Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Resumen

El trauma quirúrgico induce una respuesta inflamatoria. Las citocinas y los ligandos endógenos se sabe que modulan el tamaño del infarto de miocardio después de la isquemia y la reperfusión. Se presenta una versión modificada de tórax cerrado, el modelo murino de isquemia y reperfusión con pesas colgantes para minimizar los efectos de la toracotomía.

Resumen

El trauma quirúrgico mediante toracotomía abierta en el pecho de los modelos de la ligadura coronaria induce una respuesta inmune que modifica diversos mecanismos implicados en la isquemia y la reperfusión. La respuesta inmune incluye la expresión de citoquinas y la liberación o la secreción de ligandos endógenos de los receptores inmunes innatas. La activación de la inmunidad innata potencialmente puede modular el tamaño del infarto. Hemos modificado una existente murino tórax cerrado, modelo de uso de pesas colgantes que pueden ser útiles para el estudio de miocardio previo y poscondicionamiento y el papel de la inmunidad innata en la isquemia y reperfusión miocárdica. Este modelo permite a los animales a recuperarse del trauma quirúrgico antes de la aparición de la isquemia miocárdica.

Los anestésicos volátiles han sido intensamente estudiados y su efecto de preacondicionamiento para la cardiopatía isquémica es bien conocida. Sin embargo, este efecto protector se opone a su uso en los modelos de tórax abierto de la ligadura de la arteria coronaria. Por lo tanto, otra ventaja podría ser el uso de THe anestésicos volátiles y controlables para la instrumentación de una enfermedad crónica a tórax cerrado el modelo, ya que su efecto de preacondicionamiento dura hasta 72 horas. Las enfermedades crónicas del corazón con isquemia intermitente y varios modelos afectados son otras posibles aplicaciones de este modelo.

Para la crónica a tórax cerrado el modelo, los ratones intubados y ventilados sometidos a una toracotomía lateral romo a través del cuarto espacio intercostal. Tras la identificación de la descendente anterior izquierda una ligadura se pasa por debajo de la embarcación y los dos extremos de la sutura se pasa a través de un dispositivo de oclusión. Entonces, ambos extremos de la sutura se pasa a través de la pared del pecho, anudado para formar un bucle y se deja en el tejido subcutáneo. Tras el cierre en el pecho y la recuperación por 5 días, los ratones se anestesiaron de nuevo, la piel del pecho se vuelve a abrir y los pesos que cuelgan están conectados al circuito bajo control ECG.

Al final del protocolo de isquemia / reperfusión, corazones pueden ser teñidas con TTC para infartotamaño de la evaluación o someterse a la fijación de la perfusión para permitir estudios morfométricos, además de la histología y la inmunohistoquímica.

Protocolo

1. La inducción de la anestesia

1. Para la inducción con isoflurano, colocar el ratón en una caja de inducción que está conectado al conjunto de vapor a 3,0% vol y el flujo de oxígeno de 0,5 l / min.
2. Después de pérdida del conocimiento se logra con estímulo táctil no para inducir una respuesta y el reflejo de la extremidad anterior o la extremidad posterior del pedal de retirada de estar ausente, coloque el cursor sobre una mesa de operaciones con control de temperatura en una posición de decúbito supino. Mantener la anestesia en un cono nasal que está conectado al vapor a través de la caja de inducción. Reclinar la cabeza mediante la fijación de los incisivos superiores con una sutura de nylon 5-0 para facilitar la intubación.
3. Inserte la sonda de temperatura rectal para mantener la temperatura corporal a 37 º C. Fijar los extremos con cinta adhesiva. Cruce la pierna izquierda sobre la pierna derecha para abrir la parte izquierda del pecho y exponer el corazón mejor.
4. Aplicar la crema depilatoria en el cuello y el pecho izquierdo. Limpie la crema después de 1 minuto. Aplicar povidona yodada para el local de la pieldesinfección. Inyectar la buprenorfina 0,05 mg / kg de peso corporal para aliviar el dolor por vía subcutánea.
5. Haga una incisión en el cuello la piel la línea media con una tijera pequeña. Blunt disección de las glándulas y los músculos que cubren la tráquea. Encienda el ventilador. Ajustes del ventilador se debe ajustar a los parámetros fisiológicos. Usamos una MiniVent, Hugo Sachs Elektronik, Aparatos Harvard con una frecuencia respiratoria de 105/min y un volumen corriente de 200 l. Tire de la lengua con una pinza y suavemente insertar un tubo de 22 G de metal. Confirmar la intubación por la visualización directa del interior del tubo de la tráquea y el movimiento del pecho.
6. Omitir el cuadro de la inducción por conmutación a los residuos tubería de gas para evitar la contaminación del espacio de laboratorio. Ajuste de vapor a 2,0% vol.

2. La toracotomía

1. Haga una incisión en la piel en la línea media clavicular izquierda. Blunt disecar el tejido subcutáneo hacia la axila. Identifique el borde del músculo pectoral mayor y mitigar diseccionar desde el p menorectoralis debajo del músculo. Tire del músculo pectoral menor a la derecha. Va a tener una visión directa de la caja torácica.
2. Identificar y sin rodeos pentetrate el cuarto espacio intercostal con unas pinzas. Que las puntas de las pinzas para cubrir el espacio intercostal, que te permita insertar los separadores que se ajustan con bandas de goma en la mesa de operaciones. Usted debe tener una visión clara del corazón incluyendo la aurícula izquierda. Este acceso se consigue normalmente sin ninguna pérdida de sangre y por lo tanto sin la necesidad de coagulación eléctrica.

3. Preparación del Corazón

1. Tire suavemente del pericardio sin lesionar el corazón.
2. Identifique la arteria descendente anterior izquierda (LAD) levantando el apéndice auricular izquierdo de la pared anterior del ventrículo izquierdo. LAD se verá solamente durante un corto curso recto con bordes borrosos y de color rojo brillante, en comparación con las venas.

4. Arterias CoronariasInstrumentación

1. Preparar una sutura de prolene 8-0 con una punta de la aguja cónica formando en una forma de U. Se pasa la aguja a través de la profundidad suficiente debajo de la DA miocardio.
2. Cortar el extremo de la aguja de la sutura a tener de 1 cm de sutura a cada lado.
3. Corte una sección de 1 mm de tubería de PE-10 como un oclusor la prevención de los ángulos agudos. Deje que el oclusor en remojo en alcohol y desinfección tocar a cabo antes de su uso. Nota: El tubo debe sumergirse en etanol al 100% durante 24 horas para esterilizar adecuadamente ^4.
4. Hilo de sutura tanto termina a través del oclusor.
5. Utilice un tamaño de 3 agujas de sutura Kalt para guiar tanto la sutura termina fuera del espacio intercostal superior.

5. El cierre en el pecho

1. Ate la costilla superior e inferior del espacio intercostal, abrió junto con una sutura de prolene 6-0. Antes de cerrar el pecho se debe proceder a 5,2.
2. Hyperinflate los pulmones durante unos cuantos ciclos para abrir las vías respiratoriasa atelectasia por la unión de la vía espiratoria. Esta maniobra también puede depender del tipo de ventilador que utiliza. Ajuste el volumen corriente de 300 l hasta que el pecho se cierra.
3. Ajuste la parte posterior del ventilador del volumen corriente de 200 l.
4. Ate ambos extremos de la sutura LAD 8-0 ligadura tenerlos formar un bucle.
5. Adjuntar un ECG.
6. Conecte los pesos al bucle 8-0 y dejar los pesos Cuelgue con cuidado. Usted debe ver una significativa elevación del segmento ST dentro de unos pocos latidos del corazón. Suelte el peso. Nota: Estos experimentos utilizar un total de 5,5 g de peso, pero el peso puede variar en función de la tensión y el peso corporal de los ratones.
7. Coloque el bucle en un bolsillo subcutáneo y cerrar la piel con 6-0 suturas solo nudo.
8. Que el ratón recuperarse después de la extubación por debajo de una lámpara de calentamiento.

6. Isquemia y reperfusión miocárdica

1. Después de un período de recuperación de al menos 5 días inducir la anestesia con una mezcla de ketamina, xilazinay atropina (4 ml / kg de peso corporal, la ketamina 10 mg / ml, xilazina 2 mg / ml, atropina 0,06 mg / ml, ^1.
2. Intubar y ventilar con aire de la habitación para los experimentos de isquemia y reperfusión.
3. Abrir la piel suturada del pecho. Preparar el lazo de sutura 8-0. Adjuntar un ECG.
4. Conecte los pesos y los dejó pasar. Siga el protocolo de isquemia. Ver ECG para la disolución potencial de elevación del ST ^2.
5. Soltar los pesos en el extremo de la isquemia. Cerca de la piel, retirar la intubación el ratón y dejar que se recuperen.

7. Evaluación del tamaño del infarto con el tiempo de reperfusión hasta 3 días

1. Se anestesia y la intubación con el ratón al final del tiempo de reperfusión deseado.
2. Cortar la piel del pecho en la línea media a la xifoides. Abra el abdomen y el diafragma de corte por debajo de la caja torácica. Cortar el pecho abierto en ambos lados de la línea media clavicular.
3. Fijar la pared anterior del tórax se agitaban con una sutura para obtener acceso sin obstáculos al corazón.
4. Prepare cuidadosamente el lazo de sutura 8-0. Cortar el circuito y haga un nudo para ocluir la DA.
5. Inyectar 10% ftalo azul en la aurícula izquierda. Para evitar la sobrecarga de volumen cardíaco, inyectar un tinte poco a poco y aspirar de vez en cuando.
6. Inyectar el cloruro de potasio en la aurícula izquierda. Esto detendrá el corazón en la diástole para la evaluación del mismo tamaño del infarto.
7. Cortar el corazón, dejando la mayor cantidad de tejido extracardíaca como sea posible para facilitar el corte del corazón.
8. Lavar el corazón en solución tampón de fosfato.
9. Congelar el corazón en nitrógeno líquido y isopentano. Alternativamente, los corazones se puede colocar en un congelador hasta que esté ligeramente congelado.
10. Cortar el corazón en rodajas de 1 mm. Tenemos un dispositivo rebanar hecha de hojas de afeitar para cortar el corazón en rebanadas iguales (Figura 4). Hacer que el corazón está alineado correctamente para cortar perpendicular al eje longitudinal del corazón.
11. Se incuban las rodajas de 1,5% TTC a 37 ° C durante 20 min. Utilizamos una placa de 96 pocillos, dondecada rodaja se pone en un bien. Esto ahorra TTC y de sobra que el uso de un filtro Whatman para evitar artefactos.
12. Fijar las rodajas con 4% de formaldehído durante la noche. Esto disminuirá los cortes, pero mejora el contraste de la tinta.
13. Ponga la rebanada en un portaobjetos de microscopio. Cubrir con otra diapositiva. Use espaciadores de 1 mm de metal en cada extremo de la corredera y mantener las diapositivas con clips.
14. Toma una imagen digital de ambos lados de cada rebanada. Siempre use la misma configuración y no acercarse a los segmentos más pequeños.
15. Utilice un software para la planimetría. Usamos ImageJ por el NIH. Utilice siempre los mismos criterios para las áreas infartadas, por ejemplo, sólo las áreas blancas son infartado. White zonas rosadas no infartado. Nos han cegado los investigadores para las intervenciones y planimetría así.

8. Preparación del Corazón alternativa para Histología

1. Siga los pasos 7.1 a 7.2. y proceder a 8,2. Evaluación fiable del infarto con la tinción de TTC se puede hacer dentro de los 72 horas de reperfusión debido a la contracción cicatriz.
2. Preparar fuera de cualquier tejido extracardíaca y mitigar diseccionar el timo que cubren la raíz aórtica.
3. Coge la aorta ascendente con las pinzas y cortar el corazón con el tejido como menos extracardíaco como sea posible.
4. Lave y escurra el corazón con cuidado en la solución de cardioplejía.
5. Ponga el corazón en un plato lleno de p35 cardioplejía.
6. Preparar la aorta ascendente.
7. Canular de la aorta ascendente con una cánula que se llena previamente con formaldehído. Nuestro método de zinc y un fijador de formol 24 G de la línea IV ^3.
8. Corte un agujero entre la aurícula izquierda y la aurícula izquierda.
9. Insertar un catéter 26 G en la aurícula izquierda con una tubería de 16 cm de largo unido a él. También puede utilizar un tubo de PE50.
10. La perfusión del corazón durante diez minutos con el fijador de formol.
11. Coloque el corazón en un tubo lleno con un fijador para un máximo de 24 horas a 7 ° C.
12. Continuar con la preparaciónparación para la histología / inmunohistoquímica.

9. Los resultados representativos

La ligadura de la arteria coronaria crónica es una técnica compleja, con múltiples dificultades. Sin embargo, una vez que se domina se puede realizar con las tasas de mortalidad muy bajos y los resultados altamente fiables. El posicionamiento óptimo de los ratones y el acceso al corazón son cruciales para la identificación e instrumentación exitosa de la DA. La posición de la ligadura, obviamente, influirá en el tamaño del infarto, lo que requiere tener un sitio de ligación estándar. Además, si se ven afectados ramas septales que esto podría conducir a un bloqueo de rama en lugar de elevación del segmento ST. Sangrado de las venas o epimyocardial del ventrículo, si la ligadura es demasiado profundo, puede ocurrir y los ratones deben ser excluidos si el sangrado es excesivo. Pericard debe ser removido tan completamente como sea posible. Saliendo de la Pericard agravará empujar la aguja en el myocard para la ligadura. Además, hará que la pericarditis, eventualmenteinducir adherencias y hará un examen histológico difícil. El PE-oclusor debe ser tan corto como sea posible sin esquinas afiladas para minimizar el trauma myocard. La hiperinflación de los pulmones es absolutamente crucial para prevenir el neumotórax a tensión tras el cierre en el pecho. No hay necesidad de un drenaje torácico. Pruebas de una posición correcta de la ligadura en el pecho abierto tirando de los extremos de la sutura debe ser omitido porque la tensión de extracción es difícil de controlar. Si la instrumentación de la DA no, nuevos intentos se debe evitar, ya que esto agrega un traumatismo y edema en el miocardio.

Con el fin de obtener resultados confiables, los parámetros del protocolo debe ser estandarizado. Por lo tanto, los ratones se intubó y se ventilan con aire ambiente y la temperatura del cuerpo está estrechamente controlada con un sistema de retroalimentación. El uso de pesas que cuelgan ya se ha subrayado. Otros dispositivos de tracción tienen la desventaja de la pérdida de tensión y no normalizada la tensión de tracción. Isquémicaprotocolos pre y poscondicionamiento con múltiples ciclos de reperfusión y la oclusión son más fáciles de realizar con colgar pesos, ya que sólo tiene que ser levantado y dejar colgado (Figura 1).

Áreas de infarto (blanco) debe ser distinguible de las zonas de riesgo (rojo) y el área no expuesta a riesgos (azul) (Figura 2A-B). Infarto tamaños dependen de la duración de la isquemia. Tiempo de reperfusión debe ser por lo menos 2 horas para permitir que el éxito tinción TTC (Figura 1 y 2). Lo más importante, la expresión del ARN de citoquinas es baja en animales operación simulada que tenían todos los procedimientos quirúrgicos, excepto la isquemia y reperfusión en comparación con los animales que se sometieron a un infarto de miocardio (Figura 3A-C).

Figura 1. El tamaño del infarto en el porcentaje de área de riesgo (ES /% AAR). Los ratones fueron sometidos 30 minutos de isquemia seguido de un20 minutos de reperfusión (I / R, n = 10). IPC: poscondicionamiento isquémico, los ratones fueron sometidos a 30 minutos de isquemia seguidos de 3 ciclos de reperfusión / oclusión de 20 segundos cada uno (n = 6, * indica p <0,05).

Figura 2A. Representante TTC manchado de corte corazón. Blanco: área de infarto, Rojo: zona de riesgo, Azul: no ocluido área.

Figura 2B. Rebanada de Representante de un infarto (blanca). Nótese que, debido a la forma cónica de la estrecha ventrículo izquierdo hasta el vértice, la epimyocard aparecerá como área plana y no deben ser considerados para la medición planimétrica (rosa / azul zona exterior). Rojo = TTC manchado myocard viable.

La figura 3A. Ninguna diferencia significativa en miTNF-α ocardial la expresión de mRNA después de 30 minutos de isquemia reperfusión y 120 minutos. n = 4-6 por grupo.

Figura 3B. IL-1β miocardio expresión de mRNA después de 30 minutos de isquemia reperfusión y 120 minutos (I / R). No hay diferencias significativas entre el control (sin cirugía) y el simulacro de accionamiento (sin isquemia / reperfusión) del grupo. n = 4-6 por grupo, * indica p <0,05.

Figura 3C. Miocardio IL-6, la expresión de mRNA después de 30 minutos de isquemia reperfusión y 120 minutos (I / R). No hay diferencias significativas entre el control (sin cirugía) y el simulacro de accionamiento (sin isquemia / reperfusión) del grupo. n = 4-6 por grupo, * indica p <0,05.

Figura 4A-C. Escuchat dispositivo de corte. R: cerrado con hojas de afeitar en posición de corte. B: vista abierta, lado. C: vista abierta, frontal. Corazón se alinean en la ranura de la cama de plástico blanco con su eje longitudinal perpendicular a las hojas de afeitar (flecha).

Discusión

Hemos modificado un ratón modelo de tórax cerrado, mediante el acceso al corazón a través de una toracotomía intercostal izquierda lateral y que lleva a cabo las suturas LAD en el pecho en la línea media clavicular izquierda. Saliendo de la caja torácica ósea intacta a minimizar el trauma, la necesidad de medicamentos para el dolor, infección del sitio quirúrgico y, por tanto, facilitar la recuperación. Al preservar la arteria izquierda mamífero interno no hay necesidad de electrocauterio. Salimos del bucle ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Vapor	Drägerwerk AG	Isoflo
Microscopio	Leica	M80
Fuente de luz	Schott	KL 1500 LCD
Manta homeotérmicos Unidad de Control	Aparato de Harvard
MiniVent Tipo 845	Hugo Sachs Elektronik
8-0 Prolene	Ethicon	BV130-5 6,5 3/8c
6-0 Prolene	Ethicon	BV-1 9,3 mm 3/8c
Sutura Kalt ag tamaño 3	FST	12050-03
Trifeniltetrazolio	Sigma Aldrich	93145
Phthalo azul	Heucotech LTD
PowerLab	ADInstruments