לאחר איסכמיה 30 דקות ו 120 דקות reperfusion (I / R). אין הבדל משמעותי בין הביקורת (ללא ניתוח) ואת דמה המופעל (ללא איסכמיה / reperfusion) בקבוצה. n = 4-6 לכל קבוצה, * מציין p <0.05.

איור 4 א, ​​ג. שמעלא מכשיר חיתוך. : נסגר עם סכיני גילוח במצב חיתוך. ב ': פתוח, לצד תצוגה. C: נוף פתוח, הכניסה. הלב יהיה מיושר בחריץ המיטה פלסטיק לבן עם בניצב לציר הארוך שלה את סכיני גילוח (החץ).

Discussion

יש לנו מודל שונה Murine סגור החזה על ידי גישה הלב באמצעות פתיחת בית החזה השמאלי בין צלעי לרוחב והוביל את התפרים הבנאדם לחזה בקו midclavicular שמאל. לעזוב את בית החזה הגרמי שלם יהיה למזער טראומה, הצורך בתרופות כאב, זיהום באתר הניתוח ובכך, להקל על ההתאוששות. באמצעות שמירה על העורק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
אד	Drägerwerk AG	Isoflo
מיקרוסקופ	Leica	M80
מקור אור	שוט	KL 1500 LCD
שמיכה Homeothermic Control Unit	הרווארד Apparatus
סוג MiniVent 845	הוגו זקס Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6.5mm 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 מ"מ 9.3 3/8c
מחט Kalt תפר בגודל 3	FST	12050-03
Triphenyltetrazolium	סיגמא אולדריץ'	93145
Phthalo כחול	Heucotech בע"מ
PowerLab	ADInstruments